參連復脈顆粒對大鼠再灌注心律失常的影響及機制研究

魯婷婷，汪吳嬌，楊志飛，任建勛，林 謙，萬 潔

再灌注治療是針對心肌缺血快速有效的治療方法，但在血管再通的同時，常導致心肌再灌注損傷，其主要的表現(xiàn)形式為再灌注心律失常(reperfusion arrhythmia，RA)[1]。研究表明，心肌梗死后溶栓或支架植入后，室性心律失常發(fā)生率高達80%；超過50%死亡病例的致死原因為再灌注所致心律失常[1-2]。因此，預防再灌注心律失常具有重要意義。參連復脈顆粒(專利號：ZL201310303390.5)是北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院協(xié)定處方。研究表明，參連復脈顆粒對室性心律失常具有一定的療效[3]。而再灌注心律失常以心室顫動(VF)+室性心動過速(VT)等室性心律失常為主[1]，本研究擬在前期基礎上，采用大鼠心肌再灌注損傷模型探討參連復脈顆粒對再灌注心律失常的藥效作用，并基于網絡藥理學進一步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠60只，無特定病原體(SPF)級，雄性，體質量200～220 g，維通利華(北京)實驗動物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0004。

1.1.2 藥物與試劑 參連復脈顆粒，由黨參、丹參、黃連、法半夏、赤芍、川芎、鬼箭羽、白芍、 遠志、酸棗仁、炙甘草組成，提取浸膏粉，每克膏粉含4.27 g生藥，成人臨床日用量為40.5 g，批號：Z70301，由北京中醫(yī)藥大學附屬東方醫(yī)院提供。鹽酸美西律片(石藥集團歐意藥業(yè)有限公司生產，批號：377131203，規(guī)格：每片50 mg)，0.9%氯化鈉注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產，批號：C201202095)。

1.1.3 實驗儀器 ALC-V8型小動物呼吸機(上海奧爾科特生物技術有限公司)，心電圖解析系統(tǒng)(Softron SP-2006，北京軟隆生物技術有限公司生產)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將60只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、美西律組、參連復脈顆粒低高劑量組、參連復脈顆粒中劑量組、參連復脈顆粒高劑量組，每組10只。假手術組：左冠狀動脈前降支穿線不結扎，灌胃生理鹽水3 mL/kg；模型組：灌胃生理鹽水3 mL/kg；美西律組：灌胃鹽酸美西律60 mg/kg；參連復脈顆粒低、中、高劑量組：分別灌胃參連復脈顆粒2.0 g生藥/kg、4.0 g生藥/kg、8.0 g生藥/kg。各組采用的干預藥物均以生理鹽水配至所需濃度，經灌胃口服給藥1次，給藥量為100 g體質量1 mL。

1.2.2 造模方法 各組大鼠予相應的藥物或生理鹽水灌胃30 min后，使用50 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔麻醉，連接心電圖解析系統(tǒng)記錄標準Ⅱ導聯(lián)心電圖，切開氣管，插入氣管插管，連接呼吸機，開胸，暴露心臟，于冠狀動脈左前降支根部穿線，以備結扎；穿線后穩(wěn)定10 min，結扎(無ST段及T波改變者淘汰)，15 min后，剪斷結扎線，使前降支實現(xiàn)再灌注。再灌注后，動物在1 min內即出現(xiàn)室性期前收縮(PVC)、VT及VF等不同程度的心律失常。觀察再灌注后10 min內PVC個數和VT+VF總時程。

1.3 網絡藥理學分析

1.3.1 參連復脈顆粒的組成及靶點預測 通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)獲得參連復脈顆粒各味藥的成分信息，篩選條件為經口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18。同時預測成分的靶點。TCMSP數據庫中搜索不到的中藥，用BATMAN-TCM[4](http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/) 檢索，默認設置，篩選有效成分及相應潛在靶點。

1.3.2 再灌注心律失常疾病靶點 應用OMIM數據庫(https：//omim.org/)和GeneCards(www.genecards.org)，以reperfusion arrhythmia為關鍵詞，刪除重復值，兩個數據庫取并集作為再灌注心律失常疾病靶點[5-6]。與上述參連復脈顆粒靶點取交集，得到參連復脈顆粒治療再灌注心律失常的作用靶點。

1.3.3 Venn圖繪制 應用微生信在線平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)將各單味藥及再灌注心律失常相關靶點導入，繪制Venn圖，找到多個單味藥共同作用的靶點。

1.3.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析 應用Metascape(http：//metascape.org/)平臺，將參連復脈顆粒治療再灌注心律失常靶點導入，行KEGG富集分析，并對結果進行可視化處理[7]。

1.3.5 關鍵節(jié)點選擇 將參連復脈顆粒潛在靶點和再灌注心律失常疾病交集靶點，上傳至STRING數據(https：//www.string-db.org/)構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，把最低相互作用閾值設為中等置信度(medium confidence=0.4)，其余參數保持默認設置，將PPI網絡生成文件導入Cytoscape 3.7.1，利用插件CytoCNA，將網絡節(jié)點的介度(betweenness，BC)、緊密度(closeness，CC)均大于中位值，連接度(degree，DC)大于2倍中位值的靶點作為核心靶點。

2 結 果

2.1 參連復脈顆粒對PVC總個數及VT+VF總時程的影響 與模型組比較，參連復脈顆粒中、高劑量組及美西律組PVC總個數和VT+VF總時程均明顯下降(P<0.05或P<0.01)；參連復脈顆粒高、中、低劑量組VT+VF總時程高于美西律組(P<0.05或P<0.01)，而參連復脈顆粒高、中劑量組PVC總個數與美西律組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組PVC總個數及VT+VF總時程比較(±s)

2.2 網絡藥理學預測結果

2.2.1 靶點預測 應用TCMSP數據庫檢索參連復脈顆粒各味藥成分信息，預測靶點見表2，用UniProt(https：//www.uniprot.org/)數據庫，對靶點基因名進行規(guī)范化處理。其中，遠志、鬼箭羽通過BATMAN-TCM數據庫檢索。最后得到藥物潛在靶點314個。在GeneCards中檢索到再灌注心律失常靶點993個，OMIM 中131個。去重后將2個數據庫再灌注心律失常靶點取并集得到疾病靶點1 076個。將藥物靶點與疾病靶點取交集，得到參連復脈顆粒治療再灌注心律失常潛在靶點136個，并對結果進行可視化，詳見圖1。以作用于交集靶點排名前五種活性成分作為核心成分(共有成分以“S加數字”進行編號)，詳見表3。

表2 參連復脈顆粒中各中藥活性成分種數與對應靶點數 單位：個

圖1 參連復脈顆粒和再灌注心律失常交集靶點Venn圖

表3 主要核心活性成分及其作用靶點

2.2.2 靶點篩選 在STRING數據平臺輸入136個交集靶點進行拓撲分析，得到一個由136個節(jié)點和2 339條邊組成的網絡(見圖2A)。首先，以DC、BC和CC大于中位數進行篩選，得到53個節(jié)點和1 090條邊的網絡圖(見圖2B)； 然后，以DC大于中位數的2倍進一步篩選，最終構建一個26個節(jié)點和318條邊的參連復脈顆粒作用于再灌注心律失常核心靶點網絡圖(見圖2C)。用節(jié)點的大小表示 DC的大小，26 個關鍵靶點依次為蛋白激酶B1(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)、白介素6(IL6)、白介素1β(IL1β)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、細胞腫瘤抗原p53(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、JUN、環(huán)加氧酶2(PTGS2)、表皮生長因子受體(EGFR)、一氧化氮合酶3(NOS3)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)、信號傳導蛋白和轉錄激活物3(STAT3)、CC趨化因子配體2(CCL2)、白介素10(IL10)、CXC趨化因子配體8(CXCL8)、 缺氧誘導因子-1α(HIF1A)、細胞間黏附分子1(ICAM1)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、雌激素受體1(ESR1)、FOS、熱休克蛋白90 AA1(HSP90AA1)、核轉錄因子-κB(NF-κB)抑制劑α(NFKBIA)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、血紅素加氧酶1(HMOX1)。

圖2 共同靶點 PPI 網絡圖

2.2.3 靶點分析 KEGG富集分析結果見圖3。提示參連復脈顆粒通過調節(jié)細胞分化、炎癥反應等相關蛋白和信號通路發(fā)揮作用。參連復脈顆粒主要通過干預凋亡信號通路(apoptosis)、TNF信號通路 (TNF signaling pathway) 、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路 (PI3K-Akt signaling pathway) 等多個信號通路發(fā)揮治療作用。而TNF信號通路和PI3K-AKT信號通路是凋亡通路的重要組成部分，NF-κB信號通路是TNF信號通路的重要組成部分。再次說明了該復方治療再灌注心律失常的作用機制。凋亡信號通路圖見圖4(紅色的基因或蛋白是參連復脈顆粒治療再灌注心律失常的作用靶點)，再次印證了參連復脈顆粒作用于多種靶蛋白，啟動并調控復雜的信號轉導，抑制心肌細胞凋亡，改善心肌再灌注病人預后，降低再灌注心律失常發(fā)生率。

圖3 KEGG通路富集分析

圖4 凋亡通路

3 討 論

中醫(yī)對再灌注心律失常無系統(tǒng)論述，現(xiàn)代醫(yī)家多將其歸屬“胸痹”“心悸”范疇[8]。再灌注治療相當于中醫(yī)“破血逐瘀”法，此過程耗氣傷血；氣虛則進一步加重血瘀，故氣虛血瘀貫穿病人治療前后，而出現(xiàn)再灌注心律失常。相關研究也表明，氣虛血瘀為再灌注心律失常的核心病機[9]。針對VT與VF等快速性心律失常臨床以陰虛痰熱與痰熱擾心證為多見[10]，故再灌注損傷所導致的再灌注心律失常，常在氣虛血瘀基礎上，合并陰虛痰熱或痰熱擾心證。常用的中成藥參松養(yǎng)心膠囊與穩(wěn)心顆粒對于快速性心律失常證屬氣陰兩虛、瘀血阻絡者具有良好療效，而對于氣虛血瘀合并痰熱擾心證的快速性心律失常尚缺乏療效可靠的上市中成藥。針對證屬氣虛血瘀兼痰熱擾心型心悸的治療，林謙教授依據氣血理論并結合自身臨證經驗擬定了參連復脈顆粒，補充了當前臨床對心律失常氣虛血瘀兼見痰熱擾心證的治療空白。

本研究采用冠狀動脈左前降支線栓結扎法制作大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)參連復脈顆粒能明顯減少再灌注心律失常的發(fā)生。進一步通過網絡藥理學的方法分析了其藥效機制，KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，參連復脈顆粒參與調控的通路主要有凋亡、PI3K-AKT和TNF等信號通路。再灌注心律失常是心肌缺血再灌注損傷的主要表現(xiàn)形式，也是致死性心肌再灌注損傷的潛在標志[11]。而心肌細胞凋亡是再灌注損傷發(fā)生機制的一個重要早期病理生理表現(xiàn)，也是再灌注損傷發(fā)生的上游機制之一。通過抑制心肌細胞凋亡等上游機制從而預防心肌再灌注損傷和再灌注心律失常的發(fā)生是近年心肌缺血再灌注研究的熱點[12-14]。凋亡通路中的促凋亡蛋白Bax是凋亡蛋白Bcl-2基因家族的成員，與Bcl-2形成異源二聚體，發(fā)揮促凋亡因子的作用，Caspase-3在心肌細胞凋亡過程中，是最關鍵的蛋白酶之一，也是凋亡參與執(zhí)行者[15]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌再灌注損傷時，Bax/Bcl-2和Caspase-3的表達均明顯升高，上調抗凋亡蛋白Bcl-x和Bcl-2對心肌有保護作用[15-16]。PI3K-AKT信號通路是凋亡通路中的一條重要通路，通過促進Bcl-2、磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化AKT(p-AKT)表達，抑制Caspase-3和Bax表達被激活，從而減少心肌細胞凋亡、炎性因子的產生和縮小心肌梗死面積，進而緩解心肌再灌注損傷[17]。通過激活PI3K/AKT通路靶向抑制下丘腦室旁核交感神經活動可能是治療再灌注心律失常的一種潛在方法[18]。TNF通路是凋亡通路的另一條重要通路，NF-κB信號通路存在TNF通路中，是TNF與TNF-R1的相互作用激活的一種信號轉導途徑之一。在缺血再灌注損傷時，該通路被迅速激活，進一步激活下游TNF-α、IL-6等炎性因子，從而促進心肌細胞凋亡，心肌梗死面積增大、心功能受損以及室性心律失常的易感性，抑制該通路可保護再灌注損傷，降低再灌注心律失常的易感性[19]。

經過篩選，發(fā)現(xiàn)參連復脈顆粒作用于再灌注心律失常的主要成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素和丹參酮ⅡA等。其中槲皮素預處理一方面能降低TNF-α、C反應蛋白(CRP)和白介素-1β(IL-1β)等細胞因子，從而抑制炎癥級聯(lián)反應。另一方面，能降低Bax水平和提高Bcl-2水平，抑制細胞凋亡；從而提高AKT的磷酸化水平，激活PI3K/AKT通路參與抗凋亡等途徑對心肌缺血再灌注損傷產生保護效用[20]。木犀草素可激活PI3K/AKT通路，增加Bcl-2 相關死亡促進因子(BAD)磷酸化，降低Bax與Bcl-2比值，降低心肌細胞凋亡率[21]。山奈酚可降低IL-6、TNF-α和NF-κB水平。激活細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)，抑制活性c-JNK和p38蛋白，降低促凋亡蛋白(Caspase-3和Bax)水平[22]。丹參酮ⅡA能夠激活PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路進而緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷[23]。課題組前期通過高效液相色譜法同時測定該方中君藥丹參中丹酚酸B、丹參酮ⅡA和臣藥白芍、佐藥赤芍中的有效成分芍藥苷3種活性成分的含量，作為該方的質量控制標準提取浸膏粉，再通過一定工藝制備成參連復脈顆粒[24]。進一步印證了本方君藥丹參的主要成分丹參酮ⅡA是本方的主要成分之一。STRING篩選結果顯示，根據DC值排名前10的核心基因分別為AKT1、TNF、IL6、IL1β、MMP9、TP53、MAPK3、CASP3、JUN、PTGS2，基本包含以上成分調控的基因，進一步印證了參連復脈顆?？赡苤饕ㄟ^槲皮素、山奈酚、木犀草素和丹參酮ⅡA等成分，作用于AKT1、TNF、IL6、IL1β、MMP9、TP53、MAPK3、CASP3、JUN、PTGS2等核心基因，從而調控凋亡信號通路、PI3K/AKT信號通路以及NF-κB等信號通路，抑制再灌注后心肌凋亡和炎癥反應，從而對心肌再灌注損傷產生保護作用，降低再灌注心律失常的發(fā)生率。

綜上所述，參連復脈顆?？赏ㄟ^多途徑、多靶點預防再灌注心律失常，其中一些靶點前期研究已進行了相關實驗，如參連復脈顆?？筛纳芓NF-α、IL-6介導的炎癥反應，進而對心房顫動易感性起到抑制作用[25]。本實驗基于參連復脈顆粒在體的藥理作用，利用網絡藥理學全面分析了其預防再灌注心律失常的機制，為后續(xù)探究參連復脈顆粒的作用機制提供思路和方向。但參連復脈顆粒是否通過上述通路發(fā)揮作用以及主要作用靶點之間、主要通路間和主要靶點與通路間相互作用情況仍需進一步實驗驗證，另外由于參連復脈顆粒藥味較多，本研究雖然使用的是目前常用的檢索工具，但在預測靶點上仍存在一定的局限性，故其確切機制需進一步探討。