水稻田原位富集檸檬酸桿菌關(guān)鍵影響因子的優(yōu)化

李一路， 程 偉， 張 敏， 郭照輝， 王玉雙， 魏小武， 伍善東， 單世平

(湖南省微生物研究院， 湖南 長沙 410009)

0 引言

【研究意義】硫酸鹽還原細菌(Sulfate-reducing bacterium)是一類厭氧或兼性厭氧菌，廣泛分布于土壤、湖泊和海洋中。硫酸鹽還原細菌能夠利用硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽甚至元素硫作為電子受體，參與自然界中元素硫的循環(huán)，產(chǎn)生的硫化物可以與重金屬結(jié)合形成沉淀，從而達到鈍化重金屬的目的[1-2]。檸檬酸桿菌是一類非傳統(tǒng)的硫酸鹽還原細菌，具有硫酸鹽還原活性，在厭氧和微氧環(huán)境下均可還原硫酸鹽[3-4]。利用微生物進行重金屬污染土壤的原位修復，關(guān)鍵是目標菌株在土壤中的定殖和富集。目前通常是采取菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)，然后向土壤中接種發(fā)酵菌懸液[5]。作為土壤中的非土著優(yōu)勢菌群，將發(fā)酵培養(yǎng)的菌液直接加入土壤，其存活率并不確定。因此，探明檸檬酸桿菌原位富集的關(guān)鍵影響因子，并通過調(diào)整土壤中的理化因子來提高原位富集土壤中的檸檬酸桿菌，對利用檸檬酸桿菌進行鎘污染稻田的原位修復具有重要的現(xiàn)實意義。【前人研究進展】目前，檸檬酸桿菌被廣泛用于廢水處理，如WANG等[6]篩選出1株檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)JPG1，可以有效去除廢水中的銅離子。楊晶[7]采用檸檬酸桿菌吸附重金屬鎘(Cd)。周玉杰[8]通過包埋檸檬酸桿菌有效去除廢水中的萘、菲。湖南省微生物研究院植物保護課題組從Cd污染土壤中分離出檸檬酸桿菌菌株XT1-2-2，能鈍化土壤中的Cd，降低水稻對Cd的吸收[9]?！狙芯壳腥朦c】目前，利用微生物原位修復土壤重金屬污染基本上在實驗室階段，大田應用和產(chǎn)品生產(chǎn)方面相對薄弱，而通過調(diào)整土壤理化因子高效富集具有鈍化重金屬功能的微生物的研究鮮有報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以檸檬酸桿菌菌株XT1-2-2為目標菌株，通過單因子和正交試驗，考察碳源、硫源、亞鐵離子和有機質(zhì)對土壤pH、菌株XT1-2-2數(shù)量、硫酸鹽還原活性(SRA)以及土壤有效鎘含量的影響，以期找到原位富集XT1-2-2的關(guān)鍵影響因子及最優(yōu)配比，為今后采用菌株XT1-2-2修復重金屬污染土壤提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用土壤采集于益陽水稻試驗田，去除明顯的碎石、有機殘留物，風干粉碎后過20目篩，稱重100 g裝于三角瓶中，125℃滅菌2次，每次2 h，加入適量的滅菌水混勻，保持土壤處于淹水狀態(tài)，分別加入等量的XT1-2-2菌懸液，攪拌均勻，試驗前對土壤中的XT1-2-2進行計數(shù)統(tǒng)計。

土壤基本理化性質(zhì)為pH 5.98，總氮1.97 g/kg，總鉀2.06 g/kg，總磷0.64 g/kg，堿解氮0.12 g/kg，速效鉀20.9 g/kg，速效磷15.2 mg/kg，有機質(zhì)23.1 mg/kg，全Cd含量0.47 mg/kg，菌株XT1-2-2數(shù)量2.0×105cfu/g。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因子試驗 在裝有土壤及菌株XT1-2-2的三角瓶內(nèi)，分別加入不同碳源(乳酸鈉、丙酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖各2.0 g/kg)、不同硫源(硫酸鈉、硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、單質(zhì)硫、硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸鉀、硫酸銨各2.0 g/kg)、不同有機質(zhì)(統(tǒng)糠、草炭、稻殼炭、有機肥各15.0 g/kg)、不同濃度(1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0 g/kg)亞鐵離子作為試驗組，以不加任何因子的土壤為對照，每處理3個重復。在處理10 d、20 d和30 d時測量土壤的pH、菌株XT1-2-2數(shù)量及SRA活性，并將30 d后的土壤晾干磨碎過20目篩后測有效鎘含量。

1.2.2 正交試驗 結(jié)合以上單因素影響因子對土壤中各項指標的影響，選取4種因素3個水平進行L9(34)正交試驗，每組設(shè)置3個重復。30℃培養(yǎng)箱中靜置30 d后進行土壤pH、菌株XT1-2-2數(shù)量、SRA以及土壤有效鎘測定。

1.2.3 XT1-2-2菌數(shù)計數(shù) 通過硫酸鹽還原菌測試瓶進行計數(shù)。采用絕跡稀釋法，即用無菌注射器將待測定的水樣逐級注入到測試瓶中進行接種稀釋后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)測試瓶陽性反應和稀釋的倍數(shù)，計算水樣中細菌量總數(shù)。

1.2.4 土壤硫酸鹽還原活性(SRA)的測定及計算 參考文獻[10]的方法測定和計算水稻田土壤硫酸鹽還原活性。

1.2.5 土壤中有效鎘的測定 土壤晾干研磨過20目篩后，稱取約0.1 g，用濃HNO3、HClO4和HF(體積比4︰2︰2)混合溶液在180℃高溫板上消解2 h。待消解完全后，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS, Agilent-7500cx)測定Cd濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制，采用SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源處理水稻田土壤性質(zhì)及菌株XT1-2-2的富集

從圖1看出，土壤pH：大部分碳源的加入可以提高土壤pH，隨著處理時間延長，添加有乳酸鈉的土壤pH顯著上升(P<0.05)，處理30 d，與CK相比，pH上升1.6個單位；乙酸鈉和丙酸鈉處理土壤30 d后pH分別較CK升高0.3個和0.2個單位。XT1-2-2菌數(shù)：與CK相比，添加乳酸鈉10 d后，XT1-2-2菌數(shù)顯著增加(P<0.05)2個數(shù)量級，其他處理與CK相比無明顯差異；隨著處理時間延長至20 d，添加乳酸鈉處理的土壤XT1-2-2菌數(shù)穩(wěn)定；丙酸鈉處理的土壤XT1-2-2菌數(shù)增加，且顯著高于CK(P<0.05)；處理30 d后，葡萄糖處理的土壤XT1-2-2菌數(shù)也顯著高于對照(P<0.05)。SRA活性：在整個試驗階段，乳酸鈉處理的土壤SRA活性均顯著增加(P<0.05)；隨著時間延長，丙酸鈉和葡萄糖處理的土壤SRA活性上升，與XT1-2-2菌數(shù)的變化趨勢一致。有效鎘含量：不同碳源處理的土壤有效鎘含量均顯著低于CK(P<0.05)，乳酸鈉、乙酸鈉、丙酸鈉和葡萄糖處理后土壤有效鎘含量分別下降22.1%、13.3%、14.2%和16.1%。說明，碳源影響土壤中XT1-2-2菌富集，以乳酸鈉的效果最明顯，隨時間延長，丙酸鈉的影響程度逐漸加強。

注：小寫字母表示相同時間下不同處理在P<0.05上差異顯著，下同。

2.2 不同硫源處理水稻田土壤性質(zhì)及菌株XT 1-2-2的富集

從圖2看出，土壤pH：處理10 d后，所有硫源處理的土壤pH均低于CK，隨著時間延長，土壤pH呈先降低后上升趨勢，且除單質(zhì)硫處理外，其他硫源處理的土壤pH均高于CK，其中硫酸鈉和亞硫酸鈉處理的土壤pH增幅最大。XT1-2-2菌數(shù)：處理10 d后，土壤中菌株XT1-2-2數(shù)量快速增至最大值，除硫酸鈣和硫酸鉀處理外，其他硫源處理的土壤菌株XT1-2-2數(shù)量均顯著高于CK(P<0.05)，其中亞硫酸鈉處理的土壤，菌數(shù)由2.5×105cfu/g增至1.1×107cfu/g，增加2個數(shù)量級，增幅最大；其次是硫代硫酸鈉、單質(zhì)硫和硫酸銨。隨著處理時間延長，菌數(shù)均不同程度的減少，亞硫酸鈉處理土壤后，菌株XT1-2-2均顯著高于CK(P<0.05)。SRA活性：處理10 d后，所有硫源處理的SRA活性均顯著高于CK(P<0.05)，但隨時間延長，SRA活性有所降低，到處理30 d，僅亞硫酸鈉和硫酸鉀處理的土壤SRA顯著高于對照(P<0.05)。有效鎘含量：不同硫源處理土壤30 d后，與CK相比，土壤中有效鎘含量均顯著降低(P<0.05)，下降幅度為28%～32%。說明，硫源中亞硫酸鈉對土壤中菌株XT1-2-2富集影響最大。

2.3 不同有機質(zhì)處理水稻田土壤性質(zhì)及菌株XT1-2-2的富集

從圖3看出，土壤pH：與CK相比，處理10 d后，稻殼炭、草炭和有機肥對提高土壤的pH效果較好；處理20 d，除統(tǒng)糠外，各處理間的pH均接近7.0，差異不顯著；處理30 d后，各處理的pH均升至7.5～7.6；添加有機質(zhì)對提高土壤的pH效果不明顯。XT1-2-2菌數(shù)：添加有機質(zhì)處理土壤后，菌株XT1-2-2數(shù)量有變化，且各時間段變化不一致，處理前20 d，添加草炭、稻殼炭和統(tǒng)糠后，菌株XT1-2-2數(shù)量均高于CK，但處理30 d后，僅稻殼炭和有機肥處理的菌數(shù)增長明顯，尤其是有機肥處理30 d后，XT1-2-2數(shù)量增加1個數(shù)量級。SRA活性：有機質(zhì)對土壤中SRA活性的影響趨勢跟菌株XT1-2-2數(shù)量變化一致。有效鎘含量：添加有機質(zhì)對降低土壤中有效鎘含量效果顯著，添加草炭、稻殼炭、統(tǒng)糠和有機肥處理30 d后，土壤中有效鎘含量分別降低53%、49%、56%和52%。說明，有機質(zhì)對土壤有效鎘含量影響較大，綜合pH、菌株XT1-2-2A菌數(shù)和SRA變化可考慮選擇有機肥和草炭作為最佳有機質(zhì)。

圖3 不同有機質(zhì)處理土壤的pH、XT1-2-2 菌數(shù)、SRA活性及有效鎘含量

2.4 不同濃度亞鐵離子處理水稻田土壤性質(zhì)及菌株XT 1-2-2的富集

從圖4看出，土壤pH：隨著處理時間延長，各處理土壤pH均呈上升趨勢，在處理30 d后，亞鐵離子2.0 g/kg處理的土壤pH最高至7.7。XT1-2-2菌數(shù)：隨著處理時間延長，菌株XT1-2-2數(shù)量均呈先上升后下降趨勢，處理30 d后，4.0 g/kg的亞鐵離子對XT1-2-2菌數(shù)影響最大。土壤SRA活性：處理前20 d，8.0 g/kg的亞鐵離子處理土壤SRA活性最強；處理30 d，4.0g/kg的亞鐵離子處理土壤SRA活性顯著高于CK(P<0.05)。有效鎘含量：添加1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg和8.0 g/kg硫酸亞鐵銨處理30 d后，土壤中有效鎘含量分別降低56%、65%、71%和65%，與CK相比差異顯著(P<0.05)。

圖4 不同濃度亞鐵離子處理土壤的pH、XT1-2-2 菌數(shù)、 SRA活性及有效鎘含量

2.5 土壤中原位富集菌株XT 1-2-2不同影響因子及水平的正交試驗

正交試驗因素和水平見表1。從圖5可看出影響土壤中原位富集菌株XT1-2-2各因素的主次順序、最優(yōu)水平及組合。對土壤pH而言，碳源是最主要的影響因素，各因素的主次順序為A>B>D>C，最優(yōu)組合為A2B1C3D3。這與單獨碳源處理結(jié)果不同，單獨碳源處理土壤30 d后，乳酸鈉提升土壤pH效果最佳。但對比不同的因素組合，pH穩(wěn)定在7.56～7.84。對菌株XT1-2-2數(shù)量和SRA來說，因素的主次順序和最優(yōu)水平具有一致性。硫源是最主要因素，各因素的主次為B>A>C>D，最優(yōu)組合為A2B2C1D1。亞硫酸鈉處理的土壤，其菌株XT1-2-2數(shù)量最多，硫酸鹽還原活性也最大，與單獨硫源處理的結(jié)果一致。對降低土壤有效鎘影響最大的因素也是硫源，其次為有機質(zhì)，各因素的主次為B>D>C>A，最優(yōu)組合為A2(A3)B2C1(C2)D1。硫源是影響菌株XT1-2-2數(shù)量和SRA的最主要因素，同時也是影響有效鎘含量的最主要因素，說明菌株XT1-2-2數(shù)量和SRA活性與土壤有效鎘含量密切相關(guān)。綜合分析，原位富集水稻中的菌株XT1-2-2數(shù)量關(guān)鍵因子強度順序為硫源、碳源、亞鐵離子、有機質(zhì)。最佳富集因子組合為亞硫酸鈉2 g/kg、丙酸鈉2 g/kg、亞鐵離子4 g/kg、草炭15 g/kg。

表1 土壤中原位富集硫酸鹽還原菌 L9 (34) 正交試驗因素及水平

圖5 4種因素不同水平下土壤的 pH、菌株 XT 1-2-2的數(shù)量、 SRA活性以及土壤有效鎘含量

3 討論

檸檬酸桿菌菌株XT1-2-2來自Cd污染稻田土，具有硫酸鹽還原活性[9]，可參與土壤中硫循環(huán)，其代謝產(chǎn)物可以與重金屬離子絡(luò)合成硫化物沉淀，在重金屬污染修復方面發(fā)揮著重要作物[11]。探討不同理化因子與土壤原位富集菌株XT1-2-2數(shù)量、還原活性乃至降Cd能力的關(guān)聯(lián)，能夠為今后進一步開展采用菌株XT1-2-2修復重金屬污染土壤提供一定的技術(shù)支撐和方法。目前，關(guān)于具有硫酸鹽還原特性菌株培養(yǎng)富集的研究多在液體發(fā)酵工藝上[12-13]。本研究模擬稻田土淹水環(huán)境，考察各因素對土壤pH、菌株XT1-2-2數(shù)量、SRA活性以及土壤有效鎘含量的影響。單因子試驗結(jié)果表明，碳源中乳酸鈉的效果最優(yōu)，丙酸鈉其次；硫源中亞硫酸鈉對提高土壤菌株XT1-2-2數(shù)量和SRA的效果最佳；有機質(zhì)對土壤有效鎘含量影響較大，可能是有機質(zhì)本身對Cd有一定的吸附效果，綜合pH、菌株XT1-2-2數(shù)量和SRA活性變化可以考慮選擇有機肥和草炭作為最佳有機質(zhì)；處理30 d后，4.0 g/kg的亞鐵離子對土壤中菌株XT1-2-2數(shù)量和SRA的影響也最大，有效鎘降低效果較好。正交試驗結(jié)果表明，各因子組合間pH為7.56～7.84。影響土壤XT1-2-2菌數(shù)、SRA活性和有效鎘含量的因素大致相同，影響最大的因素均為硫源中的亞硫酸鈉。可能是因為該檸檬酸桿菌也具有亞硫酸鹽還原酶[3]，能夠還原亞硫酸鹽，產(chǎn)生硫化氫，從而與土壤中的Cd離子結(jié)合生成難溶物CdS，進而降低土壤有效鎘含量[14]，具體機理還有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

原位富集稻田土中菌株XT1-2-2數(shù)量的關(guān)鍵因子強度順序為硫源、碳源、亞鐵離子、有機質(zhì)。最佳富集因子組合為亞硫酸鈉2 g/kg、丙酸鈉2 g/kg、亞鐵離子4 g/kg、草炭15 g/kg。該研究為采用檸檬酸桿菌菌株XT1-2-2進行土壤重金屬修復提供了一定的理論支撐。