崔曉娜,陳美君,曹園園,周舒浩,李瀟楠,張海榮

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450046)

脫落酸(abscisic acid,ABA)是廣泛存在于高等植物中的經(jīng)典植物激素。ABA調(diào)控植物種子萌發(fā)與休眠、幼苗根的生長和氣孔運動等過程,進而參與植物對干旱、鹽、滲透等脅迫的響應(yīng)。ABA信號通路基因功能異常會改變植物對逆境脅迫的敏感程度[1-3]。因此,研究ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各基因的表達調(diào)控可為抗逆作物的培育、農(nóng)作物產(chǎn)量的增產(chǎn)和品質(zhì)的改良提供理論依據(jù)。

目前,蛋白質(zhì)的磷酸化、泛素化和SUMO化(small ubiquitin-like modifier)等多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾對ABA信號的調(diào)控機制已被揭示。其中,泛素分子和SUMO分子有相似的三維結(jié)構(gòu),并且都修飾蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基,進而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[4]。因此,重點闡述這2種相似的翻譯后修飾在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的調(diào)控作用,并討論二者之間的調(diào)控關(guān)系,旨在為篩選抗逆農(nóng)作物提供思路。

1 ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

目前,ABA的核心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路元件主要包括ABA的特異識別受體PYR1(pyrabactin resis-tance 1)/ PYL(PYR1-like)/ RCAR(regulatory component of ABA receptor)、下游的蛋白磷酸酶PP2Cs(protein phosphatase 2Cs)和蛋白激酶SnRK2s (SNF1-related protein kinase 2s)。擬南芥(Arabidopsisthaliana)的ABA受體有14個成員,分別為PYR1和PYL1～PYL13;擬南芥PP2C家族成員超過80個,其中A亞家族的9個成員參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo),即ABI1(ABA insensitive 1)、ABI2(ABA insensitive 2)、HAB1(homology to ABI1)、HAB2(homology to ABI2)、AHG1(ABA-hypersensitive germination 1)、AHG3(ABA-hypersensitive germination 3)和HAI1-3(highly ABA-induced 1-3);擬南芥的SnRK2蛋白激酶家族有10個成員,即SnRK2.1～SnRK2.10,其中SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6/OST1(open stomata 1)起主要作用。ABA的核心信號通路為ABA受體PYR1/PYLs/RCARs首先識別ABA,然后與蛋白磷酸酶PP2Cs相互作用,使PP2Cs釋放被抑制的蛋白激酶SnRK2s;而SnRK2s被磷酸化激活后進一步磷酸化下游的靶蛋白,調(diào)節(jié)ABA應(yīng)答基因的表達[5]。

2 ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中泛素化修飾

泛素(ubiquitin,Ub)是廣泛存在于真核生物中的一類多肽,由76個氨基酸組成。泛素化修飾會影響蛋白質(zhì)的活性、亞細胞定位、組裝、穩(wěn)定性及與其他蛋白的相互作用。蛋白質(zhì)的泛素化修飾過程需要E1泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme,UBA)、E2泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,UBC)和E3泛素連接酶(ubiquitin ligase,UBL)。首先E1泛素激活酶激活泛素分子,然后泛素分子被E1泛素激活酶轉(zhuǎn)移給E2泛素結(jié)合酶,形成E2-Ub復(fù)合體,最后由負責(zé)特異性識別底物的E3泛素連接酶與E2泛素結(jié)合酶共同將泛素分子轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。泛素化修飾是可逆的,由去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)水解釋放被修飾的蛋白質(zhì)上的泛素分子。

泛素化修飾對底物選擇的特異性主要是由E3泛素連接酶決定的,因此,E3泛素連接酶在泛素化修飾過程中起關(guān)鍵作用,在ABA信號通路的調(diào)控中也被研究最多。E3泛素連接酶是一個非常龐大的蛋白家族,可以分為單亞基E3連接酶和多亞基E3連接酶復(fù)合體2種類型。單亞基E3連接酶包括RING型(really interesting new gene)、U-box型、HECT型(homology to E6-associated carboxy-terminus)和RBR型(ring between ring)。多亞基E3連接酶復(fù)合體包括CRLs(Cullin-RING ligases)家族和APC復(fù)合體。CRLs在結(jié)構(gòu)上由Cullin腳手架蛋白(Cul1、Cul3a/3b或Cul4)、RBX1(RING box-1)蛋白和識別結(jié)合底物的底物受體蛋白組成。Cul1型的CRL指的是SCF(SKP1-Cullin-F box)復(fù)合體,其中F box蛋白是底物受體蛋白,負責(zé)招募底物,決定E3泛素連接酶的特異性。除了F box蛋白以外,底物受體蛋白還包括BTB(bric-a-brac-tramtrak-broad)、DDB(damaged DNA-binding protein)等[6]。因此,對ABA信號通路中各元件的泛素化修飾研究進行概括和討論。

2.1 ABA受體蛋白的泛素化修飾

擬南芥中最早被報道的被泛素化修飾的ABA受體蛋白是PYL4、PYL8和PYL9。DDA1(DET1- and DDB1-associated 1)參與其泛素化修飾。DDA1屬于CDD(COP10-DET1-DDB1)底物受體復(fù)合體的一部分,也是基于Cullin4的E3泛素連接酶復(fù)合體的組分。DDA1基因過表達植株對ABA敏感程度下降,而CDD復(fù)合體組分的相關(guān)功能缺失突變體都表現(xiàn)出對ABA超敏感的表型,表明DDA1負調(diào)控ABA信號通路。DDA1與ABA受體PYL8、PYL4、PYL9在細胞核中相互作用,并促進PYL8的泛素化,從而使其被蛋白酶體降解。ABA抑制DDA1對PYL8的泛素化降解,從而保護PYL8的活性[7]。這一機制解釋了ABA的存在能夠保證相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)正常進行的原因。

除PYL8以外,調(diào)控PYR1和PYL4受體泛素化修飾的E3泛素連接酶也被鑒定出來,即RING型E3泛素連接酶RSL1(ring finger of seed longevity 1)[8]。RSL1基因的過表達植株對ABA的敏感性降低,而RSL1基因的RNAi(RNA interference)植株則表現(xiàn)出對ABA超敏感的表型,表明RSL1是ABA信號通路的負調(diào)控因子。RSL1與PYR1、PYL4直接相互作用介導(dǎo)其泛素化降解。但是與DDA1不同,RSL1與PYL1、PYL4共定位在質(zhì)膜上而非細胞核中。RSL1用囊泡運輸?shù)囊种苿〣FA(brefeldin A)處理后,能夠增強其在膜上的共定位,因此推斷RSL1主要負責(zé)調(diào)控質(zhì)膜上的ABA受體蛋白的穩(wěn)定性,并且影響其囊泡運輸[8]。

被泛素化修飾的蛋白質(zhì)大多通過26S蛋白酶體途徑進行降解,也可以通過內(nèi)涵體介導(dǎo)的囊泡運輸途徑進入液泡或溶酶體中進行儲存或降解[9-10]。ESCRTs(endosome sorting complex required for transports)在蛋白分選進入MVB(multivesicular body)內(nèi)部囊泡方面發(fā)揮功能。YU等[11]和BELDA-PALAZON等[12]發(fā)現(xiàn)RSL1泛素化PYR1和PYL4后,不是通過蛋白酶體而是通過囊泡運輸?shù)揭号葜羞M行降解。ESCRT-I的組分FYVE1/FREE1(FYVE domain protein required for endosomal sorting 1)能夠與RSL1-PYL4復(fù)合體相互作用,將PYL4招募到內(nèi)涵體中,進入液泡進行降解。fyve1突變體中積累較高水平的PYL4蛋白,因此,對ABA超敏感[12]。泛素E2-like蛋白VPS23A(vacuolar protein sorting 23A)也是ESCRT-I復(fù)合體的一個關(guān)鍵組分,同F(xiàn)YVE1/FREE1一樣負調(diào)控ABA信號通路,其突變體表現(xiàn)出對ABA超敏感的表型。VPS23A可以識別ABA受體及其K63位泛素鏈,促進其進入囊泡運輸途徑從而影響其的亞細胞定位和穩(wěn)定性[11]。總之,FYVE1和VPS23A作為且ESCRTs復(fù)合體組分都可以識別結(jié)合被泛素化修飾的蛋白,但是兩者之間的協(xié)同作用還有待研究,且ESCRTs復(fù)合體中的其他組分的功能也是未來研究的內(nèi)容。此外,擬南芥中還存在VPS23A的同源蛋白VPS23B,兩者在ABA與脅迫應(yīng)答過程中是否存在功能冗余也有待揭示。

隨著研究的深入,VPS23A和FREE1的上游調(diào)控元件也被鑒定出來。SINAT1(seven in absentia ofArabidopsisthaliana1)、SINAT2、SINAT3和SINAT4等4個E3泛素連接酶能夠調(diào)控VPS23A和FREE1的泛素化和蛋白酶體降解,進而降低其穩(wěn)定性,從而正調(diào)控ABA信號。SINATs基因的過表達植株中PYL4受體的蛋白水平和ABA應(yīng)答基因的表達水平都比野生型高,并表現(xiàn)出對ABA敏感度升高的表型[13]。RING型E3泛素連接酶XBAT35(E3 ligase XB3 ortholog 5 inArabidopsisthaliana)也可以催化VPS23A發(fā)生泛素化,進而被蛋白酶體降解。xbat35突變體中PYL4受體蛋白的水平低,并在種子萌發(fā)和根伸長方面都對ABA不敏感,且不耐干旱脅迫,而VPS23A功能缺失能恢復(fù)xbat35突變體的表型。由此可見,XBAT35通過降解VPS23A提高ABA受體PYL4的水平,進而正調(diào)控ABA信號[14]。與SINATs和XBAT35相反,2個參與去泛素化的泛素蛋白酶UBP12(ubiquitin-specific protease 12)和UBP13負調(diào)節(jié)ABA信號,并通過催化VPS23A蛋白的去泛素化,提高其穩(wěn)定性,進而促進ABA受體的降解。VPS23A基因過表達能恢復(fù)ubp12-2w或ubp13-1突變體對ABA超敏感和對干旱不敏感的表型[15]。UBP12和UBP13還可以催化E3泛素連接酶XBAT35的去泛素化,進而穩(wěn)定XBAT35蛋白。XBAT35與VPS23A競爭結(jié)合UBP12和UBP13,精細調(diào)控VPS23A的泛素化降解[15-16]?？傊?E3泛素連接酶SINATs、XBAT35與泛素蛋白酶UBP12、UBP13通過調(diào)控VPS23A的降解,間接地調(diào)節(jié)ABA受體PYL4蛋白水平,參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

除了E3泛素連接酶,參與ABA受體泛素化修飾的E2泛素結(jié)合酶也被鑒定出來。擬南芥中有37個具有活性的E2泛素結(jié)合酶[17]。其中,UBC26能直接結(jié)合PYL4,調(diào)節(jié)PYL4的泛素化降解,從而負調(diào)控ABA信號,當然這一過程仍需要RING型E3泛素連接酶RFA1(RING finger ABA-related1)和RFA4共同參與[18]。一般認為,在泛素修飾過程中E3泛素連接酶直接識別結(jié)合底物,而E2泛素結(jié)合酶只是作為橋梁將泛素分子與E3-底物復(fù)合體聯(lián)系起來,并不與底物直接相互作用。這使研究者對E2泛素結(jié)合酶的作用方式有了新的認知。

2.2 PP2C蛋白磷酸酶的泛素化修飾

ABI1是PP2C家族的成員。KONG等[19]發(fā)現(xiàn),用26S蛋白酶體抑制劑MG132處理擬南芥幼苗后,ABI1蛋白的水平明顯高于對照。這表明ABI1可以被26S蛋白酶體降解。酵母雙雜交篩選出了一些與ABI1互作的U-box型E3連接酶PUBs(plant U-box E3 ligases),通過蛋白互作驗證確定了其中的2個成員PUB12和PUB13與ABI1相互作用。生化試驗證明,PUB12與PUB13參與了ABI1的泛素化修飾及降解[19]。擬南芥PP2C家族A亞家族有9個成員參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo),除了ABI1以外,其他的PP2C家族成員也有可能被不同的E3泛素連接酶調(diào)節(jié)。

隨后,AHG3、ABI2和HAB2等另外3個PP2C蛋白的泛素化調(diào)節(jié)機制也被揭示。RING型E3泛素連接酶家族中RGLG1(RING domain ligase 1)和RGLG5參與3個PP2C蛋白的泛素化降解從而正調(diào)控ABA信號。在這個過程中ABA起促進作用。rglg1、rglg5雙突變體在種子萌發(fā)和萌發(fā)后階段都表現(xiàn)出對ABA敏感程度降低,以及對干旱脅迫敏感的表型,而RGLG1和RGLG5基因的過表達植株則比野生型更加耐干旱脅迫[20]。JULIAN等[21]發(fā)現(xiàn),E3泛素連接酶CRL3s(Cullin3-RING-based E3 ligases)的BPM(BTB/POZ and MATH domain proteins)亞基BPM3和BPM5也可以與ABI1、ABI2和HAB1等PP2C蛋白磷酸酶相互作用,調(diào)控泛素化修飾。bpm3和bpm5雙突變體能積累更多的PP2C蛋白,并表現(xiàn)出對ABA敏感度降低的表型。

總之,雖然已知一些PP2C受泛素化調(diào)控,其上游的E3泛素連接酶也被鑒定出來,但是其他參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的PP2C蛋白是否也受泛素化修飾調(diào)控及其機制還不清楚。此外,PP2C的活性受到ABA受體的調(diào)控,而ABA受體蛋白的穩(wěn)定性在細胞膜和細胞核中由不同的E3泛素連接酶調(diào)節(jié)[7-8]。目前,已知BPM3、BPM5與PP2Cs在細胞核中共定位,而PUB12可能定位于細胞膜上。因此,PP2C蛋白的穩(wěn)定性可能也有類似的調(diào)節(jié)機制。

2.3 SnRK2s蛋白激酶的泛素化修飾

研究發(fā)現(xiàn),ABA信號通路中的關(guān)鍵激酶SnRK2也被泛素化修飾調(diào)節(jié)。AtPP2-B11是SCF(SKP1/Cullin/F-box)E3泛素連接酶復(fù)合體中的F-box蛋白。AtPP2-B11基因敲除突變體在種子萌發(fā)和萌發(fā)后階段都表現(xiàn)出對ABA超敏感的表型,其過表達植株雖然沒有表現(xiàn)出對ABA敏感程度的降低,但是能夠抑制SnRK2.3基因過表達植株對ABA超敏感的表型,表明AtPP2-B11是ABA信號通路負調(diào)控因子。同時,AtPP2-B11能夠泛素化修飾SnRK2.3,并促進其被26S蛋白酶體降解[22]。雖然SnRK2.2和SnRK2.6/OST1也被蛋白酶體降解[22],但是AtPP2-B11并不影響其穩(wěn)定性,因此,AtPP2-B11不是調(diào)控兩者的泛素連接酶。

ALI等[23]鑒定出HOS15(high osmotic stress 15)能促進SnRK2.6/OST1發(fā)生泛素化修飾,進而被26S蛋白酶體降解。HOS15是CUL4-DDB1 E3泛素連接酶復(fù)合體中的底物受體蛋白。hos15突變體中OST1蛋白的穩(wěn)定性增強,對ABA超敏感,對干旱脅迫有很強的耐受性。OST1功能缺失能明顯抑制hos15對干旱敏感的表型。同時,ABA抑制HOS15與OST1相互作用,從而增強OST1的穩(wěn)定性,而ABI1和ABI2能夠通過去磷酸化OST1促進HOS15-OST的互作,進而泛素化降解OST1。生化數(shù)據(jù)結(jié)合數(shù)學(xué)模型預(yù)測發(fā)現(xiàn),ABA可以通過OST1增強ABI1/ABI2的表達,從而與上述過程形成完整的反饋調(diào)節(jié)環(huán),即OST1促進ABI1/ABI2表達,而ABI1/ABI2反過來又促進OST1的泛素化降解[23]。這表明植物可通過調(diào)控SnRK2蛋白激酶的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)ABA信號通路,但HOS15如何被激活從而誘導(dǎo)OST1的降解,以及ABI1/ABI2如何穩(wěn)定HOS15-OST1復(fù)合體的形成仍需進一步探究。

2.4 ABA轉(zhuǎn)錄因子的泛素化修飾

ABI3(abscisic acid-insensitive 3)是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個具有B3結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,能夠被蛋白酶體降解[24]。ZHANG等[24]和KURUP等[25]發(fā)現(xiàn),RING型E3泛素連接酶AIP2(ABI3-interacting protein2)與ABI3相互作用,調(diào)節(jié)其泛素化修飾及穩(wěn)定性。AIP2是ABA信號通路的負調(diào)控因子,在AIP2基因過表達植株中,ABI3蛋白水平降低,表現(xiàn)出與abi3突變體類似的表型,即對ABA敏感程度下降,與其相反,在aip2突變體中積累了較高水平的ABI3蛋白,表現(xiàn)出對ABA超敏感的表型,與ABI3基因過表達植株表型一致[24-25]。另一個被揭示的可能調(diào)控ABI3泛素化的E3連接酶是定位于細胞核中的U-box型E3泛素連接酶PUB9(plant U-box 9)。遺傳學(xué)證據(jù)表明,PUB9是ABA信號的負調(diào)控因子,其突變體在種子萌發(fā)和根的伸長方面都對ABA超敏感,并且PUB9位于ABI3上游發(fā)揮功能。PUB9同樣還受到ABA的調(diào)控,ABA處理后其定位從細胞核轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上,可能會影響其發(fā)揮功能[26]?？傊?AIP2和PUB9這2個E3泛素連接酶位于ABI3上游調(diào)控ABI3的穩(wěn)定性,但是目前僅有遺傳學(xué)證據(jù)表明PUB9位于ABI3上游發(fā)揮功能,還沒有明確的生化證據(jù)證明ABI3是PUB9的直接底物。

bZIP轉(zhuǎn)錄因子ABI5(abscisic acid-insensitive 5)也受泛素化修飾調(diào)節(jié)并被蛋白酶體降解[27-31]。RING型E3泛素連接酶KEG(keep on going)參與ABI5的泛素化修飾,是ABA信號通路的負調(diào)節(jié)因子,其突變體對ABA超敏感,ABI5基因功能缺失能部分恢復(fù)keg突變體的表型。KEG蛋白通過其錨蛋白(ankyrin,ANK)重復(fù)序列與ABI5的C3結(jié)構(gòu)域相互作用,催化其344位賴氨酸發(fā)生泛素化修飾,進而被蛋白酶體降解,這一過程發(fā)生在細胞質(zhì)中[29-30]。但是當ABA存在時,KEG自身也能被泛素化修飾并被蛋白酶體降解,從而解除對ABI5的負調(diào)控作用[32]。ABI5的C3結(jié)構(gòu)不但是與KEG互作的位點,也是核定位所必需的,而KEG促進細胞質(zhì)中的ABI5泛素化降解,至于細胞核內(nèi)的ABI5是被哪個E3泛素連接酶調(diào)控仍未知[29]。ABI5還受到E3泛素連接酶的間接調(diào)控。SDIR1(salt-and drought-induced really interesting new gene finger 1)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的RING型E3泛素連接酶,是ABA信號通路的正調(diào)控因子,能夠泛素化SDIRIP1(SDIR1-interacting protein 1)使其被26S蛋白酶體降解,進而上調(diào)ABI5基因的轉(zhuǎn)錄水平[33-34]。雖然遺傳學(xué)證據(jù)表明除了ABI5以外,其他bZIP轉(zhuǎn)錄因子如ABF3(ABRE binding factor 3)和ABF4也位于SDIR1的下游,但是SDIRIP1只特異調(diào)控ABI5的表達,SDIR1是否通過SDIRIP1以外的底物間接調(diào)控ABF3和ABF4等轉(zhuǎn)錄因子的表達仍不清楚。另外,SDIR1-SDIRIP1-ABI5調(diào)控模型能夠闡明SDIR1參與鹽脅迫響應(yīng)的機制,并未揭示SDIR1如何參與干旱脅迫應(yīng)答的。

R2R3型轉(zhuǎn)錄因子也參與ABA信號通路并參與滲透、干旱和鹽等逆境脅迫,包括MYB20、MYB30和MYB96等[35-37],其中,MYB30是ABA信號通路的負調(diào)節(jié)因子。RING型E3泛素連接酶RHA2b(RING-H2 finger protein A2b)參與MYB30的泛素化修飾,是ABA信號通路的正調(diào)控因子,其過表達植株在種子萌發(fā)、幼苗生長和氣孔響應(yīng)等方面均對ABA超敏感并耐干旱脅迫;與過表達植株相反,其功能缺失突變體對ABA不敏感,并且不耐干旱脅迫[38]。RHA2b在細胞核中與MYB30相互作用,催化MYB30的第165位和第283位賴氨酸發(fā)生泛素化修飾,進而被26S蛋白酶體降解[39]。MIEL1(MYB30-interacting E3 ligase 1)E3連接酶也可調(diào)節(jié)MYB30泛素化,但是這一過程是參與病原菌侵染應(yīng)答響應(yīng),而非ABA信號通路。MIEL1是通過調(diào)控MYB96轉(zhuǎn)錄因子的泛素化修飾來調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的[40]。此外,其他調(diào)節(jié)MYB30泛素化降解的E3連接酶還有待揭示,因為在rha2b突變體中,MYB30蛋白的降解雖然延遲,但是仍然可以被降解。另外,其他的R2R3型轉(zhuǎn)錄因子如何被泛素化調(diào)控的還不清楚。

近年來,盡管研究者們已經(jīng)鑒定出許多E3泛素連接酶調(diào)節(jié)ABA信號,但是有些E3的作用機制還有待揭示。比如擬南芥RING型E3泛素連接酶ATL61(ArabidopsisthalianaTóxicos en levadura 61)和大豆的U-box E3泛素連接酶GmPUB21(plant U-box 21)都參與ABA信號調(diào)節(jié)和干旱脅迫應(yīng)答[29,41-42],但是底物仍然未知。

3 ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中SUMO化修飾

SUMO是一類與泛素具有類似三維結(jié)構(gòu)的多肽,大小約為11 kD,幾乎存在于所有真核生物中[4]。SUMO蛋白的C末端均有結(jié)合底物所必需的甘氨酸-甘氨酸基序(Gly-Gly,GG),但是SUMO的Gly-Gly殘基后有若干氨基酸序列延伸,需要在SUMO蛋白酶(SUMO protease)的作用下剪切后,暴露出Gly-Gly基序成為成熟的SUMO分子才能發(fā)揮作用[43]。SUMO化修飾過程與泛素化修飾相似,需要SUMO活化酶E1(SUMO-activating enzyme E1,SAE)、結(jié)合酶E2(SUMO-conjugating enzyme E2,SCE)和連接酶E3(SUMO-protein ligases E3,SPE)。首先,在SAE的作用下,SUMO成熟單體發(fā)生ATP依賴的激活,并將激活的SUMO轉(zhuǎn)移到SCE上,最后在SPE的作用下,SUMO由SCE轉(zhuǎn)移到底物上,完成SUMO化的過程[44-45]。

LOIS等[46]首次揭示SUMO化修飾與ABA信號通路之間關(guān)系。過量表達編碼SUMO蛋白的SUMO1/2基因會提高植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的SUMO化水平,一方面可以上調(diào)ABA應(yīng)答基因的表達,一方面抑制植物對ABA的敏感程度。相反,當編碼擬南芥SCE的AtSCE1a基因沉默時,植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的SUMO化修飾水平降低,植株表現(xiàn)出對ABA超敏感的表型,即與野生型相比其生長被ABA高度抑制,葉片高度黃化[46]。然而該研究沒有揭示SUMO化修飾調(diào)控ABA信號通路中的具體元件。

隨著研究的深入,越來越多參與SUMO化修飾的酶被揭示參與ABA信號通路,并通過遺傳和生化手段鑒定了SUMO化修飾的靶蛋白。除了上述提到的SCE,在參與SUMO化修飾過程的酶中研究最多的是SPE。擬南芥中已發(fā)現(xiàn)的SUMO連接酶E3有2個,即SIZ1(SAP and Miz 1)和MMS21(methanesulfonate sensitivity protein 21)/HPY2(high ploidy 2)。已有研究表明這2個E3連接酶都參與調(diào)控ABA信號通路,其中SIZ1的相關(guān)研究較為深入,但是MMS21的靶蛋白和作用機制還不清楚[37,47-48]。

此外,SUMO化是一個可逆的動態(tài)過程,SUMO可以被SUMO特異蛋白酶從被修飾的底物上切除。植物中的SUMO蛋白酶有ESD4(early short days 4)、TS1(overly tolerant to salt 1)、OTS2(overly tolerant to salt 1)和ASP1(ArabidopsisSUMO pro-tease1)等[49-50]。其中,ESD4和ASP1被報道參與調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是相對于泛素化修飾來說,SUMO化修飾參與ABA信號通路調(diào)控的研究比較少,目前只有ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的轉(zhuǎn)錄因子和SnRK2蛋白激酶受SUMO化修飾調(diào)控。

3.1 ABA轉(zhuǎn)錄因子的SUMO化修飾

ABA信號通路中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子ABI5可以被泛素化修飾并被蛋白酶體降解[27-31]。MIURA等[48]首次發(fā)現(xiàn)ABI5也可被SUMO化修飾,這個過程是由SUMO連接酶SIZ1參與催化的。擬南芥SIZ1基因的2個功能缺失突變體siz1-2和siz1-3都表現(xiàn)出對ABA超敏感的表型,并且一些ABA應(yīng)答基因如RD29A、RD29B等的表達在siz1-1突變體中被明顯上調(diào)。這表明SIZ1在ABA信號通路中起到負調(diào)控作用。遺傳證據(jù)發(fā)現(xiàn),ABI5功能缺失能夠恢復(fù)siz1-2突變體對ABA超敏感的表型,暗示了SIZ1在ABI5的上游起作用。體外SUMO化試驗發(fā)現(xiàn),SIZ1可以使ABI5發(fā)生SUMO化修飾,并確定ABI5的SUMO化位點為第391位賴氨酸(K391)。在siz1突變體中ABI5蛋白的穩(wěn)定性降低,表明SUMO修飾能夠保護ABI5不易被蛋白酶體降解,即SUMO化修飾對ABI5的穩(wěn)定性起正調(diào)控作用[48]。但是這一結(jié)果與siz1突變體對ABA超敏感的表型不一致,因此推測ABI5的SUMO化修飾水平可能影響其被磷酸化激活,即未被SUMO化修飾的ABI5蛋白會被磷酸化修飾激活。由此可見,各種翻譯修飾協(xié)同調(diào)控ABI5蛋白的活性和穩(wěn)定性的具體方式還有待深入研究。

轉(zhuǎn)錄因子MYB30除了可以被泛素化修飾調(diào)節(jié),也同樣可以被SUMO化修飾。ZHENG等[37]發(fā)現(xiàn)MYB30也是SIZ1的底物。MYB30的SUMO化位點位于第283位賴氨酸。ABA處理后siz1突變體中MYB30的蛋白水平降低。這表明SIZ1通過SUMO化修飾MYB30保護其不被降解,提高其穩(wěn)定性[37]。GONG等[51]通過遺傳學(xué)手段證明了K283位點對MYB30行使功能的重要性,并鑒定出MYB30的靶基因,并發(fā)現(xiàn)myb30-2突變體對鹽脅迫敏感,鹽脅迫能誘導(dǎo)SIZ1對MYB30進行SUMO化修飾。當把MYB30的SUMO化位點K283突變?yōu)榫彼岷?MYB30K283R無法恢復(fù)myb30-2突變體對鹽脅迫敏感的表型。這表明SUMO化修飾對于MYB30參與ABA調(diào)控的鹽脅迫響應(yīng)至關(guān)重要。GONG等[51]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定得到編碼交替氧化酶的AOX1a基因(alternativeoxidase1a)是MYB30的1個靶基因;在鹽脅迫下MYB30直接結(jié)合AOX1a的啟動子并上調(diào)其表達,而SUMO化位點發(fā)生突變的MYB30K283R無法結(jié)合AOX1a基因的啟動子,這表明MYB30的SUMO化修飾對于其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能是必須的。但是,鹽脅迫誘導(dǎo)MYB30的SUMO化過程是否也受到ABA的調(diào)控還需要更多的證據(jù)來證明?？傊?該發(fā)現(xiàn)提出了SIZ1-MYB30-AOX1a參與鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)控模型,可為耐鹽作物品種的創(chuàng)制和篩選提供途徑。

SUMO化修飾是一個可逆的過程,這個過程由SUMO化酶催化完成。WANG等[50]發(fā)現(xiàn),擬南芥SUMO化酶ASP1(ArabidopsisSUMO protease1)調(diào)控ABI5和MYB30的穩(wěn)定性。生化證據(jù)發(fā)現(xiàn),ABA可以誘導(dǎo)ABI5和MYB30蛋白的積累,但是和野生型相比,ABA處理后的asp1突變體中ABI5蛋白的積累降低,反而MYB30蛋白的積累升高,由此推測,ASP1正調(diào)控ABI5的穩(wěn)定性,同時負調(diào)控MYB30的穩(wěn)定性,最終正調(diào)控ABA信號通路。也就是說ASP1是ABA信號通路中的正調(diào)控因子。asp1突變體對ABA敏感程度降低也證明了這一結(jié)論。但是,ASP1作為去SUMO化的酶,卻對ABI5和MYB30蛋白的積累有相反的影響。這表明ABI5是否為ASP1的直接底物還有待商榷,有可能ASP1通過影響參與ABI5泛素化修飾的酶的穩(wěn)定性間接影響ABI5的穩(wěn)定性,也有可能SUMO化修飾并非對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性都起正向調(diào)控作用。

3.2 SnRK2s蛋白激酶的SUMO化修飾

SnRK2S是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要蛋白激酶,SnRK2.6/OST1受HOS15泛素連接酶的泛素化降解[23]。CUI等[52]和CHANG等[53]發(fā)現(xiàn),SUMO蛋白酶ESD4和其互作蛋白NUA(nuclear pore anchor)可通過去SUMO化SnRK2.6/OST1調(diào)控其穩(wěn)定性,從而負調(diào)控ABA信號通路。擬南芥NUA基因是動物Tpr(translocatedpromoterregion)基因的同源基因[54],編碼一類核孔錨定蛋白,是核孔復(fù)合體(nuclear pore complex,NPC)的一部分,與ESD4相互作用,調(diào)節(jié)ESD4的去SUMO化活性[55]。擬南芥nua和esd4突變體在種子的萌發(fā)及萌發(fā)后的生長方面都表現(xiàn)出對ABA超敏感的表型,并且更耐干旱脅迫和鹽脅迫。SnRK2s功能缺失能恢復(fù)nua或esd4突變體對ABA超敏感的表型,表明SnRK2s可能位于NUA和ESD4的下游。生化證據(jù)表明,NUA和ESD4負調(diào)控SnRK2s蛋白的穩(wěn)定性和激酶活性。體外SUMO化試驗表明,SnRK2.6蛋白可以被SUMO化修飾,而ESD4會降低SnRK2.6的SUMO化水平,因此,NUA與ESD4可能是通過去SUMO化修飾降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[52-53]。結(jié)合SnRK2被泛素化修飾的研究,推測SUMO化修飾之所以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,很有可能就是通過與泛素競爭結(jié)合蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基,后續(xù)還需要通過鑒定SUMO化位點來驗證。此外,與上述提到的ASP1相比,同樣作為SUMO蛋白酶的ESD4卻是ABA信號通路的負調(diào)節(jié)因子,由此可見其作用機制是不同的。abi5突變體也可以恢復(fù)nua突變體對ABA敏感的表型,那么NUA和ESD4是否直接調(diào)控ABI5去SUMO化修飾也是可探索的方向。此外,其他參與SUMO化修飾的基因也參與脅迫響應(yīng),但是是否通過ABA起作用,以及其中的作用機制還有待深入研究[56-59]。

4 泛素化和SUMO修飾共同調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

SUMO分子和泛素分子具有高度相似的三維結(jié)構(gòu),并且C端均有結(jié)合底物必要的Gly-Gly基序,兩者也都結(jié)合在靶蛋白的賴氨酸殘基上。但是兩者又有不同之處,比如兩者一級結(jié)構(gòu)相似性僅約18%,并且SUMO分子并不具有泛素分子形成多聚泛素化所需的48號賴氨酸殘基,但是SUMO的Gly-Gly殘基后有若干氨基酸序列延伸,需要剪切后才能成為成熟的SUMO分子[60]。由此看來,泛素化和SUMO化修飾雖有一定的相似之處,但又是完全不同的蛋白質(zhì)修飾方式。

關(guān)于泛素化修飾和SUMO化修飾在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中是如何相互協(xié)調(diào)作用的,在植物以外的其他物種中已有報道。一種可能是SUMO化修飾促進泛素化修飾,比如人FEN1(flap endonuclease1)蛋白被磷酸化修飾后,會發(fā)生SUMO化修飾,進而促進其被泛素化修飾,最后被蛋白酶體降解[61]。另一種可能是SUMO化和泛素化修飾之間是競爭關(guān)系,比如IκBα(inhibitor of nuclear factor-κB)被SUMO化修飾后,反而不易被泛素化修飾,也就提高了蛋白的穩(wěn)定性[60]。

以ABA信號通路的轉(zhuǎn)錄因子MYB30的調(diào)控為例,討論植物體內(nèi)泛素化修飾和SUMO化修飾相互影響的過程。MYB30不但被RHA2b催化發(fā)生泛素化修飾,還可以在SIZ1的作用下被SUMO化修飾[37,39,51]。將MYB30-SUMO1(模擬SUMO化狀態(tài)的MYB30)或MYB30轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體,當共表達RHA2b時,MYB30會發(fā)生降解,但是MYB30-SUMO1幾乎不被降解。ABA處理后,siz1突變體中的MYB30穩(wěn)定性降低,但是MYB30-SUMO1不受影響。這些結(jié)果均表明,SUMO化修飾的MYB30更穩(wěn)定,不易被泛素化降解。另外,通過split-LUC試驗發(fā)現(xiàn),ABA處理前,SIZ1-MYB30的互作強于RHA2b-MYB30,但是ABA處理后,SIZ1-MYB30互作無明顯變化,而RHA2b-MYB30相互作用增強,表明ABA促進MYB30的泛素化降解,而SIZ1能通過SUMO化MYB30保護其不被降解。此外,E3泛素連接酶RHA2b催化MYB30的K165和K283位點發(fā)生泛素化,其中K283也是SIZ1催化MYB30發(fā)生SUMO化修飾的位點[37,39]。這暗示了在MYB30的調(diào)控中,SUMO化修飾和泛素化修飾之間是拮抗的關(guān)系。ABI5[29,48,50]與SnRK2s[22-23,52-53]可以既被泛素化修飾也被SUMO化修飾,各種生化數(shù)據(jù)也暗示了2種翻譯后修飾是競爭關(guān)系。

此外,參與去SUMO化修飾的SUMO蛋白酶ASP1和ESD4功能缺失后,MYB30和SnRK2s更加穩(wěn)定[50,52-53],也暗示了SUMO化修飾對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是正向調(diào)節(jié)作用。但是,asp1突變體中ABI5的穩(wěn)定性反而下降。這可能是ASP1通過調(diào)節(jié)某一未知的ABI5上游元件的SUMO化,間接影響ABI5的穩(wěn)定性,也有可能SUMO化修飾并非對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性都起到正向調(diào)控作用。因此,還需要更多的證據(jù)來證明2種蛋白質(zhì)修飾之間的關(guān)系。

5 問題與展望

盡管已知許多ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的受體、PP2C磷酸酶、SnRK2激酶和一些轉(zhuǎn)錄因子都能夠被泛素化修飾,但是到目前為止,被證實可以被SUMO化修飾的靶基因只有ABI5[37,51]、MYB30[50]和SnRK2.6[52-53]。其他ABA信號通路的元件在受到泛素化修飾調(diào)控的同時,是否也可被SUMO化修飾還需要證明,并且2種修飾之間是否存在競爭關(guān)系也需要探究。另外,磷酸化修飾也是普遍存在于ABA信號通路中的重要的翻譯后修飾。有研究發(fā)現(xiàn),磷酸化修飾促進ABA受體PYR/PYL的泛素化降解[62]。因此,ABA信號通路中的許多元件都有多種翻譯后修飾調(diào)節(jié),相互之間的協(xié)同作用也有待研究和探索。

此外,在擬南芥中許多參與泛素化或SUMO化修飾相關(guān)的酶或其靶蛋白表達異常,或者靶蛋白的修飾位點發(fā)生突變,都會改變植物對ABA和各種逆境脅迫的響應(yīng)[42,57-59]。在作物中的同源蛋白同樣也參與逆境脅迫。楊樹(Populusalba)中U-box型E3泛素連接酶PalPUB79(plant U-box 79)通過調(diào)節(jié)ABA信號通路中的負轉(zhuǎn)錄因子PalWRKY77的泛素化降解,參與鹽脅迫響應(yīng)[63]。水稻(Oryzasativa‘Nipponbare’)SUMO蛋白酶OsOTS1(Overly tolerant to salt1)通過調(diào)控ABA和干旱脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子OsbZIP23的去SUMO化修飾,負調(diào)控ABA信號通路[64]。辣椒(CapsicumannuumL. ‘Nockwang’)中SIZ1的同源蛋白CaDSIZ1通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子CaDRHB1(干旱脅迫應(yīng)答的正調(diào)節(jié)因子)的SUMO化修飾參與干旱脅迫應(yīng)答[65]。由此看來,研究泛素化和SUMO化等修飾在ABA信號通路中的作用機制、挖掘農(nóng)作物中的相關(guān)功能基因,以及篩選和鑒定抗逆農(nóng)作物將具有重要的應(yīng)用前景。