陳宗游,韋 霄,柴勝豐,鄒 蓉,汪俊芳

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所,廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西桂林 541006;2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川成都 610065;3.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)勘測設(shè)計(jì)院,廣西南寧 530022)

合柱金蓮木(Sauvagesiarhodoleuca)又名辛木,屬金蓮木科(Ochnaceae)合柱金蓮木屬(Sauvagesia)小灌木,為我國特有的單種屬植物。合柱金蓮木分布區(qū)域狹窄、分布零星,僅在廣東和廣西局部山區(qū)海拔200-1 000 m的中低山發(fā)現(xiàn)有少量分布[1,2]。合柱金蓮木具有一定的藥用價(jià)值,其根莖可以入藥,具有止癢殺蟲之功效[3]。因分類地位特殊,合柱金蓮木對研究金蓮木科植物的區(qū)系、地理分布及其發(fā)生與演化等具有重要的價(jià)值[1,4]。受生存環(huán)境惡化及森林砍伐、采根入藥等人類活動(dòng)的影響,合柱金蓮木分布范圍和數(shù)量日益減少,在不少分布區(qū)合柱金蓮木瀕臨滅絕或已絕跡。在廣西,龍勝[5]、象州[6]兩縣原記載有合柱金蓮木分布,但經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所(以下簡稱廣西植物研究所)科研人員實(shí)地調(diào)查,未發(fā)現(xiàn)該物種;在廣東,合柱金蓮木原見于懷集、連山、封開、廣寧、海陵島等地,但廣東省林業(yè)局于1999-2001年組織有關(guān)專家對該省國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物資源進(jìn)行調(diào)查時(shí),僅在肇慶的廣東封開黑石頂省級自然保護(hù)區(qū)石門塘發(fā)現(xiàn)有合柱金蓮木分布[7]。然而在2007年,筆者在開展合柱金蓮木遺傳多樣性研究的野外采樣時(shí),發(fā)現(xiàn)連山、封開、廣寧尚有合柱金蓮木存在,只是其種群個(gè)體數(shù)量較少,其中廣寧采樣點(diǎn)只采到9個(gè)樣[8]。但筆者在2013年進(jìn)行合柱金蓮木的伴生群落調(diào)查時(shí)[2],在廣寧原采樣點(diǎn)已找不到合柱金蓮木植株。目前在《中國植物紅皮書(第一冊)》[9]和《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》[10]中,合柱金蓮木分別被列為二類保護(hù)植物和國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物。

微衛(wèi)星又稱簡單串聯(lián)重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)或短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeat,STR),是以1-6 bp的堿基重復(fù)單元組成的串聯(lián)重復(fù)序列。因具有數(shù)量多、豐富度高、易于檢測等特點(diǎn),微衛(wèi)星被廣泛用作遺傳差異的標(biāo)記[11]。目前已有不少基于微衛(wèi)星技術(shù)的交配系統(tǒng)的研究,如羅芊芊等[12]運(yùn)用12對微衛(wèi)星引物對2個(gè)南方紅豆杉(Taxuswallichianavar.mairei)天然居群的交配系統(tǒng)進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉屬于高度異交樹種;Liesebach等[13]基于微衛(wèi)星對挪威楓(Acerplatanoides)種子園親本無性系及其種子樣本進(jìn)行基因分型檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)挪威楓有68%的異交后代、11%的自交后代和20%的外部授粉后代。

植物的開花結(jié)實(shí)物候及交配系統(tǒng)屬于繁殖生物學(xué)范疇,是植物在自然狀態(tài)下對環(huán)境長期適應(yīng)而演化出的主要生殖特征。對于大多數(shù)瀕危植物來說,在繁殖過程中通常會觀察到生殖障礙[14],而生殖障礙是導(dǎo)致部分植物瀕危的重要原因[15-18]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中有關(guān)合柱金蓮木的研究報(bào)道十分有限,僅見有關(guān)形態(tài)[4]、生境條件[1]、藥用價(jià)值描述[3],以及種子萌發(fā)特性[19]、扦插繁殖[20]和伴生群落特征[2]的研究,而繁殖生物學(xué)方面的開花結(jié)實(shí)物候及交配系統(tǒng)研究迄今未見報(bào)道。鑒于微衛(wèi)星是分析交配系統(tǒng)較好的分子手段,本研究開展合柱金蓮木的開花結(jié)實(shí)物候觀測并利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記測定其交配系統(tǒng),擬從繁殖生物學(xué)角度探討其瀕危機(jī)制,為其保護(hù)和可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 分布點(diǎn)自然概況

合柱金蓮木分布區(qū)位于南亞熱帶北緣及中亞熱帶南緣。分布區(qū)內(nèi)雨量多、濕度大,年平均氣溫18-20 ℃,最冷月平均氣溫9-11 ℃,最熱月平均氣溫約28 ℃,全年無霜期250-310 d,年降水量1 400-1 600 mm,相對濕度為75%-85%。土壤為山地紅壤和谷底沖積土,成土母巖以花崗巖、頁巖、砂巖為主,土層厚度0.6-1.2 m,腐殖質(zhì)層厚5-30 cm[2]。合柱金蓮木為林下陰生植物,不耐強(qiáng)光和干旱,常生于土壤濕潤且郁閉度較高的常綠闊葉林中。目前經(jīng)過調(diào)查確認(rèn)廣西融水(S1)、金秀(S2)、德保(S3)和廣東封開(S4)、連山(S5) 5個(gè)縣存在小塊區(qū)域的合柱金蓮木種群,各分布點(diǎn)概況見表1和圖1。

圖1 合柱金蓮木野外分布點(diǎn)

表1 合柱金蓮木各分布點(diǎn)的基本概況

1.2 材料及試驗(yàn)地點(diǎn)

植株材料經(jīng)廣西植物研究所蔣運(yùn)生研究員鑒定為合柱金蓮木(Sauvagesiarhodoleaca)(圖2)。本研究選擇S2和S3兩個(gè)合柱金蓮木分布點(diǎn)作為野外試驗(yàn)點(diǎn),成齡植株的基本形態(tài)特征及其開花結(jié)實(shí)物候期觀測在上述兩處試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行;單花開花動(dòng)態(tài)、生殖構(gòu)件特征的觀測在S2分布點(diǎn)進(jìn)行。交配系統(tǒng)研究在廣西植物研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,樣品(葉片和種子)分別采自S1、S2、S3、S4和S5 5個(gè)合柱金蓮木分布點(diǎn),引物為Li等[8]開發(fā)的9對合柱金蓮木微衛(wèi)星引物(SSR1、SSR3-SSR11),將其送到上海英駿生物技術(shù)有限公司合成熒光引物,采用羧基熒光素(Carboxyfluorescein,FAM)和六氯熒光素(Hexachloro-fluorescein,HEX )標(biāo)記不同引物的正向引物。

1:fruit branch;2:enlargement of leaf;3:sepal;4:petal;5:external whorl of staminodes;6:second whorl of staminodes;7:inner whorl of staminodes;8:stamen;9:pistil;10:fruit;11:seed.

1.3 方法

1.3.1 成齡植株的基本形態(tài)特征及開花結(jié)實(shí)物候期觀測

本研究將已花合柱金蓮木視為成齡植株。在花蕾期,于觀測點(diǎn)隨機(jī)標(biāo)記成齡合柱金蓮木30株,統(tǒng)計(jì)叢生植株的比例,并測定各植株的地徑(叢生植株測定其最大分枝)、株高、冠幅,統(tǒng)計(jì)每株植株的花序數(shù)。此外,初步觀測和判斷合柱金蓮木的生育期。根據(jù)生育期,于次年3-10月以上年標(biāo)記的植株為對象進(jìn)行開花結(jié)實(shí)物候期觀測,每5 d觀察1次。結(jié)合Dafni[21]和柴勝豐等[22]的研究確定花期觀察標(biāo)準(zhǔn):約5%的植株抽出花序的時(shí)期為抽(花)序期;平均單株開花數(shù)約達(dá)5%的時(shí)期為始花期,約達(dá)50%為盛花期,大于90%為末花期。

1.3.2 開花動(dòng)態(tài)觀測

在合柱金蓮木花蕾期,于觀測點(diǎn)隨機(jī)選取15株植株上的30串未開放的花序進(jìn)行標(biāo)記,觀察花序單花的開放順序和開花天數(shù);隨機(jī)選取成齡合柱金蓮木5株,每株植株選定5朵剛現(xiàn)的花蕾作為單花開放動(dòng)態(tài)的觀測對象,每2-3 d觀察1次,直至花朵開放?；ǘ溟_放當(dāng)天,每隔10-15 min觀測1次。此后,每天觀測1次,直至花朵脫落。

1.3.3 生殖構(gòu)件特征的觀測

在合柱金蓮木盛花期,隨機(jī)選定花序30串,對花序柄長、花序軸長、花序?qū)?花序最寬處的值)及花序的單花數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采集成熟花蕾30朵,統(tǒng)計(jì)其苞長和苞寬(花苞最寬處的值)。采集盛開單花30朵,統(tǒng)計(jì)其花冠直徑、花瓣數(shù)、花瓣長度和寬度(花瓣最寬處的值)、萼片數(shù)、萼片長度和寬度(萼片最寬處的值)、花柄長度及直徑、子房直徑等;在果期,隨機(jī)選定成熟果序30串,對果序柄基徑、果序柄長、果序軸長、果序?qū)?果序最寬處的值)及果序的蒴果數(shù)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采集成熟蒴果30粒,統(tǒng)計(jì)果球縱橫徑、果柄長度及直徑、蒴果的種子數(shù)、種子縱橫徑及種子千粒重等。以《中國植物志(第四十九卷第二分冊)》[6]和《廣西植物志(第一卷)》[5]有關(guān)合柱金蓮木形態(tài)學(xué)特征的描述為參考,結(jié)合觀測結(jié)果對合柱金蓮木的生殖構(gòu)件特征進(jìn)行詳細(xì)描述。

1.3.4 交配系統(tǒng)檢測

于合柱金蓮木種子成熟期,對S1、S2、S3、S4和S5 5個(gè)分布點(diǎn)進(jìn)行樣品采集:每個(gè)分布點(diǎn)選30株成齡植株采集鮮葉片和種子,每一單株及其種子組成一個(gè)家系(Family),采樣時(shí),對各家系的母株及種子進(jìn)行標(biāo)記和編號。單株鮮葉采集后迅速裝入封口袋,加硅膠進(jìn)行干燥;種子帶回實(shí)驗(yàn)室用于培養(yǎng)幼苗,所培養(yǎng)的幼苗及其對應(yīng)的母株葉片用于DNA提取。

采用十六烷基三甲基溴化銨法(Cetyltrimethylammonium Bromide,CTAB)[23]提取DNA,基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記試驗(yàn)對合柱金蓮木進(jìn)行交配系統(tǒng)檢測,利用9對SSR引物對所培養(yǎng)出的合柱金蓮木幼苗及其對應(yīng)母株的DNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為15 μL,包括1×Buffer,2.0 mmol/L MgCl2,4種dNTP各0.3 mmol/L,正、反向引物各0.75 μmol/L,0.75 U Taq酶,10 ng模版DNA。擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。為節(jié)省經(jīng)費(fèi),筆者把不同熒光標(biāo)記引物混合在一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增,或者當(dāng)兩個(gè)以上(含兩個(gè))引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度片段相差至少50 bp時(shí),同樣熒光標(biāo)記的引物也放在一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增,接著將兩種方式的擴(kuò)增產(chǎn)物在3037xl DNA分析儀(美國賽默飛世爾科技公司)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳,最后采用Genemarker 2.2.0軟件分析目標(biāo)片段大小。

1.3.5 參數(shù)處理與數(shù)據(jù)分析

1.3.5.1 基本形態(tài)特征參數(shù)

采用SPSS 13.0軟件對S2和S3兩個(gè)分布點(diǎn)的合柱金蓮木成齡植株的基本形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行t檢驗(yàn),顯著性水平設(shè)為0.05。描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.)、平均值(Mean)表示。

1.3.5.2 交配系統(tǒng)參數(shù)的計(jì)算

用GenALEx 6軟件[24]計(jì)算合柱金蓮木的近交系數(shù)理論推算值(F1)以衡量其是否偏離Hardy-Weinbery平衡,并根據(jù)F1計(jì)算理論預(yù)期異交率(te),te=(1-F1)/(1+F1)[25];用MLTR 3.4統(tǒng)計(jì)軟件[26,27]計(jì)算合柱金蓮木母代和子代的多位點(diǎn)異交率(tm)和單位點(diǎn)異交率(ts)、雙親近交系數(shù)(tm-ts)、多位點(diǎn)相關(guān)度(rpm)、單位點(diǎn)相關(guān)度(rps)、異交率相關(guān)性(rt)、親本近交系數(shù)當(dāng)代估算值(F)以及親本相關(guān)性(rp);根據(jù)Ritland[28]和趙耀等[29]的估算方法,使用tm和F值估計(jì)近交衰退系數(shù)(δ),δ=1-2Ftm/(1-tm)(1-F)。描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)、平均值(Mean)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 成齡植株的基本形態(tài)特征及其開花結(jié)實(shí)物候期

從表2可知,成齡合柱金蓮木植株的平均地徑、平均株高和平均冠幅分別為0.70、129.67和81.98 cm,平均每株結(jié)花序15.56串,有一定比例的成齡植株為叢生植株。與S3分布點(diǎn)相比,S2分布點(diǎn)的成齡植株更大(地徑、株高和冠幅的數(shù)值更大)、平均每株花序數(shù)更多,但差異不顯著(P>0.05)。而S2分布點(diǎn)的平均每叢枝數(shù)顯著大于S3(P<0.05)。

表2 不同分布點(diǎn)合柱金蓮木成齡植株的基本形態(tài)特征

成齡合柱金蓮木在3月下旬至4月中上旬進(jìn)入抽(花)序期,4月中下旬進(jìn)入現(xiàn)蕾期,5月中上旬為現(xiàn)蕾末期,4月下旬至5月上旬進(jìn)入始花期,5月中上旬達(dá)到盛花期,5月中下旬為末花期,花期持續(xù)1個(gè)月左右。合柱金蓮木于5月下旬至6月上旬進(jìn)入果實(shí)發(fā)育期,經(jīng)過60-70 d的生長,果實(shí)進(jìn)入成熟期。不同的分布點(diǎn),合柱金蓮木的開花結(jié)實(shí)物候期存在一些差異,S3分布點(diǎn)的物候期比S2分布點(diǎn)提前10 d左右(表3)。

表3 合柱金蓮木開花結(jié)實(shí)物候期

2.2 開花動(dòng)態(tài)

合柱金蓮木的花序單生于枝條上部的葉腋。進(jìn)入抽序期后,隨著花序軸的生長,其基部一般會產(chǎn)生側(cè)枝,中上部及基部的側(cè)枝不斷離心產(chǎn)生叢生花蕾。合柱金蓮木花蕾的開放順序一般為花序下部的花蕾先開放,然后往上逐漸開放,偶見花序上部的花蕾先于下部花蕾開放的現(xiàn)象。合柱金蓮木的單花開放過程可分為蕾松、初開、盛開和落花4個(gè)階段。從現(xiàn)蕾開始,單花經(jīng)過15-20 d的孕蕾期(圖3:1-5)后膨脹到了極限,原來緊緊包裹的花瓣開始逐漸松開,花朵進(jìn)入蕾松期(圖3:6);花瓣繼續(xù)松動(dòng),花蕾頂端裂開出現(xiàn)“小口”,此時(shí)花瓣與雌蕊之間的夾角呈10°左右,花瓣內(nèi)拱,從“小口”可見退化雄蕊中輪的中上端,此為初開階段(圖3:7);花朵繼續(xù)開放,花瓣向外伸展,與雌蕊的夾角呈70°左右,并呈碗狀內(nèi)拱,退化雄蕊中輪及外輪完全展現(xiàn)出來,此為盛開階段(圖3:8);花瓣外翻、脫落,部分單花開始凋落,部分單花轉(zhuǎn)入子房膨大期,此為落花階段(圖3:9-11)。單花開放1 d內(nèi)完成,從蕾松階段到初開階段約10 min,從初開階段到盛開階段約30 min,從盛開階段到脫落階段約5 h。脫落的單花從花瓣外翻到整個(gè)單花徹底脫落需要1-2 d,而不脫落的轉(zhuǎn)入子房膨大期的單花(圖3:12),其子房迅速膨脹,果實(shí)迅速生長,至花瓣外翻后的第15-20天,蒴果基本成型,花萼附在子房上相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)不萎蔫凋落(圖4)。

1-5:budding stage; 6:bud loosening stage; 7:early flowering; 8:flowering stage; 9-11:wilt stage; 12:ovary growth stage.

圖4 合柱金蓮木單花子房膨脹進(jìn)程

2.3 生殖構(gòu)件特征

合柱金蓮木的花序呈狹圓錐狀,花序軸長約6.28 cm,花序?qū)捈s3.35 cm,花序柄長約2.91 cm,每串花序約有27朵單花;合柱金蓮木的幼蕾呈圓錐形,成熟花蕾呈長圓錐形,苞長約7.61 mm,苞寬約3.12 mm;盛開單花的花冠直徑約1.61 cm,花柄長約1.06 cm,花柄基徑約0.21 mm。單花有萼片5枚,淺青色,呈卵形或披針形,長約4.49 mm,寬約1.78 mm,邊緣有柔毛且呈鋸齒狀(圖5:1);花瓣5枚,橢圓形,長約8.57 mm,寬約3.13 mm,其上部為白色,基部為橙黃色,白色部分占花瓣面積的5/6左右(圖5:2)。盛開單花顯示萼片與花瓣交互輪生(圖3:8,9)。退化雄蕊3輪,外輪基部連合生成一短管,上部分離呈腺體狀,高約2.21 mm,中輪和內(nèi)輪各5枚,均為花瓣?duì)?長橢圓形,上部為白色,基部為橙黃色,白色部分占中輪和內(nèi)輪面積的5/6左右,中輪略大于內(nèi)輪,中輪的高度和寬度分別為5.92 mm和1.18 mm,內(nèi)輪的高度和寬度分別為5.53 mm和0.97 mm(圖5:3-5)。合柱金蓮木的單花同時(shí)具有雌蕊和雄蕊(圖2:8,9;圖5:6,7),為兩性花。發(fā)育雄蕊5枚,花絲極短,花藥長2.05 mm,寬0.91 mm(圖5:6);子房卵形,縱徑約1.86 mm,橫徑約0.91 mm,花柱長約5.25 mm,呈尾狀漸尖,柱頭小(圖5:7)。發(fā)育雄蕊、子房及花柱被退化雄蕊的中輪和內(nèi)輪所包裹,只有柱頭尖端露出(圖3:8-11)。

1:sepals;2:petals;3:external whorl of staminodes;4:second whorl of staminodes;5:inner whorl of staminodes;6:stamens (filaments,anthers);7:pistil,ovary,flower stalk.

合柱金蓮木的果序軸長約8.75 cm,果序?qū)捈s5.08 cm,果序柄基徑約0.83 mm,果序柄長約4.66 cm,果序軸上的分穗(叢)數(shù)(總軸上的分枝數(shù)與叢生蒴果叢數(shù)之和)約11穗(叢),每串果序約有18個(gè)蒴果;蒴果卵球形,先端具宿存的細(xì)長花柱,果皮上有3道凹槽,成熟蒴果開裂時(shí),從其先端順凹槽下裂,先端形成嘴狀裂口,種子可從裂口掉出。蒴果果球縱徑約4.94 mm,橫徑約4.36 mm,蒴果千粒重(干重)約18.24 g,單果種子數(shù)約21粒;種子橢圓形,縱徑約1.52 mm,橫徑約0.78 mm。種皮硬而脆,呈暗紅色。種子千粒重(干重)約0.61 g。

按照每株15.56串花序(果序)(表2),每串花序(果序)18個(gè)蒴果,每個(gè)蒴果21粒種子,則平均每株成齡合柱金蓮木的種子數(shù)為15.56×18×21=5 881.68粒。

2.4 交配系統(tǒng)分析

2.4.1 熒光引物PCR的檢測結(jié)果

采集用于交配系統(tǒng)研究的合柱金蓮木種子,最終培養(yǎng)到35株幼苗,對應(yīng)17株母株(即17個(gè)家系),所有家系的成員合計(jì)52個(gè)個(gè)體,9對熒光引物在52個(gè)個(gè)體上共檢測到140個(gè)等位基因,每個(gè)等位基因的片段大小為107-345 bp不等。下圖為其中一個(gè)合柱金蓮木DNA樣本分別在兩對熒光引物(熒光素分別為FAM和HEX)上擴(kuò)增的結(jié)果(圖6),圖6(a)和6(b)相對應(yīng)的基因座分別為雜合子和純合子基因型。

Numerical values in the vertical axis represent fluorescence intensities,and those in the horizontal axis represent the size of the amplified fragment.The appearance of two distinct peaks in (a) indicates that the locus is heterozygous,while the appearance of a single distinct peak in (b) indicates that the locus is homozygous.The horizontal axis values corresponding to each peak in the figure represent the size of their amplified fragments.

2.4.2 交配系統(tǒng)

經(jīng)過培養(yǎng)得到的合柱金蓮木幼苗對應(yīng)的17個(gè)家系分別屬于5個(gè)采樣點(diǎn),每個(gè)采樣點(diǎn)的家系數(shù)目3-4個(gè)。鑒于每個(gè)采樣點(diǎn)的家系數(shù)目太少,本研究將17個(gè)家系作為整體來分析合柱金蓮木的交配系統(tǒng),其結(jié)果見表4。

表4 合柱金蓮木的交配系統(tǒng)參數(shù)

從近交系數(shù)理論推算值(F1=0.171)來看,合柱金蓮木在理論上偏離了Hardy-Weinbery平衡,在物種水平上有過剩的純合子;而從親本近交系數(shù)當(dāng)代估算值(F=-0.032)來看,合柱金蓮木在物種水平上接近隨機(jī)交配,但從該估算值的標(biāo)準(zhǔn)差(0.136,該數(shù)值比較大)來看,可知該物種的部分種群偏離Hardy-Weinbery平衡,部分種群存在近親交配。

合柱金蓮木的預(yù)期異交率(te)、多位點(diǎn)異交率(tm)和單位點(diǎn)異交率(ts)分別為0.709、0.982和0.752。tm與ts的差值反映雙親近交程度,合柱金蓮木多位點(diǎn)異交率高于單位點(diǎn)異交率,即tm-ts=0.230>0,說明在物種水平上合柱金蓮木存在一定比例的近交(雙親的近交比例為0.230)。

合柱金蓮木物種水平上的多位點(diǎn)相關(guān)度(rpm)和單位點(diǎn)相關(guān)度(rps)分別為0.272和0.314,其單位點(diǎn)相關(guān)度大于多位點(diǎn)相關(guān)度(rps-rpm=0.042>0),說明物種內(nèi)部存在明顯分化的種群遺傳結(jié)構(gòu)。異交子代間親本相關(guān)性(rp)為0.213,表明部分子代共享了親本。近交衰退系數(shù)(δ)大于0,說明合柱金蓮木在物種水平上存在近交衰退。

3 討論

合柱金蓮木的花為圓錐花序,平均每株成齡植株的花序數(shù)量為15串左右,花序單花數(shù)平均達(dá)27朵。合柱金蓮木的單花開放在1 d內(nèi)完成,但因單花開放不同步,其花期長達(dá)1個(gè)多月。這種集成花序結(jié)構(gòu)的花,開花持續(xù)時(shí)間長且不同步,一方面保證植株在較長的時(shí)間內(nèi)能成功完成異花傳粉受精過程,從而保證生殖成功;另一方面也可降低花期惡劣的自然環(huán)境對其生殖成功造成的不良影響,這是部分植物長期適應(yīng)環(huán)境影響所形成的一種生殖策略[30]。從種子量來看,合柱金蓮木的花采取的集成花序結(jié)構(gòu)策略是成功的,合柱金蓮木的平均每串果序的蒴果數(shù)約18個(gè),每個(gè)蒴果的種子數(shù)約21粒,平均每株的種子數(shù)達(dá)5 881.68粒,種子數(shù)量極大。

合柱金蓮木的發(fā)育雄蕊與雌蕊異長,花藥遠(yuǎn)低于花柱,它們被包裹于退化雄蕊的中內(nèi)輪當(dāng)中,只有柱頭露出(圖3:8-11)。一個(gè)值得注意的問題是,筆者在對單花開放過程的觀測中,未發(fā)現(xiàn)任何有退化雄蕊中內(nèi)輪展開的單花,但偶見有蜂類訪花,可未見訪花者長有可插入退化雄蕊的中內(nèi)輪當(dāng)中的長喙,被訪過的單花的退化雄蕊的中內(nèi)輪亦未見有被咬破或咬開的情況。由于花藥被包裹于退化雄蕊的中內(nèi)輪當(dāng)中,退化雄蕊的中內(nèi)輪不展開且不被昆蟲咬破或咬開,其花粉應(yīng)是難以散發(fā)出來的,而其柱頭露在退化雄蕊中內(nèi)輪外面,花粉如何傳授到柱頭,這是一個(gè)目前未弄明白的問題。因其單花太小,筆者做兩次套袋試驗(yàn)均未成功,通過一些傳統(tǒng)的方法來確定其交配類型比較困難。由于合柱金蓮木退化雄蕊中內(nèi)輪將花藥包裹得較為嚴(yán)實(shí),風(fēng)應(yīng)難以將花粉吹散出來。因此,合柱金蓮木是否存在不經(jīng)授粉的無融合生殖或自花授粉(可能在雌蕊柱頭伸出退化雄蕊中內(nèi)輪之前已完成授粉)或其他筆者未觀測到的異花授粉行為,還需進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果顯示,合柱金蓮木在理論上偏離了Hardy-Weinbery平衡,在物種水平上有過剩的純合子,部分種群存在近親交配。這一研究結(jié)果支持了Li等[8]關(guān)于合柱金蓮木種群存在近親交配的研究結(jié)論。本研究顯示合柱金蓮木物種水平上的近交系數(shù)理論推算值為0.171,小于Li等[8]關(guān)于合柱金蓮木各種群的近交系數(shù)理論推算值為0.464-0.950的研究結(jié)果。一般來講,物種水平上的近交系數(shù)比種群水平上的低屬正常;另外,由于Li等[8]的研究是采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法結(jié)合人工讀帶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行相關(guān)分析,而本研究是采用毛細(xì)管電泳法結(jié)合Genemarker 2.2.0軟件來分析目標(biāo)片段大小,人工讀帶可能出現(xiàn)偏差從而使兩個(gè)研究結(jié)果存在差異。

交配系統(tǒng)是物種的基本屬性,交配系統(tǒng)中的自交(或近交)程度受很多因素的影響,而這些因素與物種種群的大小密切相關(guān)。小種群因交配對象少,導(dǎo)致自交和近交概率明顯增加[31,32],多種小種群物種如蒜頭果(Malaniaoleifera)[33]、細(xì)葉楊(Populusilicifolia)[34]、龍棕(Trachycarpusnanus)[35]存在自交或近交現(xiàn)象。合柱金蓮木現(xiàn)有的幾個(gè)分布點(diǎn)的種群規(guī)模都十分小,各分布點(diǎn)的個(gè)體數(shù)量十分有限。目前尚不清楚合柱金蓮木的遺傳物質(zhì)如何在不同的種群間傳播,但由于合柱金蓮木分布區(qū)地形復(fù)雜,種群之間被連綿的山地或丘陵隔離,且存在一定的地理距離,地理上的物理隔離勢必會給合柱金蓮木種群間的遺傳物質(zhì)交流帶來困難。合柱金蓮木的種群間缺乏基因流,交配只能在個(gè)體數(shù)十分有限的種群內(nèi)進(jìn)行,有限的種群個(gè)體自然增加了合柱金蓮木的自交或近交概率。另外,種群間缺乏基因流,使得合柱金蓮木種群間難免出現(xiàn)遺傳分化,從而使該物種內(nèi)部出現(xiàn)明顯分化的種群遺傳結(jié)構(gòu)。

許多珍稀瀕危植物在惡劣環(huán)境下,為防止滅絕而采用近交策略來增加后代個(gè)體數(shù)[36]。對于植物來說,近交可以提高種群對片段化生境的適應(yīng)性、減輕傳粉媒介數(shù)量不足等影響[37],但近交也會導(dǎo)致遺傳多樣性喪失,最終失去生存和發(fā)展的基礎(chǔ)[38,39]。長期近交會引起近交衰退從而使后代的生存能力下降,在遇到環(huán)境波動(dòng)時(shí)很容易滅絕[40]。瀕危植物的遺傳多樣性通常比較低,生態(tài)適應(yīng)幅度狹窄,近交會致使其種群適應(yīng)能力進(jìn)一步下降,并使得有限的遺傳多樣性進(jìn)一步喪失,從而加劇瀕危程度。合柱金蓮木遺傳多樣性低[8,41,42]且存在近交,且本研究檢測到合柱金蓮木在物種水平上存在近交衰退(δ=4.332>0),因此交配系統(tǒng)中存在一定程度的近交可能是合柱金蓮木瀕危的重要因素之一。

4 結(jié)論

成齡合柱金蓮木植株平均地徑、平均株高和平均冠幅分別為0.70、129.67和81.98 cm,平均每株結(jié)花序15.56串,有一定比例的成齡植株為叢生植株。與S3分布點(diǎn)相比,S2分布點(diǎn)的成齡植株更大、平均每株花序數(shù)更多。合柱金蓮木于3月下旬至4月中上旬進(jìn)入抽(花)序期,4月中下旬進(jìn)入現(xiàn)蕾期,4月下旬至5月中下旬為開花期,5月下旬至6月上旬進(jìn)入果實(shí)發(fā)育期,再經(jīng)過60-70 d的生長,果實(shí)進(jìn)入成熟期。合柱金蓮木的單花開放在1 d內(nèi)完成,其花序的單花數(shù)約為27朵/串,果序的蒴果數(shù)約為18個(gè)/串,結(jié)果植株平均每株的種子數(shù)達(dá)5 881.68粒,種子量極大。

合柱金蓮木在理論上偏離了Hardy-Weinbery平衡,在物種水平上有過剩的純合子。此外,合柱金蓮木的多位點(diǎn)異交率(tm=0.982)高于單位點(diǎn)異交率(ts=0.752),說明在物種水平上合柱金蓮木存在一定比例的近交,雙親的近交比例為0.230,且存在近交衰退(δ=4.332>0)。合柱金蓮木在物種水平上的多位點(diǎn)相關(guān)度(rpm)和單位點(diǎn)相關(guān)度(rps)分別為0.272和0.314,其物種內(nèi)部存在明顯分化的種群遺傳結(jié)構(gòu),其異交子代間親本相關(guān)性(rp)為0.213,表明部分子代共享了親本。交配系統(tǒng)中存在一定程度的近交可能是合柱金蓮木瀕危的重要因素之一。