茶樹種質(zhì)資源汝城白毛茶的代謝物差異研究

趙 熙，趙 洋，楊培迪，寧 靜，楊 陽，成 楊，劉 振

湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心湖南分中心/湖南省茶樹品種與種苗工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410125

汝城白毛茶原產(chǎn)于羅霄山脈東段九龍江次生森林一帶，是湖南四大茶樹地方群體資源之一，也是白毛茶變種（Camelliasinensisvar.pubilimbaChang）的一個(gè)典型代表[1]。研究表明汝城白毛茶不僅在演化地位上與湖南其他3個(gè)地方群體資源差異較大，而且在植物學(xué)特征、生化成分、制茶品質(zhì)等方面特色鮮明[2]。

目前對(duì)汝城白毛茶生化成分的研究主要集中在水浸出物、咖啡堿、氨基酸、茶多酚、兒茶素組分等方面，而對(duì)于其深度的功能成分研究相對(duì)較少[3]。近年來隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，高功能成分特異茶樹種質(zhì)資源的發(fā)掘與利用越來越受到研究者的關(guān)注[4-5]。研究表明，不同地方茶樹資源由于長(zhǎng)期的演化和引種馴化，在功能成分方面具有較大差異[1]。通過對(duì)不同地方茶樹資源的鑒定評(píng)價(jià)，已在茶氨酸[6]、苦茶堿[7]、黃酮[8]、β-胡蘿卜素[9]等檢測(cè)工作中取得了一定的進(jìn)展，篩選出了一些功能成分特異的茶樹資源（品種），這些品種的推廣極大地帶動(dòng)了當(dāng)?shù)夭璁a(chǎn)業(yè)發(fā)展[4]。因此對(duì)于汝城白毛茶資源的代謝物差異研究不僅對(duì)汝城白毛茶的選育、開發(fā)具有重要意義，而且對(duì)于探明汝城白毛茶馴化分子機(jī)理研究也具有重要的參考價(jià)值。

代謝組學(xué)技術(shù)是一種可以在很寬范圍內(nèi)對(duì)生物樣品中代謝物進(jìn)行全面定量分析的技術(shù)，具有高效、全面及準(zhǔn)確的特點(diǎn)[10-11]。同時(shí)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)不僅可以在模型水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，而且可以尋找潛在性差異代謝物[12]。代謝組學(xué)已在茶葉的生理代謝[13]、加工過程的成分變化[14-15]、特征成分的挖掘等[16]方面有了一定的應(yīng)用。本研究以湖南典型地方茶樹群體資源為對(duì)照，采用UPLC-MS/MS分析技術(shù)，研究并篩選汝城白毛茶的差異代謝產(chǎn)物，以期為汝城白毛茶茶樹種質(zhì)資源的篩選、加工工藝研究和馴化分子機(jī)理探索等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究采用的汝城白毛茶（RCBM）、城步峒茶群體（CBDC）、江華苦茶群體（JHKC）和安化群體（AHQT）樣品采自于湖南省茶樹種質(zhì)資源圃，春季采摘第一批一芽一葉，樣品采集后在液氮中冷卻并進(jìn)行冷凍干燥。

1.1.2 儀器與試劑 儀器：FD-56真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)SIM公司；MT203T電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；5424R離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf公司；MM 400研磨機(jī)，德國(guó)RETSCH公司；CBM30A超高效液相色譜，日本島津公司；4500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS），美國(guó)Applied Biosystems公司。

試劑：乙醇、甲醇、乙腈，國(guó)產(chǎn)；標(biāo)準(zhǔn)品：二甲基亞砜或甲醇作為溶劑溶解后，保存條件-20℃，質(zhì)譜分析前采用 70%甲醇稀釋成合適濃度（美國(guó)，Sigma-Aldrich），試劑均為色譜純。

1.2 方法

UPLC-MS分析。數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography, UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry, MS/MS）。色譜柱：SB-C18 Agilent 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈；洗脫梯度：0 min B相比例5%，9.00 min內(nèi)B相比例線性增至95%，維持1 min，10.00~11.10 min，B相比例降至5%，并平衡至14 min；流速為0.35 mL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量4 μL。質(zhì)譜條件參照CHEN等[10]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于邁維生物科技公司的植物廣靶代謝數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)樣本的代謝物進(jìn)行質(zhì)譜定性分析，采用 MultiaQuant軟件進(jìn)行色譜峰面積和對(duì)應(yīng)物質(zhì)相對(duì)含量的確定。采用變量重要性投影值（variable importance in projection, VIP）和差異倍數(shù)值（fold change, FC）對(duì)正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）結(jié)果進(jìn)行差異代謝物篩選，VIP值大于1可判定為差異顯著的代謝物，同時(shí)含量增加的代謝物 FC≥2或含量減少的代謝物FC≤0.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 汝城白毛茶的差異代謝物篩選

共有609個(gè)代謝物在4個(gè)群體中被檢測(cè)出。以安化群體、城步峒茶、江華苦茶3個(gè)群體為對(duì)照組，采用 OPLS-DA分析方法，基于顯著差異代謝物的篩選依據(jù)，分別在汝城白毛茶中篩選到顯著差異代謝物189、180、162個(gè)（圖1），其中差異代謝物最多的為黃酮類（69、51、60個(gè)），其次為酚酸類（31、40、25個(gè)），最少的為木脂素和香豆素（5、4、4個(gè)）。

圖1 汝城白毛茶與其他3個(gè)群體的差異代謝物比較Fig.1 Comparison of metabolites in Rucheng Baimaocha with other three populations

2.2 與3個(gè)群體顯著差異代謝物比較

為挖掘汝城白毛茶中含量較高的差異代謝物，本研究將汝城白毛茶分別與湖南其他典型地方群體資源間含量增加的差異代謝物進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，汝城白毛茶中含量增加最多的代謝物均為黃酮，其次為酚酸類，其中含量增加最高的物質(zhì)均為喬松素。比安化群體顯著增加的代謝物共93種，與茶葉品質(zhì)密切相關(guān)、有CAS號(hào)且Log2FC＞2的代謝物共20個(gè)；比城步峒茶顯著增加的代謝物共91種，與茶葉品質(zhì)密切相關(guān)、有CAS號(hào)且Log2FC＞2的代謝物質(zhì)共18個(gè)；比江華苦茶群體顯著增加的代謝物共67種，其中與茶葉品質(zhì)密切相關(guān)、有CAS號(hào)且Log2FC＞2的代謝物共15個(gè)（表1）。將不同群體中汝城白毛茶含量顯著增加的代謝物進(jìn)行比較，汝城白毛茶較其他 3個(gè)群體含量均增加的代謝物共15個(gè)（圖2，表2），表明這些物質(zhì)在汝城白毛茶群體中的含量較高。

表2 在3個(gè)群體中含量均增加的代謝物（Log2FC＞1）Tab.2 Metabolites increased in all three population (Log2FC＞1)

圖2 汝城白毛茶與3個(gè)群體差異代謝物的韋恩圖Fig.2 Venn map of differential metabolites among three population

表1 與3個(gè)不同群體比較含量顯著增加的物質(zhì)（Log2FC＞2）Tab.1 Specific increased differential metabolites compared with three different populations (Log2FC＞2)

續(xù)表1 與3個(gè)不同群體比較含量顯著增加的物質(zhì)（Log2FC＞2）Tab.1 Specific increased differential metabolites compared with three different populations (Log2FC＞2) (continued)

2.3 群體間差異代謝物的K均值聚類

為了研究代謝物在不同樣本中相對(duì)含量的變化趨勢(shì)，將差異代謝物相對(duì)含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和中心化處理，然后進(jìn)行K均值聚類（K-means）分析（圖3）。結(jié)果表明，4個(gè)群體中變化趨勢(shì)一致的代謝物可分為9類。本研究對(duì)變化趨勢(shì)一致、與茶葉品質(zhì)密切相關(guān)且有 CAS號(hào)的差異代謝物進(jìn)行了篩選，得出汝城白毛茶中含量最高的代謝物共 32個(gè)（表3），分布在 1、2、5、7、9共 5個(gè)聚類群中，主要為黃酮和鞣質(zhì)類。

表3 變化趨勢(shì)一致且在汝城白毛茶群體中含量最高的物質(zhì)Tab.3 Substances with the same change trend and the highest content in Rucheng Baimaocha

圖3 差異代謝物K-means圖Fig.3 K-means of different metabolites

2.4 差異代謝物KEGG富集分析

根據(jù)差異代謝物的篩選結(jié)果，本研究進(jìn)行了差異代謝物KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，其中Rich factor值越大表示富集程度越大，Pvalue越接近于0，表示富集越顯著（圖4、圖5、圖6）。圖中圓點(diǎn)越大，代表富集到相應(yīng)通路上的差異顯著代謝物的個(gè)數(shù)越多。差異代謝物KEGG富集分析結(jié)果表明，與安化群體富集顯著且個(gè)數(shù)最多的代謝途徑依次為類黃酮生物合成途徑、苯丙烷生物合成途徑、黃酮與黃酮醇生物合成途徑、異喹啉生物堿生物合成途徑（圖4）；與城步峒茶富集顯著且個(gè)數(shù)最多的代謝途徑依次為類黃酮生物合成途徑、其次為賴氨酸降解和賴氨酸生物合成途徑（圖5）；與江華苦茶富集顯著且個(gè)數(shù)最多的代謝途徑依次為類黃酮生物合成途徑、苯丙烷生物合成途徑和黃酮與黃酮醇生物合成途徑（圖6）。

圖4 汝城白毛茶與安化群體差異代謝物的KEGG通路富集Fig.4 KEGG pathway enrichment of different metabolites between RCBM and AHQT

圖5 汝城白毛茶與城步峒茶差異代謝物的KEGG通路富集Fig.5 KEGG pathway enrichment of different metabolites between RCBM and CBDC

圖6 汝城白毛茶與江華苦茶差異代謝物的KEGG通路富集Fig.6 KEGG pathway enrichment of different metabolites between RCBM and JHKC

3 討論

黎星輝等[3]對(duì)湖南主要地方茶樹資源進(jìn)行了經(jīng)濟(jì)性狀和主要生化成分含量測(cè)定，結(jié)果表明，茶多酚與兒茶素含量在不同茶樹資源中差異較大，其中汝城白毛茶含量最高，屬于高茶多酚資源，其次為江華苦茶和城步峒茶，云臺(tái)山種含量最低。本研究結(jié)果表明，以安化群體、城步峒茶、江華苦茶3個(gè)群體為對(duì)照，在汝城白毛茶中篩選到了顯著差異代謝物最多的均為黃酮類，其次為酚酸類，這與前人的研究結(jié)果一致。一方面說明黃酮和茶多酚作為茶葉中的一大類物質(zhì)，包括的次生代謝物類型在茶葉中數(shù)量相對(duì)較多，另一方面也說明汝城白毛茶作為湖南的典型地方茶樹種質(zhì)資源，具有較高的茶多酚含量，是一個(gè)加工紅茶的優(yōu)異茶樹種質(zhì)資源。

差異代謝物的富集通路對(duì)理解品種差異具有重要意義。差異代謝物富集通路研究表明，汝城白毛茶與其他群體的差異代謝物除主要富集于類黃酮、黃酮與黃酮醇生物合成途徑外，還在苯丙烷生物合成途徑、異喹啉生物堿生物合成途徑和咖啡堿代謝途徑中有比較顯著的富集。苯丙烷類生物合成途徑是植物 3條主要次生代謝途徑之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程及應(yīng)答逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，如避免植物受逆境脅迫傷害、提高植株抗病能力、生成花和果實(shí)的顏色與氣味、作為信號(hào)傳導(dǎo)分子等[17-18]。目前茶樹中關(guān)于苯丙烷類代謝途徑的研究較少，谷夢(mèng)雅等[19]通過不同強(qiáng)度紅光對(duì)茶樹影響進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，研究表明紅光處理可能對(duì)茶樹苯丙烷類生物合成代謝途徑具有重要影響，進(jìn)而可能影響茶樹黃酮類化合物生物合成和木質(zhì)素合成途徑。異喹啉生物堿具有多種生物活性，例如抗腫瘤、抗菌、調(diào)節(jié)免疫功能等，具有很高的醫(yī)用價(jià)值和廣闊的前景，一直是國(guó)內(nèi)外研究開發(fā)利用的熱點(diǎn)[20]。

前期對(duì)汝城白毛茶的差異代謝物研究主要集中在水浸出物、茶多酚、氨基酸等大類物質(zhì)中，對(duì)于更深層次的功能成分差異研究卻關(guān)注較少。本研究開展了汝城白毛茶通與湖南其他3個(gè)典型地方茶樹種質(zhì)資源的差異代謝物研究，通過分析得到在汝城白毛茶中顯著增加的差異代謝物，比如喬松素、鞣花酸、山奈酚等，這些代謝物具有良好的抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降低血脂和神經(jīng)保護(hù)等作用，已在一些蔬菜、水果及中藥材中有了研究的報(bào)道，但目前在茶葉中相關(guān)的研究較少[21-23]。因此通過汝城白毛茶含量增加的差異代謝物研究，不僅為后期汝城白毛茶群體資源篩選提供了重要的研究方向，而且也為汝城白毛茶資源的保健功能研究和開發(fā)利用提供了重要依據(jù)。