王智俊，劉東亮，付娌麗，饒 璐，李月生

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院輻射化學(xué)與功能材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北咸寧 437100;3.湖北省智慧康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北咸寧 437100)

0 引言

生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)一般在等溫狀態(tài)條件下進(jìn)行，熱效應(yīng)較小.如若能夠使用某種方法測量出生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的熱效應(yīng)，那就能對生物系統(tǒng)進(jìn)行靜態(tài)(恒溫式)的連續(xù)跟蹤檢測.微量熱法是一種高靈敏度和高精準(zhǔn)度的技術(shù)，是一種適合定性和定量研究生物活性的技術(shù)，是一種基于自動(dòng)、連續(xù)監(jiān)測變化過程的熱效應(yīng)而建立的熱化學(xué)方法.該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于藥物與生物相互作用的研究.可通過分析生長代謝熱功率輸出曲線而得到生物機(jī)體生理活動(dòng)的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息[1].實(shí)際上，微量熱法非常適合于測量輕微放熱或吸熱過程的熱輸出，如微生物細(xì)胞、細(xì)胞器、組織的產(chǎn)熱器官.近年來，微量熱法已廣泛應(yīng)用于藥物和微生物細(xì)胞之間的相互作用[2].

亞甲基藍(lán)(MB，別名：堿性湖藍(lán)；次甲基藍(lán)；美藍(lán)，化學(xué)式為C16H18N3ClS)在抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛.Jian Ji團(tuán)隊(duì)[3]基于MB和β-環(huán)糊精之間的主客體相互作用，開發(fā)了一種具有很大潛力的抑菌涂層，具有廣泛的應(yīng)用場景，如醫(yī)療設(shè)備殺菌的替代品.Busi Siddhardha團(tuán)隊(duì)[4]使用MB和Ag NPs的混合物，發(fā)現(xiàn)具有更高的抗菌活性，對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌都更有效.此外，K Kholikov團(tuán)隊(duì)[5]使用MB與石墨烯量子點(diǎn)(GQD)結(jié)合，可增強(qiáng)單線態(tài)氧的產(chǎn)生，從而提高細(xì)菌滅活率，以增強(qiáng)抗菌活性.

納米二氧化鈦由于其化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性和抗菌性能，已成為抗菌材料領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一.Sara Akhtar團(tuán)隊(duì)[6]合成了納米TiO2膠體，對革蘭氏陽性和陰性致病菌進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明TiO2納米膠體具有抗菌潛力.Yue-Sheng Li團(tuán)隊(duì)[7]以聚乙烯醇(PVA)、羧甲基殼聚糖(CMCS)和納米TiO2為原料，通過凍融循環(huán)和電子束輻射制備了納米TiO2/CMCS/PVA三元納米復(fù)合水凝膠，具有顯著的抑菌活性.Seyed Mohammad Davachi團(tuán)隊(duì)[8]采用殼聚糖/二氧化鈦納米復(fù)合材料制備了超疏水棉織物，發(fā)現(xiàn)納米復(fù)合涂層織物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌性能,所研制的納米復(fù)合涂層織物在抗菌方面具有廣闊的應(yīng)用前景.

在全球范圍內(nèi)真菌感染是傳染病導(dǎo)致死亡的一個(gè)最主要的原因.而念珠菌是侵襲性真菌感染最常見的原因之一，其中白色念珠菌又是侵襲性念珠菌病的主要原因[9].白色念珠菌在臨床上是一種重要的人體致病真菌，通常存在于人口腔、下呼吸道、腸道及陰道，一般可與宿主共生，不引起疾病，而當(dāng)宿主免疫功能異?；蛘＞菏д{(diào)時(shí)就會(huì)引發(fā)急性、亞急性或慢性感染[10].

本文采用微量熱法，研究了MB/TiO2復(fù)合物對白色念珠菌的熱功率輸出曲線，直接測定白色念珠菌在MB/TiO2復(fù)合物作用下的生長代謝過程，并根據(jù)熱功率輸出曲線計(jì)算白色念珠菌在MB/TiO2復(fù)合物作用下的生長速率常數(shù)、傳代時(shí)間、抑制率、半抑制濃度等熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，進(jìn)一步揭示了白色念珠菌生長代謝過程的熱動(dòng)力學(xué)規(guī)律.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品及儀器

1.1.1儀器 LKB-2277生物活性檢測系統(tǒng)(瑞典)，熱穩(wěn)定性好，可穩(wěn)定在±1×10-4℃，恒溫工作范圍在20～80 ℃，熱功率最小檢測極限為0.12 μW，24 h內(nèi)基線漂移為0.2 μW，實(shí)驗(yàn)時(shí)系統(tǒng)控溫于37.00 ℃；X射線衍射分析儀(XRD-600，日本島津)；掃描電鏡(VEGA 3 SBH，TESCAN公司，捷克).

1.1.2材料 TiO2(Degussa P-25,Germany)；MB(Sigma,St.Louis,MO,USA)；白色念珠菌(ATCC 64550)；培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基)：取NaCl 0.5 g，蛋白胨1 g，牛肉膏0.6 g，溶于100 mL二次蒸餾水中，pH=7.0，120 ℃，1.034×105Pa高壓滅菌30 min，冰箱中放置備用；LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：取NaCl 5 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，溶于1000 mL二次蒸餾水中，pH=7.0，120 ℃，1.034×105Pa高壓滅菌30 min，冰箱中放置備用.

1.2 MB/TiO2復(fù)合物的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]，在pH為7.4±0.1的PBS緩沖溶液中制備MB/TiO2納米復(fù)合懸浮液，靜置8 h后，離心，干燥，即得MB/TiO2復(fù)合物.所有溶液均用雙蒸餾水配制，樣品質(zhì)量在微天平上精確稱重.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

用X射線衍射分析儀(XRD)和掃描電鏡(SEM)分析MB/TiO2復(fù)合物樣品的結(jié)合情況.

使用停流法進(jìn)行檢測.檢測前先用0.1 mol·L-1NaOH溶液清洗管道和流通池，再用0.1 mol·L-1HCl溶液清洗，接著使用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液清洗，最后使用無菌水清洗管道和流通池.待基線穩(wěn)定之后，用蠕動(dòng)泵以50 mL·h-1的流速將菌液和樣品的混合液泵入生物活性檢測系統(tǒng)中，當(dāng)樣品充滿流通池(約0.6 mL)后停泵，記錄儀自動(dòng)跟蹤記錄流通池內(nèi)細(xì)菌的生長代謝熱功率輸出曲線(P-T曲線)，當(dāng)記錄筆返回基線后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束.

TiO2和MB/TiO2復(fù)合物按實(shí)驗(yàn)要求用二次蒸餾水配制成溶液，實(shí)驗(yàn)前先將細(xì)菌接種于5 mL的新鮮的LB培養(yǎng)基中，接種量為106cfu/mL，后將用二次蒸餾水溶解后的待測樣品加入LB培養(yǎng)基中，在振蕩器上搖勻.整個(gè)操作過程均在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的表征

2.1.1 X射線衍射(XRD)分析 將TiO2、MB以及合成的MB/TiO2復(fù)合物研磨、壓片，用X射線衍射分析儀進(jìn)行分析.如圖1所示，在25.2°、38.6°、53.9°、55.1°處出現(xiàn)了TiO2的特征峰，說明MB的復(fù)合沒有改變TiO2的晶型結(jié)構(gòu).

2.1.2 掃描電鏡(SEM)分析 通過SEM對MB/TiO2復(fù)合物的表面形貌進(jìn)行觀察與分析.如圖2(a.b)所示，TiO2存在明顯的聚集現(xiàn)象，如圖2(c.d)所示，發(fā)現(xiàn)MB已附著在TiO2表面，與之結(jié)合，同時(shí)可以看出MB/TiO2復(fù)合物比單一的TiO2具有更好的分散性.

圖1 MB、TiO2、MB/TiO2復(fù)合物的XRD分析Fig.1 XRD analysis of MB, TiO2 and MB/TiO2 composites圖2 TiO2的SEM分析(a,b);MB/TiO2復(fù)合物的SEM分析(c,d)Fig.2 SEM analysis of TiO2(a,b);SEM analysis of MB/TiO2 composites(c,d)

2.2 白色念珠菌生長代謝熱功率輸出曲線

近似生理?xiàng)l件下,用停流法測定了白色念珠菌生長代謝熱功率輸出曲線(P-T)，如圖3所示.生長代謝熱功率輸出曲線與傳統(tǒng)生物學(xué)方法所獲得的典型細(xì)菌生長曲線結(jié)果能很好的吻合，也包括四個(gè)主要時(shí)期：停滯期(I)、指數(shù)生長期(II)、非指數(shù)生長期(III)、衰亡期(IV).

圖3 白色念珠菌的生長代謝熱功率輸出曲線Fig.3 The power-time curves of Candida albicans growth

同時(shí)測定了TiO2和MB/TiO2復(fù)合物作用下的白色念珠菌的生長代謝的熱功率輸出曲線，圖4a為白色念珠菌在不同濃度的TiO2作用下的生長代謝的熱功率輸出曲線.隨著濃度的增加白色念珠菌的停滯期變長，生長期的最大產(chǎn)熱功率(Pm)減小.在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，其結(jié)果有非常好的重現(xiàn)性.

圖4b反映了白色念珠菌在不同濃度MB/TiO2復(fù)合物作用下生長代謝熱功率輸出曲線情況.將白色念珠菌在TiO2樣品和MB/TiO2復(fù)合物的熱功率輸出曲線進(jìn)行比較，可以看到白色念珠菌在MB/TiO2復(fù)合物作用下，傳代時(shí)間tG延長，生長代謝熱功率輸出曲線上的停滯期變長，生長峰后移，生長期的最大產(chǎn)熱功率Pm減小，而且這個(gè)趨勢隨著MB/TiO2復(fù)合物濃度的逐漸增大，變化會(huì)愈加明顯，表面MB/TiO2復(fù)合物對白色念珠菌的生長代謝的抑制作用且比單獨(dú)使用TiO2效果更好.

圖4 白色念珠菌在不同濃度的TiO2作用下的生長代謝熱功率輸出曲線(a);白色念珠菌在不同濃度的MB/TiO2復(fù)合物作用下的生長代謝熱功率輸出曲線(b)Fig.4 The power-time curves of Candida albicans growth in the presence of TiO2 at different concentrations(a);The power-time curves of Candida albicans growth in the presence of MB/TiO2 composites at different concentrations(b)

2.3 白色念珠菌的生長速率常數(shù)k和傳代時(shí)間tG的計(jì)算

在細(xì)胞的指數(shù)生長期中，產(chǎn)熱功率Pt與生長速率常數(shù)k之間有如下關(guān)系[13]：

Pt=P0exp(kt)或LnPt=LnP0+kt

(1)

將生長代謝熱功率輸出曲線上指數(shù)生長期的Pt，t值代入式(1)中，用計(jì)算機(jī)進(jìn)行線性擬合分別得到白色念珠菌在TiO2和MB/TiO2復(fù)合物作用下生長速率常數(shù)k.

另外，傳代時(shí)間tG與生長速率常數(shù)k之間有如下關(guān)系：

tG=(ln2)/k

(2)

通過式(2)可以得到白色念珠菌在不同濃度的TiO2和MB/TiO2復(fù)合物樣品作用下的傳代時(shí)間tG(如表1所示).表1顯示白色念珠菌的生長速率常數(shù)k隨著TiO2和MB/TiO2復(fù)合物樣品濃度的增加而減小，細(xì)胞的傳代時(shí)間tG相應(yīng)延長.

2.4 生長速率常數(shù)k與濃度c的關(guān)系

由表1可以得到生長速率常數(shù)k隨著MB/TiO2復(fù)合物和TiO2樣品濃度c的增大而減小，表明MB/TiO2復(fù)合物和TiO2樣品對細(xì)菌均產(chǎn)生較大影響.TiO2樣品濃度較低時(shí)，生長速率常數(shù)k隨著藥物濃度的增大而顯著下降；而濃度較高時(shí)，隨著樣品濃度的逐漸增大，生長速率常數(shù)k下降速度逐漸減緩.而MB/TiO2復(fù)合物則沒有這種趨勢，可見對于TiO2和MB/TiO2復(fù)合物，白色念珠菌的生長速率常數(shù)k隨樣品濃度的變化不完全相同，說明TiO2和MB/TiO2復(fù)合物對白色念珠菌的生長代謝過程的影響也不完全一樣，也許是因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)導(dǎo)致與微生物中酶的結(jié)合各不相同，從而使它們對微生物生長代謝過程的作用不同.

以k對c進(jìn)行線性擬合，則得k與各樣品濃度c的關(guān)系分別為:

TiO2k=0.911 3-0.001 4c+9.313 0×10-7c2R2=0.956 5

MB/TiO2k=0.982 65-6.777 06cR2=0.867 7

表1 白色念珠菌在不同濃度MB/TiO2復(fù)合物和TiO2作用下的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.1 Thermokinetic parameters of Candida albicans in the presence of MB/TiO2 complexes and TiO2 at different concentrations

通過k-c圖形可以更直觀的看到，隨著樣品濃度的增加，細(xì)菌的生長受到的抑制越大，由方程tG=(ln2)/k得到的傳代時(shí)間tG也逐漸增加.如圖5a和圖5b所示.

圖5 白色念珠菌在不同濃度的TiO2作用下的生長速率常數(shù)k(a);b:白色念珠菌在不同濃度的MB/TiO2復(fù)合物作用下的生長速率常數(shù)k(b)Fig.5 The growth rate constant (k) of Candida albicans growth in the presence of TiO2at different concentrations(a);The growth rate constant (k) of Candida albicans growth in the presence of MB/TiO2 composites at different concentrations(b)

2.5 抑制率I和半抑制濃度IC50

樣品對白色念珠菌的抑制率可通過下面公式得到：

I=[(k0-kC)/k0]×100%

(3)

式中k0為細(xì)胞未受到抑制時(shí)生長速率常數(shù)，kC為細(xì)胞受到濃度為c的樣品抑制作用時(shí)的生長速率常數(shù).半抑制濃度IC50為抑制率為50%時(shí)所對應(yīng)的樣品濃度.根據(jù)式(3)，得出了白色念珠菌在MB/TiO2復(fù)合物和TiO2樣品不同濃度作用下的抑制率I及半抑制濃度IC50，結(jié)果如表1所示.半抑制濃度IC50體現(xiàn)細(xì)菌被樣品抑制的敏感性：IC50值越小，表示細(xì)菌對樣品越敏感，也就是樣品的抑制作用就越大.由表1可得出：白色念珠菌對MB/TiO2復(fù)合物最敏感，對TiO2敏感的程度其次.

2.6 抑制率I與濃度c的關(guān)系

由表1可以得到抑制率I與樣品濃度c的關(guān)系，抑制率I隨樣品濃度的不斷增加而增加，說明樣品濃度越高，對白色念珠菌的抑制作用越強(qiáng)，當(dāng)抑制率為100%時(shí)說明大腸桿菌被完全抑制，二者線性擬合方程為：

TiO2I=0.064 04+5.945 29cR2=0.927 59

MB/TiO2I=-0.077 54+6.777cR2=0.931 49

通過I-c圖形(圖6a和6b)可以很直觀的看到，隨著樣品濃度的增加，細(xì)菌生長所受到的抑制越大.

2.7 MB/TiO2復(fù)合物抑制白色念珠菌生長代謝的機(jī)理

MB/TiO2復(fù)合物比單一的TiO2具有更好的分散性和晶體特性.而白色念珠菌細(xì)胞膜上存在數(shù)個(gè)作用位點(diǎn)，MB/TiO2復(fù)合物因其更佳的分散性和晶體特性，更易與白色念珠菌細(xì)胞膜上的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生相互作用[14]，導(dǎo)致白色念珠菌細(xì)胞膜破損，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)外泄，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡.而TiO2因其出現(xiàn)的聚集現(xiàn)象，不易與白色念珠菌上的多個(gè)作用位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合，抑制白色念珠菌生長代謝的效果自然不如MB/TiO2復(fù)合物.MB/TiO2復(fù)合物導(dǎo)致白色念珠菌細(xì)胞膜破損，也進(jìn)一步驗(yàn)證了納米粒子與生物體細(xì)胞膜相互作用的觀點(diǎn)[15].

圖6 白色念珠菌在不同濃度的TiO2作用下的抑制率I(a);白色念珠菌在不同濃度的MB/TiO2復(fù)合物作用下的抑制率I(b)Fig.6 The inhibitory ratio (I) of Candida albicans growth in the presence of TiO2at different concentrations(a); The inhibitory ratio (I) of Candida albicans growth in the presence of MB/TiO2 composites at different concentrations(b)

3 結(jié)論

在近似生理?xiàng)l件下，采用微量熱法研究MB/TiO2復(fù)合物對白色念珠菌的抑制行為，并與TiO2對白色念珠菌的抑制進(jìn)行對比.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：首先，MB/TiO2復(fù)合物對白色念珠菌的抑制效果強(qiáng)于TiO2.其次，MB/TiO2復(fù)合物的生長速率常數(shù)(k)和最大產(chǎn)熱功率(Pm)隨著其濃度的增加而下降，而傳代時(shí)間(tG)和抑制率(I)隨著其濃度的增加而增加.MB/TiO2復(fù)合物的生長速率常數(shù)(k)和抑制率(I)均與其濃度成一定的線性關(guān)系.

總之，這項(xiàng)工作表明微量熱法可以為納米復(fù)合材料對細(xì)菌的抑菌作用的研究提供一個(gè)很好的，且不能用常規(guī)方法獲得各項(xiàng)動(dòng)態(tài)信息的方法，解決了當(dāng)前分析納米生物技術(shù)難的問題.這項(xiàng)工作有效提供了研究納米材料作為抗菌，抗病毒和污染控制的新平臺(tái).