■ 王雪艷 王乙茹 黃遵錫 陳德近 何 雪 安清聰 程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川達(dá)州 635001；3.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650222；4.愛科特生物工程(昆明)有限公司，云南昆明 650506）

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans），是芽孢桿菌屬、乳酸菌類益生菌[1-3]。很多研究表明，飼用凝結(jié)芽孢桿菌改善畜禽生產(chǎn)性能的作用效果具有明顯的劑量效應(yīng)，即與飼糧中凝結(jié)芽孢桿菌的添加菌數(shù)相關(guān)[4-8]。因此，飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的菌數(shù)檢測(cè)真實(shí)性和準(zhǔn)確性，備受生產(chǎn)企業(yè)及應(yīng)用企業(yè)的關(guān)注[9]。當(dāng)前，我國(guó)飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的菌數(shù)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)主要有《飼料添加劑 凝結(jié)芽孢桿菌的測(cè)定（T/YNBX 024—2021）》（云南省標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)頒布，簡(jiǎn)稱“云南團(tuán)標(biāo)”）[10]、《飼料添加劑 凝結(jié)芽孢桿菌（T/CSWSL 022—2020）》（北京生物飼料產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟頒布，簡(jiǎn)稱“北京團(tuán)標(biāo)”）[11]，對(duì)菌數(shù)檢測(cè)均采用了平板計(jì)數(shù)法，其檢測(cè)原理是將凝結(jié)芽孢桿菌接種到特定培養(yǎng)基，在最佳的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間觀測(cè)培養(yǎng)基上單個(gè)菌體細(xì)胞長(zhǎng)成的菌落[9]，并以特征菌落數(shù)量、個(gè)體大小、分散程度等指標(biāo)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[12]。由此可見，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間是準(zhǔn)確檢測(cè)飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的關(guān)鍵。

然而，云南團(tuán)標(biāo)采用的培養(yǎng)條件為“低溫長(zhǎng)時(shí)間”（40 ℃/48 h）[10]，北京團(tuán)標(biāo)采用的培養(yǎng)條件為“高溫短時(shí)間”（50 ℃/24 h）[11]，以上2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中培養(yǎng)條件的較大差異不利于生產(chǎn)企業(yè)及應(yīng)用企業(yè)判定飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的質(zhì)量[9]。據(jù)此，本試驗(yàn)研究了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果的影響，為進(jìn)一步規(guī)范飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑菌數(shù)檢測(cè)方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料鑒定及制備

飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑（購(gòu)買原粉標(biāo)識(shí)500 億CFU/g）由愛科特生物工程（昆明）有限公司提供。樣品涂板培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。然后，挑取單菌落用改良MRS 培養(yǎng)基擴(kuò)培[13-14]，經(jīng)16S rRNA 基因測(cè)序及比對(duì)，確定為凝結(jié)芽孢桿菌。

隨后，將原粉（A 樣品）用淀粉稀釋5 倍（B 樣品）、25倍（C樣品），制備成3個(gè)樣品，用于本次方法學(xué)研究。

1.2 培養(yǎng)基

云南團(tuán)標(biāo)培養(yǎng)基成分：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、牛肉膏5.0 g、葡萄糖5.0 g（無需分開滅菌）、番茄粉0.5 g、氯化鈉2.5 g、無水氯化鈣0.15 g、水合硫酸錳0.1 g、瓊脂粉25.0 g、蒸餾水1 000 mL、配置好后調(diào)節(jié)pH為5.2[10]。

北京團(tuán)標(biāo)培養(yǎng)基成分：大豆蛋白胨5.0 g、酵母粉2.0 g、L-半胱氨酸0.25 g、葡萄糖5.0 g、乙酸鈉2.5 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸錳0.1 g、硫酸鎂0.025 g、溴甲酚紫0.032 g、瓊脂粉20.0 g、蒸餾水1 000 mL 配置好后調(diào)節(jié)pH為5.5[11]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于云南團(tuán)標(biāo)[10]、北京團(tuán)標(biāo)[11]中凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間差異，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

云南團(tuán)標(biāo)檢測(cè)試驗(yàn)的4 個(gè)培養(yǎng)條件處理組為：TC40℃/24h組（40 ℃/24 h 低溫、短時(shí)培養(yǎng)）、TC40℃/48h組（40 ℃/48 h 低溫、長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)）、TC50℃/24h組（50 ℃/24 h高溫、短時(shí)培養(yǎng)）、TC50℃/48h組（50 ℃/48 h 高溫、長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)）。

北京團(tuán)標(biāo)檢測(cè)試驗(yàn)的4 個(gè)培養(yǎng)條件處理組為SC40℃/24h組（40 ℃/24 h 低溫、短時(shí)培養(yǎng)）、SC40℃/48h組（40 ℃/48 h 低溫、長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)）、SC50℃/24h組（50 ℃/24 h高溫、短時(shí)培養(yǎng)）、SC50℃/48h組（50 ℃/48 h 高溫、長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)）。

用平板計(jì)數(shù)法開展8 個(gè)處理組、3 個(gè)樣品的菌數(shù)檢測(cè)，并進(jìn)行菌數(shù)比較分析。

1.4 檢測(cè)步驟

1.4.1 取樣及樣品菌懸液制備

3個(gè)樣品各精確稱取1.000 g，分別轉(zhuǎn)入裝有100 mL稀釋液的錐形瓶（錐形瓶及內(nèi)置的5 mm 玻璃珠，已滅菌處理），置于搖床震蕩30 min，制備成10-2的樣品菌懸液。

1.4.2 梯度稀釋

吸取樣品菌懸液0.8 mL 至裝有7.2 mL 稀釋液的EP 管中稀釋，并重復(fù)這一操作3～7 次，進(jìn)行逐級(jí)梯度稀釋，至3 個(gè)樣品的檢測(cè)“所需稀釋度”（平板上30～300個(gè)可計(jì)數(shù)菌落）[9]，樣品A、B、C稀釋度分別為10-8、10-7、10-6。

1.4.3 培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

1.4.3.1 培養(yǎng)

① 云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)（T/YNBX 024—2021）

從“所需稀釋度”菌懸液的EP 管吸取100 μL，用涂布器在培養(yǎng)基平板上均勻涂布，所用培養(yǎng)基參考云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)。按“所需稀釋度”的菌液，涂布6 個(gè)平板。從6 個(gè)平板中隨機(jī)取3 個(gè)平板，于40 ℃培養(yǎng)24 h后檢測(cè)菌數(shù)，記錄為“TC40℃/24h”組的菌數(shù)；隨后，在40 ℃延長(zhǎng)培養(yǎng)至48 h，記錄為“TC40℃/48h”組的菌數(shù)。

余下3 個(gè)平板于50 ℃培養(yǎng)24 h 后檢測(cè)菌數(shù)，記錄為“TC50℃/24h”組的菌數(shù)；隨后，在50 ℃延長(zhǎng)培養(yǎng)至48 h，記錄為“TC50℃/48h”組的菌數(shù)。

② 北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)（T/CSWSL 022—2020）

按照北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)步驟，將“所需稀釋度”菌懸液的EP 管放于80 ℃水浴處理10 min 后，再進(jìn)行菌數(shù)檢測(cè)[9]。

從熱處理后的EP 管中吸取100 μL 菌懸液，用涂布器在培養(yǎng)基平板上均勻涂布，所用培養(yǎng)基參考北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)。按“所需稀釋度”的菌液，涂布6 個(gè)平板。從6個(gè)平板中隨機(jī)取3個(gè)平板，于40 ℃培養(yǎng)24 h后檢測(cè)菌數(shù)，記錄為“SC40℃/24h”組的菌數(shù)；隨后，在40 ℃延長(zhǎng)培養(yǎng)至48 h，記錄為“SC40℃/48h”組的菌數(shù)。

余下3 個(gè)平板于50 ℃培養(yǎng)24 h 后檢測(cè)菌數(shù)，記錄為“SC50℃/24h”組的菌數(shù)；隨后，在50 ℃延長(zhǎng)培養(yǎng)至48 h，記錄為“SC50℃/48h”組的菌數(shù)。

1.4.3.2 計(jì)數(shù)

菌數(shù)計(jì)數(shù)參照云南團(tuán)標(biāo)中“6.3.3.1 活菌含量計(jì)算式”進(jìn)行[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

菌數(shù)檢測(cè)值用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并進(jìn)行單因素方差分析。用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 樣品菌株鑒定

樣品菌落形態(tài)見圖1（A），16S rRNA 測(cè)序所得菌株的基因序列在NCBI 中經(jīng)Blast 比對(duì)，與Weizmannia coagulansMT604642 相似度高達(dá)99.93%。2022 年8月，國(guó)家衛(wèi)健委第4 號(hào)公告，依據(jù)國(guó)際微生物菌株的重新命名，已經(jīng)將凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）更名為凝結(jié)魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans），并在我國(guó)設(shè)置兩年過渡期?；蛐蛄袠?gòu)建的發(fā)育樹見圖1（B），序列與凝結(jié)芽孢桿菌聚為一簇，鑒定該樣品菌株為凝結(jié)芽孢桿菌。

2.2 云南團(tuán)標(biāo)檢測(cè)步驟的培養(yǎng)溫度、時(shí)間對(duì)飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響

云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)3個(gè)樣品中凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的結(jié)果見表1，3個(gè)樣品的TC50℃/24h（50 ℃/24 h培養(yǎng)）組菌數(shù)與TC50℃/48h（50 ℃/48 h培養(yǎng)）組完全一致，均顯著高于TC40℃/48h（40 ℃/48 h 培養(yǎng)）組（P＜0.05)，圖2 顯示，TC50℃/24h平 板 菌 落 比TC40℃/48h密 集，且 同 一 視 野 下TC50℃/48h組平板上的菌落明顯大于培養(yǎng)時(shí)間較短的TC50℃/24h組。此外，表1和圖2顯示TC40℃/24h（40 ℃/24 h培養(yǎng)）組平板上無菌落生長(zhǎng)，因此無菌數(shù)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。

表1 培養(yǎng)溫度、時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響（云南團(tuán)標(biāo)檢測(cè)步驟，億CFU/g)

圖2 培養(yǎng)溫度、時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響（菌落形態(tài)，云南團(tuán)標(biāo)檢測(cè)）

2.3 北京團(tuán)標(biāo)檢測(cè)步驟的培養(yǎng)溫度、時(shí)間對(duì)飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響

北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)3 個(gè)樣品中凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的結(jié)果如下見表2，3 個(gè)樣品的SC50℃/24h（50 ℃/24 h培養(yǎng)）組菌數(shù)與SC50℃/48h（50 ℃/48 h 培養(yǎng)）完全一致，均顯著高于SC40℃/48h（40 ℃/48 h 培養(yǎng)）組（P＜0.05）。如圖3所示，北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的平板培養(yǎng)基為淺黃綠色，與云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的平板培養(yǎng)基明顯不同，且SC50℃/24h組平板菌落比SC40℃/48h組密集；同一視野下SC50℃/48h組平板上的菌落明顯大于培養(yǎng)時(shí)間較短的SC50℃/24h組。此外，表2 和圖3 顯示SC40℃/24h（40 ℃/24 h 培養(yǎng)）組平板上無菌落生長(zhǎng)，因此無菌數(shù)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。

表2 培養(yǎng)溫度、時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響（北京團(tuán)標(biāo)檢測(cè)步驟，億CFU/g）

圖3 培養(yǎng)溫度、時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的影響（菌落形態(tài)，北京團(tuán)標(biāo)檢測(cè)）

2.4 云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)與北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的比較

由表3 可知，在50 ℃培養(yǎng)24 h 或48 h，TC50℃/24h組樣品B 和樣品C 菌數(shù)均顯著高于SC50℃/24h組（P＜0.05）。此外，TC40℃/48h組的樣品A 和樣品C 菌數(shù)均顯著高于SC40℃/48h組（P＜0.05）。

表3 云南團(tuán)標(biāo)與北京團(tuán)標(biāo)檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的比較

3 討論

眾所周知，適宜的溫度、水分、營(yíng)養(yǎng)等是細(xì)菌繁殖與生長(zhǎng)的基本條件，因此最佳的培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間成為細(xì)菌菌數(shù)平板計(jì)數(shù)法的關(guān)鍵條件[9]。基于云南團(tuán)標(biāo)“低溫、長(zhǎng)時(shí)”（40 ℃/48 h）與北京團(tuán)標(biāo)“高溫、短時(shí)”（50 ℃/24 h）的培養(yǎng)條件差異，本研究設(shè)置了“低溫、長(zhǎng)時(shí)”（40 ℃/48 h）、“低溫、短時(shí)”（40 ℃/24 h）、“高溫、長(zhǎng)時(shí)”（50 ℃/48 h）、“高溫、短時(shí)”（50 ℃/24 h）四個(gè)培養(yǎng)條件，分別按云南團(tuán)標(biāo)、北京團(tuán)標(biāo)的檢測(cè)步驟，對(duì)不同含量的3 個(gè)飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑樣品進(jìn)行了平板計(jì)數(shù)研究。數(shù)據(jù)顯示，50 ℃/24 h 培養(yǎng)的凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)顯著高于40 ℃/48 h 培養(yǎng)的菌數(shù)（TC50℃/24h＞TC40℃/48h；SC50℃/24h＞SC40℃/48h），且40 ℃/24 h 培養(yǎng)的平板上(TC40℃/24h和SC40℃/24h)無菌落生長(zhǎng)，無法檢測(cè)計(jì)數(shù)。進(jìn)一步觀察平板上凝結(jié)芽孢桿菌的菌落數(shù)量、個(gè)體大小、分散程度，發(fā)現(xiàn)無論采用云南團(tuán)標(biāo)操作步驟還是北京團(tuán)標(biāo)操作步驟，50 ℃/24 h 培養(yǎng)得檢出菌數(shù)與50 ℃/48 h 培養(yǎng)的完全一致，區(qū)別在于同一視野下觀察50 ℃/48 h 培養(yǎng)的菌落個(gè)體明顯大于50 ℃/24 h的菌落。以上結(jié)果表明，平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的適宜培養(yǎng)溫度為50 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為24～48 h。

此外，表3 結(jié)果顯示50 ℃/24 h 或50 ℃/48 h 培養(yǎng)條件下，3 個(gè)凝結(jié)芽孢桿菌樣品采用云南團(tuán)標(biāo)操作的檢出菌數(shù)比北京團(tuán)標(biāo)的檢出菌數(shù)高7.89%～8.14%，且B、C 組整體差異顯著。原因分析如下：其一，總菌數(shù)（total aerobic count, TC）與芽孢數(shù)（spore count, SC）的檢測(cè)差異。凝結(jié)芽孢桿菌為芽孢桿菌屬益生菌，因此飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑中普遍存在芽孢、活菌等多種狀態(tài)的細(xì)菌[1，9，17]。北京團(tuán)標(biāo)的檢測(cè)步驟將樣品80 ℃/10 min 熱處理后進(jìn)行菌數(shù)檢測(cè)[11]，而云南團(tuán)標(biāo)檢測(cè)步驟未對(duì)樣品熱處理[10]。董佩佩等[16]、嚴(yán)濤等[17]、單春?jiǎn)痰萚18]認(rèn)為80 ℃/10 min 熱處理是芽孢桿菌屬益生菌制劑中芽孢數(shù)檢測(cè)的規(guī)范方法，因?yàn)橛行コ酥苿┲械幕罹讹暳现酗曈醚挎邨U菌的測(cè)定（DB 32/T 2583—2013）》[19]。據(jù)此，北京團(tuán)標(biāo)實(shí)測(cè)的是飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的芽孢數(shù)，而云南團(tuán)標(biāo)實(shí)測(cè)的是飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的總菌數(shù)（包括芽孢和活菌），兩者在概念及檢出值上有明顯區(qū)別和差異[9]。其二，培養(yǎng)基差異。有綜述文章顯示[9]，云南團(tuán)標(biāo)培養(yǎng)基與北京團(tuán)標(biāo)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組分及含量有明顯差異，而營(yíng)養(yǎng)底物是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的重要條件[20-21]，因此可能影響菌數(shù)檢出結(jié)果，這也在本試驗(yàn)圖2、圖3 的培養(yǎng)基顏色、菌落大小等差異上直觀印證。誠(chéng)然，這一推測(cè)有待進(jìn)一步試驗(yàn)的科學(xué)數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

研究證明，平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的適宜培養(yǎng)溫度為50 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為24～48 h。此外，通過對(duì)比檢出菌數(shù)，分析出北京團(tuán)標(biāo)實(shí)測(cè)的是飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的芽孢數(shù)，而云南團(tuán)標(biāo)實(shí)測(cè)了飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的總菌數(shù)。本研究為規(guī)范飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)平板計(jì)數(shù)法的操作提供科學(xué)依據(jù)，為飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑生產(chǎn)企業(yè)及應(yīng)用企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)檢提供借鑒。