張凱寧，劉涵，朱秋媚，富銳麗，劉玉林，孫瑞欣，劉景會，趙競男，韓雪容

1.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130000；2.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司細(xì)胞因子室，吉林 長春 130000

人生長激素（human growth hormone，hGH）是一種由人腦垂體前葉的嗜酸性細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)類激素，含有191個(gè)氨基酸分子，相對分子質(zhì)量為22 000，編碼GH的基因位于17號染色體上，總長度約6.5萬個(gè)堿基。本研究使用的重組人生長激素-Fc 融合蛋白（rhGH-Fc）采用IgG4的Fc 段通過一段柔性多肽與rhGH 相連接，并采用S228P 突變防止IgG4 解離成半分子，同時(shí)也可抑制Fab-臂交換現(xiàn)象來增強(qiáng)穩(wěn)定性，采用V308P 突變增強(qiáng)與FcRn 的親和力延長半衰期。N-糖基化的修飾位點(diǎn)為Asn-X-Ser／Thr（其中X為除了Pro 以外的任意氨基酸），當(dāng)?shù)鞍最愃幬锖蠳-糖基化修飾位點(diǎn)時(shí)，在蛋白轉(zhuǎn)錄后翻譯便會進(jìn)行糖基化修飾。人IgG分子的重鏈Asn297為N-糖基化修飾位點(diǎn)，抗體分子的N-糖基化修飾與其他蛋白相似，由一個(gè)預(yù)裝配好的Glc3Man9GlcNAc2 寡糖鏈通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（oligosaccharyltransferase，OST）從焦磷酸長醇糖脂載體（dolichol-ohosphate lipid，DoI-P-P）轉(zhuǎn)移到IgG重鏈的Asn297上，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)α-葡糖糖苷酶Ⅰ、α-葡糖糖苷酶Ⅱ（α-glucosidaseⅠ／Ⅱ）以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)α-甘露糖苷酶修飾形成Man8GlcNAc2，轉(zhuǎn)移到高爾基體順面的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（cis-golgi network，CGN）后，另外3 個(gè)甘露糖被高爾基體甘露糖苷酶切掉，形成1 個(gè)Man5GlcNAc2。進(jìn)入高爾基體中間膜囊（medial gdgi）后，N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（N-acetylglucosaminyltransferase-Ⅰ，GnTⅠ）就會介導(dǎo)Glc-NAc 從 UDP-GlcNAc 轉(zhuǎn)移到 Man5GlcNAc2 寡糖鏈的α-1-3 分支上，再從α-1-6 分支上切除2 個(gè)甘露糖殘基，就得到了GlcNAcMan3GlcNAc2，轉(zhuǎn)移至高爾基體反面的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（trans golginetwork，TGN）之前再經(jīng)GnTⅡ作用下，將GlcNAc從UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)移到Man-5GlcNAc2 寡糖鏈的α-1-6 分支上，形成GlcNAc2Man 3GlcNAc2保守雙天線結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)移至TGN后，通過特定的單糖轉(zhuǎn)移酶，在糖鏈上加入Gal、GlcNAc、唾液酸（NANA或NGNA），從而形成不同的N-糖基化修飾［1-2］。

通過降低G0F 含量與提高G2F 含量，理論上可降低高甘露糖修飾，提高唾液酸修飾（主要糖型一般為G0、G1和G2，F(xiàn)為巖藻糖）。此需求常見的添加物為半乳糖、尿苷、錳離子，其中半乳糖和尿苷可為糖基化修飾提供原料，而錳離子可提高酶的活性，均可使糖基化修飾正向進(jìn)行。由于修改糖基化修飾時(shí)需對培養(yǎng)基成分做出改變，可能會影響細(xì)胞正常代謝。本研究采用市售已有一定經(jīng)驗(yàn)的商業(yè)化培養(yǎng)基添加至原補(bǔ)料培養(yǎng)基中進(jìn)行糖基化修飾調(diào)整。為了減少目的蛋白中高甘露糖修飾的含量，采用3 種補(bǔ)料方式對目的蛋白糖基化修飾進(jìn)行優(yōu)化，以獲得更優(yōu)的糖基化比例及更低含量的高甘露糖。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 rhGh-Fc 工程細(xì)胞由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司細(xì)胞因子室構(gòu)建，所用CHO-K1 工程細(xì)胞株為比洋生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2 主要試劑 ActiPro、Cell Boost 7a和Cell Boost 7b購自美國Hyclone公司；SHEFF-CHO PLUS PF ACF購自美國Kerry公司；EX-CELL Glycosylation Adjust購自德國Merck公司；EfficientFeed C+AGT Supplement&GlycanTune C+Total Feed購自美國Gibco公司；Glyco WorksRapiFluor-MS N-糖分析試劑盒和色譜柱ACQUITY UPLC?Glycan BEH Amide，130 ?（1.7 μm，2.1 mm ×150 mm）購自美國Waters公司。

1.3 細(xì)胞復(fù)蘇 提前向Actipro 培養(yǎng)基中加入0.5%（v／v）體積的抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑，取20 mL培養(yǎng)基于75 cm2方瓶中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)溫30 min 備用。從液氮罐中取出1 支工作細(xì)胞，于37 ℃水浴鍋中迅速融化，將細(xì)胞懸液加入預(yù)先預(yù)溫的培養(yǎng)基中，混勻后置37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞種子液制備 取40 mL 培養(yǎng)基于125 mL 搖瓶中，置37 ℃，5% CO2搖床中預(yù)溫30 min 備用。將方瓶中培養(yǎng)24 h 的細(xì)胞液全部轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，112 ×g離心10 min，棄上清，取6 mL 預(yù)溫好的培養(yǎng)基復(fù)溶細(xì)胞沉淀，復(fù)溶后將全部培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至125 mL 搖瓶中，混勻后置37 ℃，5% CO2搖床中培養(yǎng)24 h。取 120 mL 培養(yǎng)基于 500 mL 搖瓶中，置 37 ℃，5%CO2搖床中預(yù)溫30 min備用。將搖瓶中培養(yǎng)24 h的細(xì)胞液全部轉(zhuǎn)移至500 mL 搖瓶中，此后每天取樣，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，待細(xì)胞密度達(dá)2×106個(gè)／mL時(shí)，同樣方法分至2 個(gè)搖瓶中。待4 個(gè)搖瓶中細(xì)胞密度達(dá) 2 × 106個(gè)／mL 時(shí)，按 3 × 105個(gè)／mL 的密度接種至生物反應(yīng)器中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 7 L生物反應(yīng)器培養(yǎng) 生物反應(yīng)器滅菌后，待反應(yīng)器罐體溫度降至40 ℃以下，向罐體中泵入50%（v／v）體積最大工作體積Actipro培養(yǎng)基，通氣設(shè)置為0.02 vvm。待溶氧電極極化完畢后，進(jìn)行溶氧參數(shù)校正并設(shè)置反應(yīng)器操作參數(shù)：轉(zhuǎn)速、溫度、pH、溶解氧、通氣速率。待參數(shù)穩(wěn)定后，接種細(xì)胞開始培養(yǎng)，第3 天后開始取樣、計(jì)數(shù)、測定生化代謝參數(shù)以及滲透壓。并于第3 天后開始每天補(bǔ)加不同補(bǔ)料培養(yǎng)基，至培養(yǎng)液葡萄糖終濃度為4 g／L，對目的蛋白糖基化修飾進(jìn)行優(yōu)化（第1種糖基化修飾方案為Gly-1：采用原有的補(bǔ)料培養(yǎng)基Cell Boost 7a&7b 基礎(chǔ)上添加EX-CELL Glycosylation Adjust 培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中不含葡萄糖，含半乳糖及尿苷，其他成分未知；第2 種糖基化修飾方案為Gly-2：采用原有的補(bǔ)料培養(yǎng)基Cell Boost 7a&7b 基礎(chǔ)上添加 SHEFF-CHO PLUS PG ACF 培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中不含葡萄糖，含促生長因子，其他成分未知；第3 種糖基化修飾方案為Gly-3：采用EfficientFeed C + AGT Supplement& GlycanTune C + Total Feed補(bǔ)料培養(yǎng)基，兩種培養(yǎng)基均含葡萄糖22.3 g／L，含半乳糖及尿苷，其他成分未知），以只添加原有補(bǔ)料培養(yǎng)基Cell Boost 7a&7b 作為空白對照組（STD）。當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)（1.2 ～ 1.5）× 107個(gè)／mL 時(shí)進(jìn)行降溫培養(yǎng)，7 d 后離心收獲上清。糖基化修飾各批次培養(yǎng)條件見表1。

表1 糖基化修飾各批次培養(yǎng)條件Tab.1 Culture conditions for each batch of glycosylation modification

1.6 rhGH-Fc蛋白純化 將收獲后的培養(yǎng)液112×g離心10 min后收集上清液，再繼續(xù)7 155×g離心20 min后收集上清液，使用1 mol／L 醋酸鈉溶液調(diào)整pH至 4.50 ～ 5.00，15 min 后7 155 ×g離心30 min，使用1 mol／L Tris溶液調(diào)整pH至7.40左右。使用0.45 μm濾膜過濾澄清留用。用0.2 mol／L NaOH溶液（2 CV）對耐堿Protein A親和層析柱進(jìn)行預(yù)處理，再用2 mol／L NaCl 溶液走至基線平穩(wěn)，換成預(yù)冷注射用水走至基線平穩(wěn)，更換平衡液（50 mmol／L Tris+150 mmol／L NaCl溶液，pH 7.40）走至基線平穩(wěn)后進(jìn)行紫外調(diào)零。將平衡液更換為澄清后的樣品，樣品全部上完后更換為平衡液繼續(xù)走10 CV。將平衡液更換為淋洗液（100 mmol／L Gly + 1 mol／L 尿素溶液）進(jìn)行淋洗。淋洗完畢后更換為洗脫液（100 mmol／L Gly-HCl 溶液，pH 3.40）進(jìn)行洗脫，收集蛋白時(shí)使用1 mol／L Tris 溶液立即調(diào)整pH 至中性范圍。洗脫完畢后，使用0.2 mol／L NaOH 溶液（2 CV）對Protein A 親和層析柱進(jìn)行處理，再使用2 mol／L NaCl 溶液走至基線平穩(wěn)，換成pH 7.0 的PB 溶液保存 Protein A 親和層析柱。

1.7 糖基化修飾檢測

1.7.1 樣品前處理 使用Glyco Works RapiFluor-MS N-糖分析試劑盒對樣品進(jìn)行前處理。

1.7.2 樣品檢測

1.7.2.1 色譜條件色 譜柱：ACQUITY UPLC?Glycan BEH Amide，130 ?（1.7 μm，2.1 mm × 150 mm）；流動(dòng)相A：50 mmol／L甲酸銨溶液（pH 4.4）；流動(dòng)相B：100%乙腈；上樣量：10 μL；流速：0.25 mL／min；FLR檢測波長EX 265／EM 425 nm。洗脫方法見表2。

表2 糖基化檢測洗脫方法Tab.2 Elution method of glycosylation detection

1.7.2.2 質(zhì)譜條件 MS 模式采集數(shù)據(jù)；毛細(xì)管電壓：2 000 V；Cone 電壓：40 V；去溶劑氣體溫度：300 ℃；源溫：100 ℃；去溶劑氣體流速：800 L／h，掃描范圍（m／z）：500 ～ 2 000，采集時(shí)間0 ～ 55 min。

2 結(jié)果

2.1 代謝過程產(chǎn)物檢測結(jié)果 Gly-1、Gly-3 最大細(xì)胞數(shù)較STD 培養(yǎng)時(shí)略低，約為1.7 × 107個(gè)／mL，其中Gly-3補(bǔ)料流加體積較STD培養(yǎng)時(shí)多65%左右，Gly-1、Gly-2與STD補(bǔ)料流加體積基本一致。

Gly-2 開始補(bǔ)料后細(xì)胞數(shù)不再增多，約為1.0 ×107個(gè)／mL，整體生長曲線與STD 基本一致。Gly-1、Gly-3 補(bǔ)料時(shí)含半乳糖，使乳酸在補(bǔ)料后開始消耗，整個(gè)培養(yǎng)周期均處于較低水平，Gly-2 補(bǔ)料后乳酸開始上升，但始終處于正常范圍內(nèi)。Gly-1、Gly-2 是在原補(bǔ)料基礎(chǔ)上額外添加小體積培養(yǎng)基，整體滲透壓變化水平與STD 一致，Gly-3 由于采用不同的補(bǔ)料培養(yǎng)基，該補(bǔ)料培養(yǎng)基滲透壓較原培養(yǎng)基低，且補(bǔ)料流加體積增多，整個(gè)培養(yǎng)周期滲透壓均處于290 ～350 mOsm／kg。3 種補(bǔ)料方案的銨離子變化曲線與STD基本一致。見圖1。

圖1 3批代謝過程產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of metabolic process products in three batches

2.2 蛋白純化結(jié)果 Gly-1、Gly-2、Gly-3 批次純化后蛋白濃度分別為0.61、0.66 和0.72 g／L。

2.3 糖基化檢測結(jié)果 經(jīng)檢測，Gly-1、Gly-2、Gly-3的G0F 分別為32.89%、58.66%、33.28%，G1F 分別為31.39%、18.03%、34.90%，G2F分別為31.39%、18.03%、34.90%，Gly-1 與Gly-3 使目的蛋白含有更少的G0F及更多的G2F。3 種補(bǔ)料方式的糖基化FLR 譜圖見圖2。

圖2 3批糖基化FLR譜圖Fig.2 FLR spectra of glycosylation in three batches

Gly-1、Gly-2、Gly-3 的具體糖基化修飾類型見表3，其中Gly-3 補(bǔ)料方案在高甘露糖修飾方面較其他兩種方案更少，可進(jìn)一步研究。研究結(jié)果表明，高甘露糖修飾含量Gly-3相對較低，達(dá)4.23%。

表3 各批次糖基化修飾類型（%）Tab.3 Glycosylation modification types of each batch（%）

3 討論

人用藥品注冊技術(shù)國際協(xié)調(diào)會議（International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）Q5E 和Q6B 中對糖的控制有如下描述：對于糖蛋白，應(yīng)測定其糖含量（中性糖、氨基糖和唾液酸），另外，需盡可能地分析糖鏈結(jié)構(gòu)、寡糖譜（天線類型）及糖基化位點(diǎn)。美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的“治療性蛋白免疫原性評價(jià)行業(yè)指南”和歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）2007 年發(fā)表的單抗各論中均對糖分析有所要求，其中單抗各論中描述“應(yīng)對糖型進(jìn)行表征，尤其應(yīng)關(guān)注甘露糖化、半乳糖化、巖藻糖化和唾液酸化，應(yīng)測定所存在的主要糖型（一般為G0、G1 和G2）”。《中國藥典》三部（2020 版）“人用重組DNA 技術(shù)產(chǎn)品總論”中理化特性分析部分的“糖基化修飾”中要求對糖基化修飾進(jìn)行全面的分析和確定，如糖基化修飾與制品半衰期和生物學(xué)活性相關(guān)，則應(yīng)確定糖的含量（中性糖、氨基糖和唾液酸）。糖型的結(jié)構(gòu)可能與不良反應(yīng)相關(guān)（如非人類的糖型結(jié)構(gòu)或其殘基），應(yīng)盡可能對糖鏈的結(jié)構(gòu)、糖型以及多肽鏈的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行深入分析［3］。甘露糖基化（mannose，Man）可與甘露糖受體結(jié)合促進(jìn)蛋白在體內(nèi)快速清除，導(dǎo)致半衰期縮短，促進(jìn)與FcγRⅢa 的結(jié)合，提高抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）活性［4-5］，抑制與C1q的結(jié)合，降低補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性（complement-dependentcytotoxicity，CDC）活性［6-7］。巖藻糖基化（fucose，F(xiàn)uc）抑制與 FcγRⅢa 的結(jié)合，降低 ADCC 活性，通過去Fuc可顯著提高ADCC活性［8-9］。半乳糖基化（galactose，Gal）暴露可能會加速蛋白的清除，促進(jìn)CDC 活性［10-11］。N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）可促進(jìn)與FcγRⅢa的結(jié)合，提高ADCC 活性，還可加速蛋白的清除［12-14］。NANA 唾液酸修飾可顯著降低蛋白的清除作用，延長半衰期，還具有抗炎作用，NGNA 唾液酸修飾可抑制與FcγRⅢa 的結(jié)合，降低ADCC 活性［15-17］。蛋白多糖的糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）部分蛋白糖基化和合成是不固定的，不同生物體、不同細(xì)胞類型、甚至不同的培養(yǎng)條件均會產(chǎn)生顯著的異質(zhì)性。CHO細(xì)胞系為所有嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系中與人的糖基化修飾相似度最高的，但仍會產(chǎn)生如Gal-α-1、3-Gal、Neu5Gc這樣具有免疫原性的糖基化修飾。而且CHO細(xì)胞本身缺乏α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（α-2，6-SiaT）、β-1，4-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶（β-1，4-N-acetylg-lucosaminyltransferase，GnT-Ⅲ），無法在糖鏈末端添加α-2，6-唾液酸與β-1，4-N-乙酰葡糖胺［18］。蛋白類常見的N-糖基化修飾見圖3［19］；CHO細(xì)胞中的糖基化修飾途徑見圖4［20］。

圖3 治療性蛋白藥物的主要N-糖基化修飾類型Fig.3 Major N-glycosylation modification types of therape-utic protein drugs

圖4 CHO細(xì)胞的糖基化修飾Fig.4 Glycosylation modificationin CHO cells

糖基化修飾本身也是酶促反應(yīng)，通過改變對應(yīng)的底物濃度或相關(guān)酶的活性，可在一定程度上控制蛋白的糖基化修飾。不同的蛋白類藥物對糖基化的需求不同，可通過改變不同的糖基化類型改善ADCC、CDC活性，延長藥物半衰期［21］。本研究中表達(dá)的蛋白rhGH-Fc為長效化GH，本身并不依靠ADCC、CDC活性發(fā)揮效用，因此采用了本身ADCC活性、CDC活性低的IgG4 作為結(jié)合蛋白，在糖基化的選擇上也不需要ADCC、CDC，因此將延長半衰期作為本研究糖基化調(diào)整的目的。將高甘露糖修飾比例降低為所有具有Fc片段的藥物的共識，雖然其他糖基化類型也被報(bào)道可能影響藥物半衰期，但高甘露糖修飾對藥物半衰期的影響遠(yuǎn)超其他糖基化類型的修飾，在藥物開發(fā)時(shí)作為重點(diǎn)糖基化修飾類型關(guān)注。雖然唾液酸修飾可延長藥物半衰期，但由于CHO細(xì)胞宿主本身表達(dá)蛋白時(shí)唾液酸修飾水平低，對藥物半衰期影響有限。與其他兩個(gè)方案相比，Gly-3 方案細(xì)胞整體糖基化修飾獲得了更少的G0F與更多的G2F，rhGH-Fc高甘露糖修飾含量降至4%左右，唾液酸修飾水平仍較低，為1%左右。

綜上所述，通過對目的蛋白糖基化修飾的類型及含量分析可知，EfficientFeed C+AGT Supplement&GlycanTune C+Total Feed 培養(yǎng)基對于改善目的蛋白糖基化修飾可能具有更好的效果，本研究對于CHOK1表達(dá)rhGH-Fc融合蛋白工藝的優(yōu)化以及后期糖基化修飾的分析提供了參考。