邱苗苗 何紅云 鄧儀昊**

（1）昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500；2）昆明理工大學(xué)附屬安寧市第一人民醫(yī)院，昆明 650500）

缺血性腦卒中是導(dǎo)致人類死亡和永久性殘疾的主要原因，多由心源性血栓、腦部小血管閉塞和影響腦部血液循環(huán)的動(dòng)脈粥樣硬化引起，導(dǎo)致腦組織供血減少，進(jìn)而導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)氧氣和營養(yǎng)素嚴(yán)重不足，引發(fā)一系列級聯(lián)性病理損傷［1］，包括血腦屏障功能障礙［2］、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、Ca2+超載、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等［3］。在這些致病因素作用下，自噬可被不同程度地激活，通過控制細(xì)胞內(nèi)成分的清除和再利用來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，利于細(xì)胞存活［4］。

自噬是一種高度保守的溶酶體依賴性細(xì)胞代謝途徑，可降解和回收錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、陳舊胞質(zhì)組分和損傷細(xì)胞器［5］。自噬流常被人們用來衡量自噬體隨機(jī)或選擇性地募集細(xì)胞質(zhì)成分，并通過細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將自噬底物運(yùn)送至溶酶體進(jìn)行降解這個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)過程的活性［6-7］。而上述過程中的任意一個(gè)步驟發(fā)生紊亂都會(huì)引發(fā)自噬流障礙［8］。在眾多細(xì)胞中，神經(jīng)元又高度依賴自噬途徑以清除代謝產(chǎn)物并及時(shí)更新?lián)p傷細(xì)胞器維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［9］。因此，缺血性腦卒中后保持自噬流通暢對提高神經(jīng)元存活顯得尤為重要。

自噬進(jìn)程中，溶酶體通過與成熟自噬體的外膜融合，釋放酸性水解酶來降解自噬體內(nèi)容物，從而達(dá)到循環(huán)利用細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)和代謝中間體的目的［10］。而當(dāng)細(xì)胞持續(xù)性遭受病理因素刺激時(shí)，溶酶體水解產(chǎn)物的釋放又能通過多種途徑抑制自噬，導(dǎo)致自噬流障礙尤其是自噬體-溶酶體融合障礙［11］。故本文擬闡述缺血性腦卒中后由自噬流障礙引發(fā)的神經(jīng)元損傷機(jī)制、自噬體-溶酶體融合障礙的致病機(jī)理，以及基于該融合障礙機(jī)理挽救自噬神經(jīng)元可采取的可能措施，由此尋求減輕神經(jīng)損傷的途徑和有效的治療線索。

1 缺血性腦卒中后自噬流障礙導(dǎo)致神經(jīng)元損傷

作為一種細(xì)胞在壓力刺激下的應(yīng)激保護(hù)機(jī)制，自噬涉及雙膜囊泡吞噬細(xì)胞質(zhì)成分、細(xì)胞自噬體形成、自噬體-溶酶體融合、自噬溶酶體降解4個(gè)步驟。上述4個(gè)步驟發(fā)生任何問題都會(huì)導(dǎo)致自噬流發(fā)生障礙［12］。新近研究表明，腦缺血后哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian targets of rapamycin，mTOR）/Unc-51樣自噬激活激酶1（Unc-51-like autophagy-activating kinase 1，ULK1）通路被激活，導(dǎo)致自噬激活受阻，引發(fā)自噬流障礙［13-14］。腦缺血后自噬體的形成也會(huì)被抑制，導(dǎo)致底物積累，引起神經(jīng)元受損［15-16］。當(dāng)自噬體-溶酶體融合發(fā)生障礙后，自噬體的積累將加劇腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷［17］。另有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元中組織蛋白酶D蛋白水平和活性還會(huì)隨腦缺血后的病理進(jìn)程逐漸下降，轉(zhuǎn)錄因子EB的核轉(zhuǎn)位也會(huì)被抑制，引發(fā)溶酶體功能缺陷，導(dǎo)致底物堆積，嚴(yán)重時(shí)引起細(xì)胞凋亡［13，18］。近期研究還指出，腦缺血后引發(fā)的溶酶體功能失衡會(huì)導(dǎo)致自噬溶酶體堆積，進(jìn)而加重缺血性損傷［19］。由此可見，自噬進(jìn)程中的任意一步發(fā)生紊亂都會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的自噬流障礙，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，加速缺血性腦卒中的病理進(jìn)程。

2 自噬體-溶酶體融合障礙是引發(fā)神經(jīng)元損傷的重要原因

自噬體-溶酶體融合是自噬進(jìn)程中的限速步驟，也是保證自噬體高效代謝的關(guān)鍵。所以，當(dāng)融合發(fā)生障礙時(shí)將引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷。研究表明，腦缺血后出現(xiàn)嚴(yán)重的自噬體-溶酶體融合障礙，導(dǎo)致自噬體、溶酶體異常堆積［20］，破壞神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，加重缺血性損傷［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，融合發(fā)生障礙后導(dǎo)致受損細(xì)胞器清除不足，進(jìn)而加劇神經(jīng)元氧化應(yīng)激［21］，還會(huì)造成炎癥小體過度激活，加重炎癥反應(yīng)［22］。此外，融合障礙加劇Ca2+超載現(xiàn)象，導(dǎo)致一系列Ca2+依賴性酶被過度激活，使細(xì)胞內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)過分水解，最終導(dǎo)致神經(jīng)元因興奮性毒性死亡［23］。另有研究表明，腦缺血后融合障礙誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白積累從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而應(yīng)激發(fā)生后又會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放大量Ca2+，Ca2+在線粒體中積累進(jìn)而破壞線粒體膜，導(dǎo)致產(chǎn)生過多的活性氧，最終觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及氧化應(yīng)激依賴性細(xì)胞凋亡［24-25］。由于融合障礙引發(fā)上述嚴(yán)重后果，故下文繼續(xù)探究缺血性腦卒中后自噬體-溶酶體融合具體機(jī)制以及針對機(jī)制進(jìn)行調(diào)控的研究進(jìn)展，以期找到緩解神經(jīng)損傷的新思路。

3 自噬體-溶酶體的融合機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，參與介導(dǎo)融合過程的關(guān)鍵蛋白質(zhì)屬于以下3個(gè)家族：可溶性NSF附著蛋白受體（soluble NSF attachment protein receptor，SNARE）、銜接蛋白和小GTP酶Rab7［26］（圖1）。

3.1 SNARE介導(dǎo)自噬體-溶酶體融合的機(jī)制

SNARE是介導(dǎo)自噬體-溶酶體融合的關(guān)鍵因子［17］。在哺乳動(dòng)物中主要通過突觸融合蛋白17（syntaxin17，STX17）-膜突觸相關(guān)蛋白29（synaptosome associated protein 29，SNAP29）-囊泡相關(guān)膜蛋白8（vesicle-associated membrane protein 8，VAMP8）SNARE復(fù)合物來介導(dǎo)融合［27］。

在神經(jīng)元自噬過程中，STX17主要定位于自噬體，VAMP8主要定位于溶酶體，它們從胞質(zhì)中招募SNAP29，組裝成STX17-SNAP29-VAMP8反式SNARE復(fù)合物，來調(diào)控自噬體-溶酶體融合［25，28-29］。其中，STX17的招募與微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）有關(guān)［30］，目前，在腦缺血/再灌后的研究中觀察到STX17和LC3之間共定位減少現(xiàn)象，也恰好證明了兩種因子的互作［31］。并且，抑制腦缺血/再 灌 后 相 關(guān)mRNA（LC3、STX17、VAMP8、SNAP29）的轉(zhuǎn)錄水平，也會(huì)造成神經(jīng)元自噬流障礙［32］，由于STX17等SNARE蛋白是典型的參與自噬體-溶酶體融合的關(guān)鍵因子，因此可以合理推測，腦缺血后神經(jīng)元的自噬流障礙很大一部分原因是由于自噬體-溶酶體融合障礙，并且STX17等SNARE蛋白在其中發(fā)揮了重要作用。而新近研究也發(fā)現(xiàn)，STX17在腦缺血后自噬體-溶酶體融合過程中發(fā)揮重要作用［33］。還有研究通過誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元中STX17的敲低，使自噬體-溶酶體融合發(fā)生嚴(yán)重障礙［9］。而一項(xiàng)針對帕金森病的研究發(fā)現(xiàn)，敲除神經(jīng)元中的SNAP29，會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的自噬體-溶酶體融合障礙［34］。此外，在再灌后12 h，由于SNAP29持續(xù)減少，皮層神經(jīng)元會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的自噬流障礙［35］，其具體機(jī)制可能也與自噬體-溶酶體融合障礙有關(guān)。

Fig. 1 The possible fusion mechanism of neuronal autophagy with lysosome after ischemic stroke圖1 缺血性卒中后神經(jīng)元自噬體-溶酶體融合的可能機(jī)制

3.2 銜接蛋白介導(dǎo)自噬體-溶酶體融合的機(jī)制

銜接蛋白是介導(dǎo)自噬體-溶酶體融合的另一種關(guān)鍵因子，以往研究發(fā)現(xiàn)銜接蛋白中的同型融合和蛋白質(zhì)分類復(fù)合體（homotypic fusionand protein transport，HOPS）對于大部分融合事件都是必不可少的［10］，因此，HOPS也被視為自噬體-溶酶體融合的關(guān)鍵紐帶。在哺乳動(dòng)物中，還發(fā)現(xiàn)了另外兩種銜接蛋白Atg14、EPG-5［36-37］。其中，Atg14通過與STX17結(jié)合參與自噬體-溶酶體融合，并穩(wěn)定SNARE復(fù)合體［38］。有研究在再灌后的神經(jīng)元中觀察到Atg14和LC3之間共定位減少現(xiàn)象，這其中的具體機(jī)制可能與Atg14銜接功能受損以及Atg14與SNARE復(fù)合物互作減弱，使自噬體-溶酶體融合發(fā)生障礙有關(guān)［31］。而EPG-5則通過與Rab7和LC3結(jié)合被招募到SNARE復(fù)合物中，從而促進(jìn)SNARE復(fù)合物組裝和自噬體-溶酶體融合［37］。新近研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血/再灌后EPG5的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著降低［39］，其具體作用機(jī)制可能也與自噬體-溶酶體融合障礙及向溶酶體的貨物輸送受損有關(guān)。在神經(jīng)元中，HOPS可能通過STX17被招募到自噬體，進(jìn)而促進(jìn)自噬體-溶酶體融合［40］，并且HOPS的亞基Vps33A還會(huì)促進(jìn)SNARE復(fù)合物的組裝，防止其解體，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)自噬體-溶酶體融合的發(fā)生［28］。還有研究在敲除HOPS復(fù)合體亞基Vps33A、Vps16或Vps39后發(fā)現(xiàn)自噬流發(fā)生障礙，自噬體積累現(xiàn)象嚴(yán)重［41］。此外，紫外線輻射抗性相關(guān)基因蛋白（UV radiation resistance-associated gene，UVRAG）也可以通過與自噬體相互作用來招募HOPS，以促進(jìn)融合發(fā)生［25，42］。而新近研究也發(fā)現(xiàn)，在短暫性全腦缺血模型（transient global cerebral ischemia，tGCI）中，UVRAG的缺乏會(huì)破壞Vps16和Rab7之間的相互作用，阻止自噬體-溶酶體融合并最終導(dǎo)致神經(jīng)受損［17］，但是這其中是否涉及HOPS募集的減弱還需進(jìn)一步探究。

3.3 Rab7介導(dǎo)自噬體-溶酶體融合的機(jī)制

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中還有多種小GTP酶參與介導(dǎo)自噬體-溶酶體融合，其中Rab7被視為介導(dǎo)自噬體-溶酶體融合的關(guān)鍵參與者［10］。在神經(jīng)元自噬過程中Rab7主要定位在自噬體和溶酶體上［43］，自噬體以Rab7鳥嘌呤核苷酸交換因子復(fù)合物依賴的方式募集并激活Rab7，參與自噬體-溶酶體融合［44］。而Rab7可以通過與多種馬達(dá)接頭蛋白（RILP（Rab7-interacting lysosomal protein）、PLEKHM1（pleckstrin homology and RUN domain containing M1））結(jié)合來調(diào)控自噬體、溶酶體沿微管運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)融合發(fā)生［45］。在溶酶體上，Rab7通過招募其效應(yīng)子PLEKHM1和RILP分別與HOPS亞基Vps39和Vps41結(jié)合，來促進(jìn)自噬體-溶酶體融合［46-47］。而目前研究表明，腦缺血后Rab7主要行使促進(jìn)自噬體成熟的功能［17］，但也有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元應(yīng)激期間，通過增加Rab7與RILP的相互作用，可以恢復(fù)自噬流，減輕神經(jīng)元損傷［48］，其主要機(jī)制可能與自噬體-溶酶體共定位后融合增強(qiáng)有關(guān)。腦缺血后Rab7與自噬體-溶酶體融合之間的準(zhǔn)確關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

綜上，采取多種方法調(diào)控融合事件，減輕自噬流障礙，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用就顯得尤為重要。

4 神經(jīng)元自噬流障礙調(diào)控及靶標(biāo)研究

近年來，越來越多人關(guān)注自噬流障礙在缺血性腦卒中發(fā)生后的作用機(jī)制，尤其是自噬體-溶酶體融合障礙。故許多研究以其為治療靶點(diǎn)，尋求減輕神經(jīng)損傷的途徑和有效的治療線索，以期緩解乃至治愈相關(guān)疾病。

4.1 調(diào)控SNARE減輕自噬流障礙

通過調(diào)控SNARE可以減輕自噬流障礙，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。研究表明，海藻糖可以減輕自噬流障礙并減少神經(jīng)元中的蛋白質(zhì)聚集，從而在多種神經(jīng)退行性疾病中產(chǎn)生保護(hù)作用［49］，有研究在缺血/再灌后利用海藻糖來調(diào)控自噬流障礙，發(fā)現(xiàn)其能在一定程度上挽救由STX17敲除引起的自噬體-溶酶體融合障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕神經(jīng)元損傷［33］。還有研究通過引入外源STX17改善受損的自噬流，顯著逆轉(zhuǎn)自噬體-溶酶體融合缺陷，增加溶酶體與馬達(dá)蛋白的結(jié)合，減輕海馬神經(jīng)元損傷［9，50］。

而一項(xiàng)針對阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的研究表明，早老蛋白1磷酸化后，通過膜聯(lián)蛋白A2與VAMP8相互作用，并且促進(jìn)VAMP8與自噬體SNARE結(jié)合，從而調(diào)節(jié)自噬體-溶酶體融合［51］，這也為通過調(diào)控VAMP8來輔助治療缺血性腦卒中提供了新思路。

還有研究通過阻斷超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道來干擾SNAP29的募集進(jìn)而顯著逆轉(zhuǎn)氯喹對自噬體-溶酶體融合的抑制，促進(jìn)自噬-溶酶體降解，誘導(dǎo)腦卒中后的神經(jīng)保護(hù)作用［52-53］。另有研究發(fā)現(xiàn)，SNAP29的O-連接β-N-乙酰氨基葡萄糖（O-linked β-N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修飾對自噬體-溶酶體之間的SNARE依賴性融合具有負(fù)調(diào)節(jié)作用［54］。因此，通過基因編輯等手段，敲除O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶或突變SNAP29的O-GlcNAc位點(diǎn)可能起到促進(jìn)自噬體-溶酶體融合的作用。

此外，通過調(diào)控mTOR也可以間接減輕自噬體-溶酶體融合障礙。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR連續(xù)再激活造成再灌后神經(jīng)元中的自噬流障礙，抑制自噬體形成、STX17錨定和自噬溶酶體降解［31］，還會(huì)抑制再灌后與融合相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄水平，造成神經(jīng)元自噬流障礙［32］，因此，未來可以此為靶點(diǎn)，通過抑制mTOR磷酸化減輕自噬流障礙情況，這可能為減少腦缺血/再灌注損傷提供內(nèi)源性干預(yù)策略。

4.2 調(diào)控銜接蛋白減輕自噬流障礙

提高銜接蛋白的招募與表達(dá)可以恢復(fù)自噬流，減輕神經(jīng)元損傷。有研究通過誘導(dǎo)UVRAG過表達(dá)減輕細(xì)胞和小鼠模型中的自噬流障礙，抑制神經(jīng)元壞死［55］，其機(jī)制可能與HOPS的招募障礙有關(guān)。另一項(xiàng)針對大鼠tGCI的研究表明，缺氧預(yù)處理通過介導(dǎo)UVRAG-Vps16相互作用，可以顯著逆轉(zhuǎn)氯喹對自噬溶酶體形成的抑制，進(jìn)而促進(jìn)自噬體-溶酶體融合，引起對全腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用［17］。新近研究則通過薯蕷皂苷元治療，提高大鼠再灌后Rab7效應(yīng)因子EPG5的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)由自噬體-溶酶體融合障礙引起的自噬損傷，并促進(jìn)自噬溶酶體形成［39］。還在小鼠腦缺血/再灌的體內(nèi)模型中，蛋白激酶Cγ的表達(dá)異常升高使得LC3和Atg14之間共定位減少，發(fā)生自噬流障礙［31］，這可能與Atg14的銜接功能受損有關(guān)，這也為間接調(diào)控Atg14促進(jìn)自噬體-溶酶體融合提供了可能。新近研究則通過增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化后Atg14的表達(dá)，促進(jìn)自噬體-溶酶體融合，減緩病變、解除炎癥［56］。該研究也為調(diào)控Atg14促進(jìn)腦缺血后自噬體-溶酶體融合、減輕神經(jīng)損傷提供了方向。

4.3 調(diào)控Rab7蛋白減輕自噬流障礙

關(guān)于通過調(diào)控Rab7來減輕自噬流障礙的研究較少，有研究通過間歇性禁食，提高再灌后Rab7的表達(dá)，減輕自噬流障礙，其具體機(jī)制可能與調(diào)控自噬體-溶酶體融合有關(guān)［57］。此外，姜黃素可以增加與Rab7相互作用的RILP表達(dá)，解決自噬體積累問題，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［58］。還有研究通過增強(qiáng)Rab7和馬達(dá)接頭蛋白之間的相互作用，從而促進(jìn)自噬溶酶體形成恢復(fù)自噬流［59］。這也為未來調(diào)控缺血性腦卒中后自噬流障礙提供了線索。

4.4 其他方法減輕自噬流障礙

另外還有幾項(xiàng)減輕自噬流障礙的方法。例如，神經(jīng)突蛋白是一種營養(yǎng)因子，因其促進(jìn)突觸生長、軸突再生和神經(jīng)元存活的能力而得名。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)突蛋白可以促進(jìn)再灌后的自噬激活，增加自噬體-溶酶體融合，但具體機(jī)制未明［6］。假人參皂甙F11通過減輕大鼠腦缺血后的自噬體-溶酶體融合障礙，顯著減少梗塞體積、腦水腫、神經(jīng)功能缺損和皮質(zhì)神經(jīng)元死亡，但這其中是否涉及上述介導(dǎo)融合的幾個(gè)關(guān)鍵因子還需進(jìn)一步探究［60］。此外，豐富環(huán)境處理會(huì)顯著增強(qiáng)再灌后溶酶體相關(guān)膜蛋白活性，減輕神經(jīng)功能缺損和神經(jīng)元死亡，促進(jìn)自噬體-溶酶體融合［61-62］。未來還需進(jìn)一步研究其促進(jìn)融合的潛在機(jī)制。

5 前景與展望

本文詳細(xì)闡述缺血性腦卒中發(fā)生后引起的自噬流障礙及其嚴(yán)重后果，特別聚焦于自噬體-溶酶體融合障礙機(jī)制以及其作為調(diào)控靶點(diǎn)的研究進(jìn)展。但因其與胞內(nèi)多種因子、多種信號通路相互調(diào)節(jié)、交互作用，未來還需要對缺血性腦卒中后的自噬流障礙進(jìn)行更全面、更準(zhǔn)確的探究，尤其是自噬體-溶酶體融合障礙的具體機(jī)制、發(fā)生的具體時(shí)間、引發(fā)的具體后果，以期發(fā)現(xiàn)更廣泛的選擇性試劑和治療靶點(diǎn)來調(diào)控自噬流，減輕缺血性腦卒中所致的損傷。當(dāng)然，缺血性腦卒中發(fā)生后，損傷不僅僅局限于單個(gè)神經(jīng)元，其所處的神經(jīng)血管單元亦會(huì)受到較大影響，而其中的具體機(jī)理與自噬流障礙是否相關(guān)以及如何相關(guān)，仍需進(jìn)一步探究。在研究腦缺血病理機(jī)制時(shí)，應(yīng)更加關(guān)注神經(jīng)元與微血管之間結(jié)構(gòu)和功能的密切聯(lián)系，以及它們對腦缺血的協(xié)同損傷效應(yīng)，由此探尋維持神經(jīng)-血管單元結(jié)構(gòu)和功能完整性的方法。