■余維鵬 陳延娜 張玉茹 林夢君 徐歆歆 曹香林 盧榮華

(河南師范大學水產(chǎn)學院，河南新鄉(xiāng) 453007)

據(jù)2021 中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒數(shù)據(jù)，2020 年中國養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量高達5 224.2萬噸，其中草魚（Ctenopharyngodon idellus）養(yǎng)殖產(chǎn)量達557.1萬噸[1]，養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量的持續(xù)增加導致魚粉和豆粕的需求量不斷增加，價格居高不下。此外，在世界范圍內(nèi)大豆的大量使用也造成了嚴重的環(huán)境問題，如水資源不足以及農(nóng)藥濫用[2]等，限制了其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用，因此亟需尋找可持續(xù)利用的優(yōu)質(zhì)蛋白源。

昆蟲被認為是一種魚粉或豆粕的良好替代品[3]，其養(yǎng)殖環(huán)境簡單，土地需求面積小，不僅可以將大量的有機廢物轉(zhuǎn)化為動物蛋白，還可以凈化環(huán)境等[4]。雙翅目昆蟲由優(yōu)質(zhì)蛋白（高達干物質(zhì)的74.4%）和平衡的氨基酸組成，優(yōu)于豆粕，與魚粉相當[5-6]。黃粉蟲的粗蛋白含量（干重）達到45%以上，黑水虻幼蟲粉（Black soldier fly larvae meal, BSFLM50）和蠅蛆粉（House fly maggot meal, HF25）的粗蛋白含量分別為40%和65%左右，蠶蛹蛋白粉（Silkworm chrysalis meal, SC50）含量接近60%[7-8]。研究表明，黑水虻幼蟲蛋白粉完全替代豆粕不影響草魚的生長，且可提高草魚的抗氧化能力，但當替代水平超過50%時，可能對腸道造成一定損傷[9]。飼料中加入適量的黃粉蟲蛋白粉（Tenebrio molitormeal, TM30）不影響金頭鯛（Sparus aurata）、黑斑鯛（Pagellus bogaraveo）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的生長性能[10-12]，甚至提高了歐洲黑鱸（Dicentrarchus labrax）的蛋白質(zhì)消化率[13]。此外，昆蟲可以抵抗微生物、真菌和病毒等的侵襲，如黃粉蟲粉可以增強黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）的先天免疫反應(yīng)[14]。黑水虻蛋白粉還能調(diào)節(jié)大西洋鮭（Salmo salar）白細胞抗氧化和應(yīng)激相關(guān)基因的表達[15]及改善虹鱒中由豆粕引發(fā)的腸炎[16]。

鑒于同一試驗中評估不同昆蟲粉替代魚粉或豆粕的效果相對較少[17]。本研究旨在評估4種昆蟲蛋白粉替代豆粕后對草魚生長性能、體成分以及脂多糖（Lipopolysaccharides, LPS）、聚肌胞苷酸（Polyinosinic acid：polycytidylic acid, poly I：C）處理4種昆蟲粉飼喂的草魚肝細胞后免疫相關(guān)基因的表達變化等，以期為昆蟲蛋白粉作為水產(chǎn)動物飼料蛋白源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料

采用4 種不同昆蟲蛋白粉替代草魚飼料中的部分豆粕，配制5種等氮等脂（粗蛋白水平為32%，粗脂肪水平為4.9%）的試驗飼料。其中黃粉蟲蛋白粉購于青島新農(nóng)康源生物工程有限公司（粗蛋白46.44%、粗脂肪3.32%），黑水虻幼蟲蛋白粉由西安潔姆環(huán)?？萍加邢挢熑喂净葙洠ù值鞍?2.0%，脫脂產(chǎn)品），蠅蛆蛋白粉購于魚笑癡餌料商城（粗蛋白42.0%，脫脂產(chǎn)品），蠶蛹蛋白粉購自宏越飼料魚粉商貿(mào)公司（粗蛋白42.88%、粗脂肪1.88%）。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)黑水虻幼蟲蛋白粉在草魚飼料替代豆粕的適宜比例為50%[9]，蠶蛹粉、黃粉蟲以及蠅蛆粉在魚類飼料中的適宜用量50%、25%～50%和25%～30%[7,18-27]。因此，本試驗設(shè)計4種昆蟲蛋白粉在草魚飼料中替代豆粕的量分別為0（SM）、50%（SC50）、50%（BSFLM50）、30%（TM30）和25%（HF25）5個水平，最后保持配合飼料中的粗蛋白和粗脂肪含量相同。使用長條制粒機將所有飼料制成粒徑為2 mm的顆粒。在陰涼通風處晾干，收集并儲存于-20 ℃冰箱中。飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼料配方及營養(yǎng)水平（g/kg）

1.2 飼養(yǎng)管理

購買的草魚（河南省新鄉(xiāng)市延津縣漁場）用高錳酸鉀溶液消毒處理后在河南師范大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地的小型養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間每天飽食飼喂草魚商品飼料（河南康達爾農(nóng)牧科技有限公司，粗蛋白含量30.0%、脂肪含量4.0%）3 次。試驗開始前，將試驗魚禁食24 h 后稱重，挑選規(guī)格一致的450 尾草魚幼魚[初始體質(zhì)量為（7.85±0.27）g]，分為5個試驗組，每組3個重復，隨機分配至15個循環(huán)養(yǎng)殖桶（高為62 cm，直徑為52 cm，130 L），每個重復30尾魚。養(yǎng)殖周期為8周，每天分別在8：30，12：30和17：30三個時間點按體重的3%進行投喂。

正式養(yǎng)殖試驗在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行，養(yǎng)殖用水為曝氣晾曬的地下水，每日換水一次，換水量為養(yǎng)殖水體積的1/3，水溫維持在（26.3±1）℃，pH 為6.5～7.8，溶氧量6～8 mg/L，氨氮含量小于0.2 mg/L，亞硝酸鹽含量小于0.1 mg/L，光照周期為12L∶12D。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后禁食24 h，使用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222，60 mg/L）麻醉草魚。稱取體質(zhì)量和測量體長后的試驗魚進行尾靜脈取血，并在每桶隨機選取6 尾草魚分離其內(nèi)臟團和肝胰臟并稱其質(zhì)量。每桶隨機選取9尾魚，取肝胰臟和背部肌肉液氮速凍，-80 ℃保存用于氨基酸和脂肪酸的測定。

1.4 LPS和poly（I：C）孵育草魚原代肝細胞

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，每桶隨機選3尾草魚分離肝細胞并接種到含10%胎牛血清、青鏈霉素各1×104U/L的MEMα的培養(yǎng)板中，每孔接種8×105個細胞，置于28 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后用含有100 ng/mL 的LPS 或50 ng/mL poly（I∶C）的培養(yǎng)液孵育細胞24 h收集樣品（對照組為不含LPS和poly I∶C的培養(yǎng)液）。

1.5 生長性能的測定

增重率（WGR，%）=（末體質(zhì)量-初體質(zhì)量）/初體質(zhì)量×100

特定生長率（SGR，%/d）=（ln末體質(zhì)量-ln初體質(zhì)量）/飼喂天數(shù)×100

飼料系數(shù)（FCR）=每個重復飼料消耗量/（魚末體質(zhì)量+死亡魚體質(zhì)量-魚初體質(zhì)量）

存活率（SR，%）=存活個體數(shù)/初始總個體數(shù)×100

1.6 血清生化指標的測定

采用ADVIA?2400 Chemistry System 分析儀測定草魚血清生化指標，包括總蛋白（Total protein，TP）、白蛋白（Albumin，ALB）、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatas, AKP）、谷 丙 轉(zhuǎn) 氨 酶（Alaninetransaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）、葡萄糖（Glucose，GLU）和高密度脂蛋白膽固醇（High density liptein cholesterol，HDL-C）。

1.7 脂肪酸的測定

將保存于-80 ℃的肌肉和肝胰臟組織塊冷凍干燥24 h，稱取0.1 g 樣品充分研磨，倒入含有10 mL 氯仿-甲醇溶液（2∶1）的試管中振蕩混勻使其充分溶解后，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，取6 mL上清液于新離心管并置于冰上。在管中加入濃度1.6%的CaCl2溶液2 mL（分離氯仿和甲醇），充分振蕩混勻，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，取下層溶液3 mL 于新的玻璃管中，氮氣吹干后在玻璃管中加入300 μL 氯仿和濃度2.5%的H2SO4-甲醇溶液1 mL，充入氮氣并蓋上蓋子，70 ℃水浴1 h 后取出，靜置冷卻15 min。加入200 μL 正己烷，再加入1.5 mL 超純水，振蕩混勻，4 ℃、3 000 r/min 離心2 min，吸取1 mL 上清（切勿吸到下層水相），0.22 μm 濾膜過濾2 次，采用氣相色譜儀（Agilent 7820a, Agilent Technologies, Santa Clara,CA, USA）測定。

1.8 氨基酸的測定

稱取0.1 g 冷凍干燥的肌肉樣品，加入6 mol/L 的稀鹽酸10 mL，110 ℃酸解24 h，冷卻后漏斗過濾，轉(zhuǎn)入容量瓶定容至50 mL，取1 mL 于脫酸儀中干燥，然后加入2 mL 樣品稀釋液，0.22 μm 濾膜過濾2 次，采用氨基酸自動分析儀（S-433D，Sykam，Germany）檢測，上樣量為20 μL。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標準差（mean±SD）”表示。所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22 軟件進行，包括方差分析和多重比較，肝細胞中免疫基因表達統(tǒng)計分析采用2×2-way ANOVA 分析方法。當P＜0.05 時，認為每個組差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種昆蟲蛋白粉對草魚生長性能的影響

如表2所示，與SM組相比，昆蟲粉部分替代豆粕組草魚的末體質(zhì)量、增重率、特定生長率和飼料系數(shù)等變化均不顯著（P＞0.05）。

表2 4種昆蟲蛋白粉對草魚生長性能的影響

2.2 4種昆蟲蛋白粉對草魚血清生化指標的影響

如表3所示，與SM組相比，TP、AKP、ALT、AST的數(shù)值均未產(chǎn)生顯著變化（P＞0.05）；與SM 組相比，BSFLM50、SC50 和HF25 組的葡萄糖顯著升高（P＜0.05）；HF25組的HDL-C顯著高于SM組（P＜0.05）。

表3 4種昆蟲蛋白粉對草魚血清生化指標的影響

2.3 4 種昆蟲蛋白粉對草魚肌肉氨基酸和脂肪酸含量的影響

由表4可知，與SM組相比，除TM30組外，BSFLM50、SC50 和HF25 組的肌肉中∑n-3 PUFA（Polyunsaturated fatty acid, PUFA）的含量均顯著升高（P＜0.05），∑n-3/∑n-6 PUFA 也顯著升高（P＜0.05）。在肌肉氨基酸成分上（見表5），HF25組的谷氨酸含量顯著高于SM 組（P＜0.05）；但SC50 組的苯丙氨酸和TM30 組的亮氨酸均顯著低于SM組（P＜0.05）。

表4 4種昆蟲蛋白粉對草魚肌肉組織脂肪酸含量的影響(%)

表5 4種昆蟲蛋白粉對草魚肌肉組織氨基酸含量的影響

2.4 LPS和poly（I∶C）對4種昆蟲蛋白粉飼喂的草魚肝細胞免疫相關(guān)基因的表達影響

如圖1所示，與其他各組相比，SC50組的肝細胞經(jīng)LPS誘導后TGF-β1基因的表達量顯著升高（P＜0.05）。與對照相比較，BSFLM50、TM30以及HF25組NF-κB的表達量經(jīng)LPS處理后均顯著降低（P＜0.05）（見圖2）。

圖1 4種昆蟲蛋白粉飼喂的草魚肝細胞用LPS和poly（I∶C）處理24 h后TGF-β1基因的表達變化

圖2 4種昆蟲蛋白粉飼喂的草魚肝細胞用LPS和poly（I∶C）處理24 h后NF-κB基因的表達

3 討論

3.1 4種昆蟲蛋白粉對草魚生長性能的影響

本研究表明，黃粉蟲粉、黑水虻幼蟲粉、蠶蛹粉、蠅蛆粉按一定比例替代草魚基礎(chǔ)飼料中的豆粕后均不會影響草魚的生長性能。在黃鱔（Monopterus albus）、建鯉（Cyprinuscarpio Var.Jian）以及吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）的研究中也發(fā)現(xiàn)采用蠶蛹粉或者發(fā)酵蠶蛹替代魚粉的25%～50%時對其生長沒有負面影響[18-21]；脫脂黑水虻幼蟲粉替代50%的大豆?jié)饪s蛋白飼喂羅非魚，發(fā)現(xiàn)二者有相似的特定生長率和飼料轉(zhuǎn)化效率[22]；BSFLM完全替代豆粕對草魚生長沒有影響[23]；用黃粉蟲替代非洲鯰飼料中的魚粉，其替代比例可達60%（魚粉含量為26%），而不影響其生長性能和飼料利用率[24]。蠅蛆粉分別替代飼料中50%或100%的魚粉，飼喂非洲鯰魚（Clarias gariepinus）10周，其生長性能不會受到影響，蛋白質(zhì)效率也得到了改善[25]。也有研究發(fā)現(xiàn)飼料中使用12%～30%的脫脂黑水虻蛋白粉能顯著降低斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）和虹鱒的生長性能[26]。用黃粉蟲替代金頭鯛（Sparus aurata）日糧中的魚粉，當替代比例超過50%時，魚體生長性能受到負面影響[27]。這些結(jié)果顯示，適宜的替代比例不會影響試驗對象的生長性能。脫脂黑水虻粉在斑點叉尾鮰、虹鱒和大菱鲆的研究與本試驗結(jié)果不一致，這可能是因為試驗條件、動物種類、飼養(yǎng)的時間、替代的蛋白種類和比例以及脂肪含量不同所致。

3.2 4種昆蟲蛋白粉對草魚血清生化指標的影響

血液中AST 和ALT 酶活性升高是評價肝功能受損的敏感指標[28]。黃顙魚幼魚飼料中使用黑水虻幼蟲粉替代30%魚粉，可顯著降低血清中AST、ALT 活性及尿素氨、三酰甘油的含量[29]。在本研究中，不同昆蟲源飼料對血清中AST 和ALT 的活性沒有顯著影響。在哺乳動物中，日糧中添加n-3 PUFA可減少肝臟炎癥和纖維化，并可通過降低促炎性因子TNFα的表達水平起到保護肝臟的作用[30]。在魚類中飼喂PUFA后可降低肝臟酶活性[31-32]。本研究結(jié)果顯示，除TM30組外，其他昆蟲粉替代豆粕后均提高了飼料中n-3 PUFA 含量，這可能是草魚血清中AST 和ALT 活性變化不顯著的重要原因之一，且用黑水虻蛋白粉替代豆粕時AST和ALT活性呈下降趨勢，這和在建鯉飼料中用黑水虻蛋白粉替代魚粉[33-34]、或在鱖飼料中用黃粉蟲粉替代魚粉[35]的結(jié)果相類似。脫脂黑水虻蛋白粉代替歐洲鱸魚飼料中的魚粉后其血液中的血紅蛋白、血細胞比容、平均紅細胞體積和平均紅細胞血紅蛋白等含量無顯著變化，白細胞、淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞的含量也沒有顯著變化[36]。本研究中除TM30 組外，其他的昆蟲粉替代后均導致了血糖含量增加，這與家蠶（Bombyx mori）、黃粉蟲等的作用不同[37]，也有學者研究顯示，蠅蛆粉替代魚粉可提高黃顙魚血糖的含量[38]，這可能與不同食性魚類對糖的利用能力有關(guān)。與SM 相比，攝食HF25 飼料的草魚血清中HDL-C 顯著升高，顯示蠅蛆粉替代豆粕可以改善草魚的脂質(zhì)代謝，這與文遠紅等[38]發(fā)現(xiàn)的養(yǎng)殖家蠅幼蟲蛋白具有降低血清膽固醇和三酰甘油的作用類似。

3.3 4 種昆蟲蛋白粉對草魚肌肉脂肪酸和氨基酸含量的影響

本研究顯示，與對照組相比，BSFLM50組、SC50組以及HF25 組的草魚肌肉組織中∑n-3 PUFA 的含量顯著增加。在氨基酸組成上，本研究結(jié)果顯示草魚肌肉氨基酸組成對日糧組成的反應(yīng)較小，這可能是草魚的肌肉蛋白質(zhì)合成率較低的緣故[39]。僅是HF25組的肌肉組織中谷氨酸含量顯著高于SM組，但SC50組肌肉中苯丙氨酸和TM30組的亮氨酸均顯著低于SM組，產(chǎn)生這些差異的原因可能與日糧中氨基酸的含量、試驗對象的規(guī)格以及替代比例不同等。

3.4 昆蟲蛋白粉對草魚肝臟免疫相關(guān)基因表達的影響

昆蟲含有豐富的抗菌肽[40]。到目前為止，超過150個具有抗菌活性的昆蟲蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)[41]。采用蠅蛆粉飼喂青魚（Mylopharyngodon piceus）后，嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）豐度降低，其溶菌酶和補體活性均有改善，死亡率降低[42]。飼喂低水平的家蠅幼蟲可激活紅海鯛（Pagrus major）的先天性免疫系統(tǒng)，保護其免受愛德華斯氏菌的遲發(fā)性感染，并認為這可能是由于家蠅體內(nèi)存在的幾丁質(zhì)或抗菌物質(zhì)等[43]。在大西洋鮭的飼料中用昆蟲粉代替魚粉，養(yǎng)殖結(jié)束后用病毒和細菌模擬物處理其頭腎細胞后發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，昆蟲粉組頭腎細胞中促炎基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有變化，但細胞中抗氧化和應(yīng)激相關(guān)基因Mn-SOD、GPx1、HSP27和HSP70的表達下調(diào)[15]。飼喂黃粉蟲可以改善歐洲鱸魚的抗菌和抗寄生蟲的能力[44]。研究表明，低水平的幾丁質(zhì)能刺激金頭鯛（Sparus aurataL.）（＜0.01%）[45]和鯉（＜1%）[46]的內(nèi)源性免疫系統(tǒng)。本試驗結(jié)果顯示，LPS 處理后，除SC50組外，促炎癥因子NF-κB的基因表達量均顯著低于對照組，這可能是昆蟲所含的幾丁質(zhì)刺激機體內(nèi)源性免疫系統(tǒng)，增強了機體的抵抗力。

4 結(jié)論

4 種昆蟲粉替代豆粕均不會影響草魚的生長，HF25 組替代豆粕可提高草魚血清HDL-C 及肌肉中谷氨酸的含量，且可以降低促炎基因NF-κB的表達量。若以生長指標為依據(jù)，4種不同比例的昆蟲粉均可成功替代草魚飼料中的豆粕，且HF25 組的替代效果最佳。