高效液相色譜法測(cè)定果蔬中松脂酸銅殘留

王美然，張瓊尹，陳博鈺，吳瓊，張新春，韓丙軍*

1(海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?，570228)2(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(熱帶果蔬質(zhì)量與安全)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?，571101)3(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口，571101)

松脂酸銅(copper abietate)是以松香為原料，添加無(wú)機(jī)銅、有機(jī)酸及催化劑等多種試劑制備的一種具廣譜殺菌性的含銅類農(nóng)藥，作為新型銅制劑殺菌劑，具有高效低毒、兼顧預(yù)防保護(hù)和治療等特性，可用于防治檳榔葉斑病[1]、杧果蒂腐病菌[2]、柑橘潰瘍病[3]、瓜類霜霉病、細(xì)菌性角斑病、火龍果炭疽病、潰瘍病等多種細(xì)菌和真菌引起的蔬菜病害，同時(shí)對(duì)蔬菜也有明顯的刺激生長(zhǎng)的作用，近年來(lái)在我國(guó)主要的蔬菜水果產(chǎn)區(qū)被廣泛應(yīng)用[4]。

松脂酸銅作為含銅類化合物，長(zhǎng)期過(guò)量攝入可引發(fā)系列疾病，食用蔬菜水果中含銅農(nóng)藥超標(biāo)而中毒的事件也有發(fā)生[5]，因此，迫切需要開(kāi)展松脂酸銅的殘留以及相關(guān)檢測(cè)方法的研究。目前關(guān)于松脂酸銅測(cè)定的方法主要有液相色譜法，其中楊德毅等[6]使用高效液相色譜法測(cè)定了柑橘中松脂酸銅殘留量，并開(kāi)展了不確定度分析，但是其對(duì)于松脂酸銅鹽酸衍生物的轉(zhuǎn)化過(guò)程未進(jìn)行分析。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道使用高效液相色譜法[7-8]測(cè)定松脂酸銅農(nóng)藥[9]，使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)食品[10]和跌打片[11]中松香酸進(jìn)行測(cè)定，但目前有關(guān)于松脂酸銅在作物中殘留檢測(cè)的相關(guān)研究仍未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以果蔬中火龍果、豇豆和杧果為主要研究對(duì)象，建立高效液相色譜法檢測(cè)果蔬中松脂酸銅農(nóng)藥殘留的方法，為在果蔬中準(zhǔn)確快速的農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

松脂酸銅標(biāo)準(zhǔn)品(純度95.0%)，山東禾宜生物科技有限公司；石油醚、甲醇、乙腈(色譜純)，美國(guó)Thermo Scientific公司；36.0%～38.0%鹽酸(優(yōu)級(jí)純)，廣州化學(xué)試劑廠；丙酮(優(yōu)級(jí)純)，美國(guó)Thermo Scientific公司；冰醋酸(純度99.5%)為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。本實(shí)驗(yàn)中所用試劑未經(jīng)說(shuō)明者均為分析純，所用水均為超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀-紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters 公司；Q-Exactive QE四極桿靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Scientific 公司；電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；水浴恒溫振蕩器，上海江星儀器有限公司；超聲清洗儀，昆山舒美超聲儀器有限公司；低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)海道夫公司；超純水儀，美國(guó)Milli-pore公司；渦旋振蕩器，美國(guó)Thermo公司；移液器，德國(guó)艾本德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品

田間采摘火龍果、豇豆和杧果樣品，根據(jù)GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)要求，分別取火龍果全果(去除葉冠部分)、豇豆全豆(帶莢)和杧果全果(去核)樣品，經(jīng)勻漿機(jī)制備后，按照四分法進(jìn)行縮分，在-20 ℃保存，供實(shí)驗(yàn)使用。

火龍果、豇豆和杧果樣品，均購(gòu)自?？诒镜厥袌?chǎng)或采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心試驗(yàn)基地。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用天平精確稱量松脂酸銅標(biāo)準(zhǔn)品10 mg至10 mL容量瓶中，選擇有機(jī)溶劑甲醇定容，得到質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL松脂酸銅單標(biāo)儲(chǔ)備液，避光冷藏保存，有效期為6個(gè)月；取適量?jī)?chǔ)備液，利用逐級(jí)稀釋法，將經(jīng)過(guò)前處理得到的空白基質(zhì)提取液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，得到松脂酸銅質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 樣品前處理

用天平分別稱取火龍果、豇豆和杧果樣品置于50 mL離心管中，樣品質(zhì)量為(2.0±0.01) g，分別加入10 mL 4 mol/L HCl溶液和20 mL石油醚進(jìn)行提取，振蕩均勻后超聲反應(yīng)提取10 min，4 000 r/min的條件下離心5 min，吸取全部上清液于50 mL圓底燒瓶中，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，蒸干后取2 mL乙腈定容，用0.22 μm針式濾膜過(guò)濾，待測(cè)備用。

1.2.4 色譜檢測(cè)條件

設(shè)置紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為241 nm。選擇SunFire C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm，美國(guó)Waters公司)，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，設(shè)置流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%冰醋酸，流動(dòng)相B為乙腈，V(冰醋酸)∶V(乙腈)=20∶80，等度洗脫。

1.2.5 松脂酸銅殘留量的計(jì)算

根據(jù)公式(1)計(jì)算松脂酸銅的殘留量，以每克農(nóng)藥所殘留的質(zhì)量表示殘留量，單位為μg/g。

(1)

式中：xi，樣品中待測(cè)組分殘留量，μg/g；ρi，待測(cè)組分工作液質(zhì)量濃度，μg/mL；V0，樣品溶液最終定容體積，mL；m，樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定對(duì)象的確認(rèn)

液相色譜法測(cè)定松脂酸銅需要加入鹽酸，將松脂酸銅衍生轉(zhuǎn)化為松脂酸(abietic acid)。因此本研究首先對(duì)松脂酸銅衍生轉(zhuǎn)化為松脂酸的過(guò)程進(jìn)行確證，使用Q Exactive-Orbitrap高分辨質(zhì)譜對(duì)加入鹽酸前后的松脂酸銅標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析[12-14]。首先，查詢松脂酸和松脂酸銅在高分辨質(zhì)譜的準(zhǔn)確分子碎片為303.231 8和666.370 4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入鹽酸前，松脂酸銅和松脂酸在高分辨質(zhì)譜中均不能檢測(cè)到；加入鹽酸后，能夠測(cè)得溶液中存在松脂酸，其離子碎片為303.231 8(圖1-a)，但是松脂酸銅仍未能檢測(cè)到(圖1-b)。因此，松脂酸銅在加入鹽酸后，衍生轉(zhuǎn)換成為松脂酸，圖2列出了其可能的轉(zhuǎn)化途徑，確定松脂酸銅實(shí)際測(cè)定對(duì)象為松脂酸。

a-松脂酸；b-松脂酸銅圖1 松脂酸銅溶液的離子碎片F(xiàn)ig.1 Fragment ion of copper abietate of turpentine

圖2 松脂酸與松脂酸銅間的轉(zhuǎn)化Fig.2 Conversion between abietic acid and copper abietate

2.2 條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

本研究選用甲醇、乙腈、丙酮3種常規(guī)萃取試劑對(duì)松脂酸銅進(jìn)行直接提取，并設(shè)計(jì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)比這3種不同的提取劑對(duì)松脂酸銅的提取效果，得出回收率均未達(dá)到70%，未達(dá)到要求。故在火龍果、豇豆和杧果樣品中加入4 mol/L鹽酸和石油醚作為提取劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再用乙腈定容，如圖3所示，對(duì)比前3種提取方法，該方法得到回收率最高。因此，采取添加4 mol/L鹽酸和石油醚對(duì)上述3種基質(zhì)中的松脂酸銅進(jìn)行提取是可行的。

圖3 松脂酸銅提取劑效果對(duì)比Fig.3 Comparison of the effect of copper abietate extractant

2.2.2 提取時(shí)間的選擇

超聲時(shí)間不同，對(duì)農(nóng)藥的提取效率也不同，時(shí)間過(guò)短會(huì)造成農(nóng)藥提取不完全，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)造成農(nóng)藥的降解。將超聲波時(shí)間設(shè)置為5、10、15、20、25、30 min，分別上機(jī)檢測(cè)，觀察超聲時(shí)間對(duì)回收率的影響。由圖4可以看出，在10 min時(shí)松脂酸銅的提取效率最高。但在10 min之后，回收率逐漸降低，可能是由于隨著時(shí)間的增加，超聲使目標(biāo)物分子碰撞速度不斷加快，直至分子鏈斷裂，分解為其他的物質(zhì)。試驗(yàn)進(jìn)一步使用電噴霧質(zhì)譜法直接進(jìn)樣進(jìn)行驗(yàn)證，分別測(cè)試超聲10 min和超聲30 min的松脂酸溶液的一級(jí)母離子，發(fā)現(xiàn)在m/z為275.2的中間物信號(hào)強(qiáng)度增加，該中間物在超聲10 min時(shí)信號(hào)強(qiáng)度為7.90×104每秒計(jì)數(shù)(counts per second,cps)，在超聲20 min后信號(hào)強(qiáng)度為1.05×105cps。經(jīng)過(guò)計(jì)算，該中間物可能為松脂酸結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，母體丟失2個(gè)甲基。因此，為避免超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致松脂酸降解，引起信號(hào)降低，本試驗(yàn)選擇最佳超聲時(shí)間為10 min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)松脂酸銅回收率的影響Fig.4 The effect of ultrasound time on recovery rate of copper abietate

2.2.3 流動(dòng)相的選擇

本研究采用0.1%冰醋酸和乙腈作為檢測(cè)松脂酸銅的流動(dòng)相，分別設(shè)置流動(dòng)相比例為10/90、20/80進(jìn)行對(duì)比，觀察不同比例的流動(dòng)相對(duì)峰形的影響以及各基質(zhì)雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰分離情況。從圖5和圖6可以看出，在V∶V=10 ∶90的流動(dòng)相條件下，目標(biāo)物出峰較快，保留時(shí)間為5.674 min；在V∶V=20 ∶80的流動(dòng)相條件下，目標(biāo)物出峰較慢，保留時(shí)間為6.297 min。

圖5 流動(dòng)相比例V ∶V=10 ∶90時(shí)松脂酸銅色譜圖Fig.5 Chromatogram of copper abietate at 10 ∶90 mobile phase ratio

圖6 流動(dòng)相比例V ∶V=20 ∶80時(shí)松脂酸銅色譜圖Fig.6 Chromatogram of copper abietate at 20 ∶80 mobile phase ratio

如圖7所示，在杧果樣品分析時(shí)，保留時(shí)間為5.875 min存在雜質(zhì)干擾，導(dǎo)致加標(biāo)回收率偏高。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相比例V∶V=20 ∶80進(jìn)行松脂酸銅的分析，選擇保留時(shí)間較長(zhǎng)的色譜條件，保證目標(biāo)物與雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)良好分離。

圖7 流動(dòng)相比例V ∶V=20 ∶80時(shí)松脂酸銅的杧果樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of copper abietate in mango sample at 20 ∶80 mobile phase ratio

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

用甲醇配制1 000 μg/mL松脂酸銅標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，用甲醇采用逐級(jí)稀釋法配制0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照樣品處理加入鹽酸衍生和石油醚進(jìn)行提取，并將石油醚濃縮干后分別用乙腈定容，得到0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL松脂酸銅標(biāo)準(zhǔn)液，利用HPLC測(cè)定各濃度下松脂酸銅的標(biāo)準(zhǔn)工作液，如圖8所示。并以工作溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)、以監(jiān)測(cè)定量響應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。松脂酸銅在0.1～2 μg/mL線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=15 919X-209.22，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6，以定量離子響應(yīng)的3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限，松脂酸銅的檢出限為0.03 mg/kg，以定量離子響應(yīng)的10倍信噪比(S/N=10)確定定量限為0.1 mg/kg。

圖8 松脂酸銅各質(zhì)量濃度色譜圖Fig.8 Typical chromatogram of each mass concentration of copper abietate turpentine

2.4 回收率及方法精密度

以不添加農(nóng)藥的火龍果、豇豆和杧果分別作為空白樣品，進(jìn)行回收率檢測(cè)。加入松脂酸銅標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行添加濃度為0.4、1.0、4.0 mg/kg的3個(gè)添加回收實(shí)驗(yàn)，重復(fù)處理5次，測(cè)得回收率如表1所示?？瞻讟悠返钠骄厥章蕿?7%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.8%～3.3%，這一結(jié)果滿足果蔬中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。

表1 松脂酸銅加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 1 The recovery rate and relative standard deviation of copper abietate

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

以本分析方法進(jìn)行火龍果、豇豆和杧果樣品中的松脂酸銅殘留量檢測(cè)，從而驗(yàn)證方法的實(shí)際應(yīng)用效果。檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)?shù)厮鍪鄣幕瘕埞?、豇豆和杧果樣品中均未檢出松脂酸銅殘留。

市場(chǎng)采購(gòu)松脂酸銅農(nóng)藥，按照推薦劑量稀釋300倍進(jìn)行噴施，分別在施藥后2 h和安全間隔期7 d采集樣品進(jìn)行分析，得到松脂酸銅在3種樣品上的初始沉積量(施藥后2 h)分別為0.129、0.181、0.158 mg/kg，在規(guī)定安全間隔期3種樣品上的松脂酸銅殘留量均小于0.1 mg/kg。使用本分析方法能有效檢測(cè)3種果蔬實(shí)際樣品中的松脂酸銅殘留，滿足3種樣品中松脂酸銅殘留分析的需求。

3 結(jié)論

松脂酸銅是松脂酸和銅的絡(luò)合物，加入鹽酸后變?yōu)樗芍?，利用高分辨質(zhì)譜法測(cè)定經(jīng)鹽酸衍生后的松脂酸銅，經(jīng)驗(yàn)證確定測(cè)定對(duì)象為松脂酸。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，已有研究得出合成松脂酸銅[15]以Cu(OH)2為銅源，添加甲酸，可以制得松脂酸銅。同時(shí)，也有利用HPLC檢測(cè)松脂酸[16-18]，以及松脂酸銅轉(zhuǎn)化成為松脂酸后進(jìn)行測(cè)定[9]的研究，進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)測(cè)定對(duì)象為松脂酸。

對(duì)松脂酸銅前處理實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，利用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置0.1%冰醋酸-乙腈為流動(dòng)相，體積比為20∶80，建立了松脂酸銅的分析方法。樣品經(jīng)4 mol/L鹽酸和石油醚提取，超聲10 min，蒸干后用乙腈定容，方可上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)用外標(biāo)法計(jì)算松酯酸銅殘留量，該方法的準(zhǔn)確度、精確度和靈敏度均符合殘留檢測(cè)要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，松脂酸在0.1～2.0 mg/L的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2>0.996；根據(jù)回收率實(shí)驗(yàn)，在火龍果、豇豆和杧果基質(zhì)中，添加質(zhì)量濃度為0.4、1.0、4.0 mg/kg時(shí)，上述果蔬基質(zhì)的添加回收率均在77%～108%，說(shuō)明待測(cè)物松脂酸銅在果蔬中分析方法的準(zhǔn)確度滿足檢測(cè)分析的需求。