楊冬冬，劉穎，曹曉東，張楠，張子英※，馬麗杰※

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學新藥安全評價研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學慢性病分子流行病實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子均為陰性的一種惡性程度最高的乳腺癌亞型，約占所有乳腺癌的15%~20%[1]。TNBC具有發(fā)病年齡小、侵襲性強、轉(zhuǎn)移潛能高和預后差等特征[2]，在臨床治療中，由于缺乏明確的治療靶點，對內(nèi)分泌和治療不敏感，手術(shù)和化療仍然是主要治療手段[3]。

山慈菇（Cremastra appendicutata,CR AP）為蘭科植物杜鵑蘭、獨蒜蘭和云南獨蒜蘭的干燥假鱗莖[4]，山慈菇味甘、微辛，性涼，是具有清熱解毒、化痰散結(jié)的傳統(tǒng)中藥，是臨床上的抗腫瘤藥物[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)[6]其可以通過影響腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡和干擾細胞侵襲遷移等發(fā)揮抗乳腺癌作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學通過篩選藥物、疾病靶點，構(gòu)建生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)圖，揭示中藥多成分、多靶點、多途徑的作用關(guān)系，這與中醫(yī)強調(diào)系統(tǒng)觀、整體觀相符[7,8]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學，篩選山慈菇治療TNBC的活性化合物、作用靶點及相關(guān)通路，并通過細胞實驗驗測可靠性，以期為后續(xù)研究TNBC發(fā)生、發(fā)展進程中的分子機制及尋找臨床山慈菇的潛在靶點提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

山慈菇（批號：17122501，內(nèi)蒙古暮昕藥業(yè)）；4T1乳腺癌細胞株（中國科學院細胞庫）；PBS（批號：AC10260538，Hyclone公司）、DMEM培養(yǎng)基（批號：S118024，Gibco公司）、0.25% Trypsin-EDTA（批號：2046777，Gibco公司）；胎牛血清（批號：11G313，ExCell Bio公司）；Penicillin-Streptomycin（批號：51H351，Ex-Cell Bio公司）；PI3K多克隆抗體（批號：AF6241，Affinity公司）、磷酸化PI3K（p-PI3K）多克隆抗體（批號：AF3241，Affinity公司）、Akt多克隆抗體（批號：AF4718，Affinity公司）、p-Akt多克隆抗體（批號：AF6241，Affinity公司）、-actin（批號：ab8227，abcam公司）、羊抗兔二抗（批號：ab97051，abcam公司）。

1.2 山慈菇酯提物的制備

將4 kg的山慈菇加4倍無水乙醇回流提取，揮去乙醇，形成不溶于水的膠體，乙酸乙酯萃取3次，低溫烘干，待用。取125 mg Cremastra appendicutata，加入0.5 mL DMSO助溶，加生理鹽水定容至10 mL，配制12.5 mg/mL母液，過濾，4℃保存[9]。

1.3 山慈菇活性成分和靶點的預測

本研究通過運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP,ttp：//tcmspw.com/tcmsp.php），以O(shè)B＞30%和DL≥0.18篩選山慈菇活性化學成分，并查詢作用靶點；通過中國知網(wǎng)、Pubmed數(shù)據(jù)庫搜索文獻補充山慈菇抗腫瘤的相關(guān)活性成分，并在SwissADME平臺（http://www.swissadme.ch/）進行篩選，篩選條件是藥代動力學中胃腸吸收（GI absorption）為High，之后使用Swiss Target Prediction平臺預測其靶點，通過使用UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org） 將靶點規(guī)范為統(tǒng)一對應基因，將活性成分和作用靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建山慈菇 活性成分 作用靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 疾病相關(guān)基因檢索

以“triple negative breast cancer”為檢索詞在OMIM（https://omim.org/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫進行檢索，兩者合并后得到靶基因，使用UniProt數(shù)據(jù)庫疾病靶點進行校正統(tǒng)一。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將山慈菇和乳腺癌靶點輸入Venny 2.1中得到交集靶點，并導入String（http：//string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫中，進行蛋白質(zhì)相互作用分析，將結(jié)果保存為TSV格式文件。使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將節(jié)點與degree值大小關(guān)聯(lián)，節(jié)點越大degree值越大。

1.6 GO富集和KEGG通路富集分析

將1.3中篩選出的山慈菇抗乳腺癌的交集靶點基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.ncifcrf.gov/），選擇GO富集和KEGG通路富集分析，設(shè)置閾值P＜0.05，并用OmicShare tool（shttp：//www.omicshare.com/tools/）繪圖軟件可視化。

1.7 分子對接

選取PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點進行分子對接驗證。在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中檢索山慈菇的活性成分的3D結(jié)構(gòu)，在RCSB PBD（https：//www1.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵蛋白，使用Autodock tools 1.5.6軟件進行分子對接，其結(jié)果以結(jié)合自由能的高低作為活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合的程度評價標準。通?；钚晕镔|(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定能量越低，發(fā)生作用的可能性越大，對接結(jié)果越可靠。

1.8 Western blot檢測4T1細胞AKT/PI3K通路蛋白表達

將4T1細胞貼壁培養(yǎng)12 h后，根據(jù)課題組前期研究[8]設(shè)置空白組和山慈菇酯提物低、中、高劑量組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用PBS洗凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，每瓶加300L的蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測蛋白濃度并計算蛋白上樣量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜，一抗孵育4℃過夜，TBST洗滌3次，5 min/次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，5 min/次，ECL顯色后進行凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 山慈菇的活性成分及作用靶點

在TCMSP數(shù)據(jù)庫和中國知網(wǎng)上檢索相關(guān)山慈菇抗腫瘤的文獻并經(jīng)過篩選后得到12種成分，將12種活性成分利用TCMSP和Swiss TargetPrediction平臺預測靶點，合并后共得到340個。如圖1所示，通過cytoscape 3.7.2軟件得到山慈菇活性成分作用靶點的網(wǎng)絡(luò)圖。紅色菱形代表山慈菇，粉色圓形代表山慈菇活性成分，藍色方形代表作用靶點，共有364個靶點，652條邊，代表山慈菇成分與靶點的相互作用。

表1 山慈菇活性化合物成分Table 1 Active compounds of Cremastra appendicutata

圖1 山慈菇化學成分作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Active compound network of Cremastra appendicutata

2.2 山慈菇抗三陰性乳腺癌候選靶基因的篩選

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索三陰性乳腺癌，取Score＞5得到766個靶點；OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到487個靶基因，兩者合并后得到1 235個靶基因。與山慈菇靶點進行匹配，用Venn圖形式體現(xiàn)，得到97個交集靶點，見圖2。

圖2 山慈菇和三陰性乳腺癌映射核心靶點Fig.2 Intersection gene of Cremastra appendicutata and triple negative breast cancer target

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將97個交集靶點代入String數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，限定物種為Human，獲取核心靶點蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系，通過cytoscape軟件可視化，根據(jù)Degree值對網(wǎng)絡(luò)進行分析，結(jié)果見圖3。節(jié)點表示蛋白，邊代表蛋白之間關(guān)聯(lián)，節(jié)點越大顏色越深說明該點的Degree值越高。圖中共有88個節(jié)點521條邊，平均節(jié)點度為11.8。從圖可知degree排名前10的靶點有HSP90AA1、EGFR、MAPK1、JUN、PIK3CA、CCND1、TNF和ESR1等。

圖3 核心靶點蛋白質(zhì)互作圖Fig.3 Protein-protein core interaction network diagram

2.4 GO和KEGG富集分析

為了說明中藥化合物的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用，采用DAVID對交集靶點進行基因本體（GO）分析，以P＜0.05篩選顯著富集前10個條目。如圖4所示，在生物學過程（biological process,BP）中涉及調(diào)控細胞的增殖、凋亡、遷移和蛋白質(zhì)磷酸化過程等；在細胞成分（cellular component,CC）涉及了細胞核、核質(zhì)、細胞質(zhì)及線粒體膜等；在分子功能（molecular function,MF）主要涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。

圖4 核心靶點GO分析Fig.4 Core target GO analysis

KEGG通路富集分析共得到109條富集分析結(jié)果，以P＜0.05選取山慈菇治療乳腺癌潛在治療靶點的前20條富集結(jié)果（見圖5和圖6），主要涉及到膀胱癌、非小細胞肺癌和胰腺癌等多條癌癥相關(guān)通路，PI3K-Akt信號通路，Ras信號通路等，構(gòu)建關(guān)鍵成分靶點通路圖，從圖中發(fā)現(xiàn)前10條通路與41個靶點有著密切的關(guān)系。其中12種活性成分、40個靶點作用于癌癥通路，有12種成分的27個靶點作用于PI3KAkt信號通路，提示山慈菇可能通過不同成分與多個靶點相互結(jié)合，調(diào)控不同信號通路發(fā)揮治療乳腺癌的作用。

圖5 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

圖6 “成分靶點通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 The“components targets pathways”network diagram

2.5 分子對接

為了進一步明確山慈菇治療乳腺癌的關(guān)鍵靶標與活性成分之間的結(jié)合效能，選取山慈菇前4個活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中前5個核心靶點進行分子對接，當結(jié)合能＜0 kJ/mol時，認為分子蛋白質(zhì)能自發(fā)結(jié)合，當結(jié)合能＜5 kJ/mol時，認為分子蛋白質(zhì)具有較好的結(jié)合性，且結(jié)合能越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定。如圖7所示，2-methoxy-9，10-dihydrophenanthrene-4，5-diol，與JUN受體蛋白中氨基酸殘基DA-37、DA-6有兩個氫鍵聯(lián)系；與MAPK受體蛋白中GLN-103、ASP-104有3個氫鍵聯(lián)系；與HSP90AA1受體蛋白中氨基酸殘基LYS209、GLN-212、PHE-213有4個氫鍵聯(lián)系。表2結(jié)果顯示4個化合物與5個靶點均能穩(wěn)定結(jié)合，提示山慈菇活性成分與上述靶點之間的相互作用可能為山慈菇治療乳腺癌的機制之一。2.6山慈菇酯提物對4T1細胞AKT/PI3K通路蛋白表達

表2 山慈菇核心有效成分分子對接結(jié)果Table 2 Molecular docking results of core active ingredients of Cremastra appendicutata

由圖8可知，山慈菇酯提物作用于乳腺癌細胞24 h后，與空白組相比，12.5g/mL和125g/mL的CR AP能顯著降低AKT的磷酸化水平，1 250g/mL的CR AP能顯著降低PI3K和AKT的磷酸化的表達水平（P＜0.05）。

圖8 各組細胞PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白Western blot電泳圖Fig.8 Western blot analysis of PI3K,p-PI3K,AKT and p-AKT proteins in each group of cells

3 討論

山慈菇始載于我國唐代《本草拾遺》，是臨床上常用的抗癌中藥?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)山慈菇具有抑制乳腺癌細胞增殖、誘導細胞凋亡和延緩細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力[14,15]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，篩選出山慈菇11個抗腫瘤活性成分主要包括甾體類、二氫菲類、聯(lián)芐類和芳香酯類等。-谷甾醇廣泛存在于各種植物中，研究發(fā)現(xiàn)[16]-谷甾醇可以通過干擾多種細胞信號通路發(fā)揮抗乳腺癌的特性。Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)-谷甾醇可抑制MCF-7和MDA-MB-231兩種人乳腺癌細胞增殖，并通過抑制PI3K-AKT/mTOR通路活化而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。Attanzio等[18]發(fā)現(xiàn)-谷甾醇抑制細胞乳腺癌活性，并介導線粒體凋亡途徑促進細胞發(fā)生凋亡。豆甾醇具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎癥等特點[19]。Hyocheol等[20]發(fā)現(xiàn)豆甾醇能上調(diào)卵巢癌中促凋亡bax和Caspase-3等蛋白表達促使癌細胞凋亡，并通過下調(diào)MMP9等蛋白抑制癌細胞轉(zhuǎn)移。本研究通過查詢數(shù)據(jù)庫和文獻搜索發(fā)現(xiàn)山慈菇成分以菲類、二氫菲類居多，李小平[13]研究發(fā)現(xiàn)二氫菲類化合物是杜鵑蘭的主要成分，對腫瘤細胞具有較強的殺傷作用，提示這可能是山慈菇治療乳腺癌的重要成分。

本研究通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析獲得山慈菇治療TNBC的關(guān)鍵靶蛋白，并通過分子對接技術(shù)預測關(guān)鍵靶蛋白HSP90AA1、MAPK1、EGFR和PI3K3CA與山慈菇活性成分間的對接良好。熱休克蛋白（Heat shock protein 90 alpha family class A,HSP90AA1）編碼癌癥伴侶蛋白HSP90，HSP90通過刺激生成腫瘤組織的新生血管，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的免疫應答，影響細胞的增殖與分化[21]。HSP90在乳腺癌患者血液中高表達，可作為TNBC患者預后不良的指標[22]。絲裂原激酶蛋白激酶1（Mitogen activated protein kinase 1,MAPK1）是MAPK信號通路的重要樞紐，與細胞增殖、分化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生命活動有關(guān)[23]。MAPK的表達與TNBC的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，研究表明激活MAPK可抑制TNBC細胞的侵襲遷移[24]。表皮生長因子受體（Epidermal growth facter receptor,EGFR）是酪氨酸激酶1型受體家族成員之一，調(diào)控細胞的生長。研究表明EGFR蛋白在TNBC中呈現(xiàn)過表達，陽性率高達30%~52%[25]，與野生型EGFR相比，突變型EGFR可明顯增加PI3K和AKT的活化水平，激活PI3K/AKT/MTOR通路[26]。磷脂酰肌醇激酶3催化亞基（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide gene,PI3K3CA）是一種致癌基因，編碼PI3K的P110亞基，該基因在很多腫瘤處于異常激活狀態(tài)，大約40%的乳腺癌患者存在PIK3CA表達上調(diào)和頻繁突變，從而導致P110過度激活[27]，HU等[28]發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因突變可以促進乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖，抑制凋亡，并激活PI3K/ATK/MTOR信號通路從而增加腫瘤細胞對化療的耐藥性。

GO富集和KEGG分析關(guān)鍵靶點蛋白，發(fā)現(xiàn)山慈菇活性成分的靶點可能通過Pathways in cancer、PI3K/AKT信號通路發(fā)揮調(diào)控細胞增殖、凋亡等生物過程。PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路是細胞內(nèi)重要的信號通路，該通路的異常激活可使腫瘤細胞過度增殖、抑制細胞凋亡導致腫瘤發(fā)生[29]，還可以促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[30,31]。PI3K蛋白家族是催化肌醇基團磷酸化的蛋白激酶，是信號轉(zhuǎn)導通路中的重要成分，能被受體（RTK）激活，而活化的PI3K蛋白家族將磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），進一步激活下游信號因子AKT，促進AKT磷酸化[32]，從而發(fā)揮相應的生物學功能。

在TNBC的發(fā)生發(fā)展過程中頻繁發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號通路的過度激活[33]，這或許與TNBC的侵襲轉(zhuǎn)移性強、預后差的臨床特點密切相關(guān)，抑制該通路激活可成為TNBC新的治療方向。因此為了進一步驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學預測結(jié)果，結(jié)合本課題組前期發(fā)現(xiàn)山慈菇抑制鼠源TNBC 4T1細胞增殖促進其凋亡[8]，本研究采用Western blot方法驗證了山慈菇是否通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路影響4T1細胞增殖、凋亡，結(jié)果顯示高濃度的山慈菇干預4T1細胞24 h后，4T1細胞中p-PI3K、p-AKT的蛋白水平明顯降低，提示山慈菇通過抑制PI3K/AKT信號通路磷酸化，進而抑制該通路的活化，影響4T1的增殖和凋亡。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接方法預測了山慈菇有效活性成分、關(guān)鍵靶點和作用機制，可為山慈菇治療三陰性乳腺癌的臨床應用及深入研發(fā)提供依據(jù)。