江曉陽，王 艷，劉俊鏞，劉 旭，高亞東，孫景煜，張 越，尹建華

(青島匯豐動(dòng)物保健品有限公司，山東青島 266109)

雞傳染性支氣管炎是由雞傳染性支氣管炎病毒引起雞的一種急性、高度接觸性的呼吸道傳染病，其臨床癥狀為呼吸困難、發(fā)出啰音、張口呼吸、咳嗽，夜間關(guān)燈后癥狀尤為明顯[1-2]。如果病原不是腎病變型毒株或不發(fā)生并發(fā)病，死亡率較低；若是腎病變型毒株，可能在肝臟等器官看到白色尿酸鹽沉積，死亡率在20%左右[3]。

禽流感是禽流感病毒引起的一種對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害較大的一種疾病，根據(jù)不同致病性分為高致病性毒株、低致病性中弱毒株和非致病性無毒株[4]。高致病性毒株導(dǎo)致的病死率可達(dá)100%；有些低致病性毒株導(dǎo)致的雞死亡率為0～15%，另外飼養(yǎng)管理不當(dāng)、雞群營養(yǎng)狀況不良以及環(huán)境應(yīng)激因素都可能加重病情，當(dāng)發(fā)生并發(fā)感染時(shí)可使雞群死亡率升高[5]。

雞毒支原體感染是雞的一種慢性呼吸道病，流行于全世界雞場中，在國內(nèi)也普遍發(fā)生。根據(jù)血清學(xué)調(diào)查可知，雞毒支原體平均感染率為70%～80%[6]。感染雞通常表現(xiàn)為氣管啰音、咳嗽、流鼻涕、流眼淚，一側(cè)或兩側(cè)眼瞼腫脹或黏合[7]。一般來說，雞死亡率較低，發(fā)生環(huán)境應(yīng)激或者并發(fā)感染時(shí)雞死亡率升高，雞毒支原體常與呼吸道有關(guān)的疾病伴發(fā)[8]。

春秋季節(jié)肉雞多發(fā)呼吸道疾病，引起心衰、肺出血、水腫、發(fā)黑，甚至死亡，俗稱“心肺病”或“黑肺病”，引起這種疾病的病因尚不清楚。有人認(rèn)為，這是因?yàn)殡u場暴發(fā)過支原體感染，當(dāng)時(shí)根除不徹底，后期又感染了其他呼吸道疾病或細(xì)菌感染；也有報(bào)道認(rèn)為，引起該病的主要病原為低致病性禽流感病毒，又混合感染了其他細(xì)菌或病毒。大多數(shù)人認(rèn)為，該病為混合感染，增加了該病的診斷難度[9]。筆者通過病理學(xué)解剖、細(xì)菌分離培養(yǎng)、病毒分離鑒定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)和分子生物學(xué)檢測(cè)對(duì)山東省日照市某發(fā)病雞場5只病死雞進(jìn)行病因診斷，旨在為該病的防治與診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象山東省日照市某肉雞場病死雞5只、同一種雞場1日齡雛雞20只、10日齡SPF雞胚15枚。

1.2 試驗(yàn)儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)300，購自龍口市先科儀器公司)；PCR擴(kuò)增儀(型號(hào)A300，購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)；電泳儀(型號(hào)DYY-6C型，購自北京六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad GelDoc XR，購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司)；孵化器(購自山東德州旭升孵化設(shè)備研制中心)。

1.3 試驗(yàn)試劑營養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、SS瓊脂，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；病毒組基因DNA/RNA提取試劑盒、 2× AccurateTaq預(yù)混液，均購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1臨床診斷和剖檢。詢問并記錄雞群狀態(tài)，檢查病死雞體表并進(jìn)行剖檢，無菌采集相關(guān)病變組織(留下部分肝臟)，將病變組織與生理鹽水按1∶2的質(zhì)量比勻漿，反復(fù)凍融3次后離心取上清，備用(編號(hào)01)。

1.4.2細(xì)菌分離與培養(yǎng)。將無菌采集的肝臟按照細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法接種到營養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4.3病毒分離鑒定。實(shí)驗(yàn)組取01號(hào)取組織液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，接種于10枚10日齡SPF雞胚尿囊腔中。連續(xù)觀察72 h，每次間隔8 h，記錄死亡數(shù)。收取尿囊液以及胚體，供血凝試驗(yàn)以及分子生物學(xué)檢測(cè)(編號(hào)02)。

對(duì)照組取無菌生理鹽水，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，接種于5枚10日齡SPF雞胚尿囊腔中。連續(xù)觀察72 h，每次間隔8 h，記錄死亡數(shù)；收取尿囊液以及胚體，供血凝試驗(yàn)以及分子生物學(xué)檢測(cè)(編號(hào)03)。

1.4.4動(dòng)物回歸試驗(yàn)。將20只雛雞分成3組：一組12只，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)(試驗(yàn)組)，另一組5只注射生理鹽水(對(duì)照組)，剩余3只(空白組)按相關(guān)病變組織無菌采集相應(yīng)的組織，將組織與生理鹽水按1∶2的質(zhì)量比勻漿后，反復(fù)凍融3次、離心，取上清備用(編號(hào)04)。

取編號(hào)01組織液，對(duì)試驗(yàn)組7日齡肉雞進(jìn)行攻毒，攻毒方式為腿部肌肉注射和口服各0.2 mL。取無菌生理鹽水，對(duì)對(duì)照組7日齡肉雞進(jìn)行攻毒，攻毒方式為腿部肌肉注射和口服各0.2 mL。攻毒后觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組雞群的發(fā)育狀態(tài)，連續(xù)觀察14 d，每天觀察3～4次，于15日齡分別采集口、鼻以及泄殖腔棉拭子，試驗(yàn)組編號(hào)05，對(duì)照組編號(hào)06。

在觀察過程中記錄雞群狀態(tài)，及時(shí)處理死亡雞只，無菌采集病料，將病料與生理鹽水按1∶2的質(zhì)量比勻漿，反復(fù)凍融3次，離心后取上清，備用。第15天，對(duì)所有雞只進(jìn)行處理，無菌采集相關(guān)病料，試驗(yàn)組死亡雞只編號(hào)07、存活雞只編號(hào)08，對(duì)照組死亡雞只編號(hào)09、存活雞只編號(hào)10。

1.4.5分子生物學(xué)檢測(cè)。對(duì)上述所有編號(hào)的組織液以及尿囊液，根據(jù)核酸提取試劑盒說明書步驟提取核酸，并對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；用家禽?；己粑兰膊〔《镜囊镞M(jìn)行擴(kuò)增后，取6～7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，最后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察是否存在目的條帶。

反轉(zhuǎn)錄體系：dNTP Mixture 2.0 μL、5×Buffer 4.0 μL、M-MLV 0.5 μL、Random Primer(nonadeoxyribonucleotide mixture;pd(N)9)1.0 μL、Recombinant RNase Inhibitor 0.5 μL、RNA 12.0 μL，總體積為20.0 μL。 反轉(zhuǎn)錄程序：30 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，4 ℃下保存。

PCR擴(kuò)增體系：ddH2O 8.5 μL、2× AccurateTaqMix 12.5 μL、上游引物 1.0 μL、下游引物 1.0 μL、DNA/cDNA 2.0 μL，總體積25.0 μL。 PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 42 s，48～60 ℃ 42 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min，4 ℃下保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床診斷和剖檢山東省日照市某雞場突然發(fā)病，以呼吸道癥狀為主，經(jīng)詢問養(yǎng)殖場老板了解到該養(yǎng)殖場曾暴發(fā)過雞毒支原體感染，經(jīng)過一段時(shí)間凈化后雞群比較穩(wěn)定，該批雞苗進(jìn)場前雞場已徹底清洗消毒，雞苗進(jìn)場前免疫新城疫禽流感二聯(lián)苗，7日齡免疫雞傳染性支氣管炎4/91 QX型二聯(lián)減毒疫苗，前期雞群發(fā)育正常，15日齡個(gè)別雞出現(xiàn)氣喘，18日齡雞群出現(xiàn)咳嗽，關(guān)燈后尤為明顯，并出現(xiàn)雞只死亡，嚴(yán)重時(shí)死亡率高達(dá)18%。對(duì)死亡雞只進(jìn)行病理學(xué)剖檢，發(fā)現(xiàn)支氣管栓塞、氣管喉頭出血、肺出血水腫發(fā)黑、氣囊增厚且有干酪物、肝臟腫大、腎臟腫大、輸尿管有尿酸鹽沉淀、法氏囊腫大[10](圖1)。

注：A.支氣管栓塞；B.氣管喉頭出血;C.肺出血水腫發(fā)黑。Note：A.Bronchial embolism;B.Trachea laryngeal hemorrhage;C.Pulmonary edema，bleeding and blackening.圖1 病死雞剖檢結(jié)果Fig.1 Autopsy results of dead chickens

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)在營養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，經(jīng)觀察未發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌菌落生長(圖2)。

注：A.營養(yǎng)瓊脂;B.SS培養(yǎng)基;C.麥康凱培養(yǎng)基。Note：A.Nutrient Agar;B.Salmonella Shigella Agar;C.Maconkey Agar.圖2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果Fig.2 Results of bacteria isolation and culture

2.3 病毒分離鑒定試驗(yàn)組：接種雞胚后，前48 h雞胚發(fā)育正常，48 h后雞胚血管輕微脫落，64 h雞胚全部死亡。收取尿囊液，經(jīng)血凝試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有血凝現(xiàn)象發(fā)生，血凝效價(jià)為26。

對(duì)照組：接種雞胚后，雞胚發(fā)育正常，無死亡；64 h終止孵化，收取尿囊液后經(jīng)血凝試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)有血凝現(xiàn)象發(fā)生。

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)攻毒前對(duì)試驗(yàn)雛雞進(jìn)行病理學(xué)剖檢，未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。試驗(yàn)組試驗(yàn)前期雛雞生長發(fā)育正常，14日齡出現(xiàn)雞只羽毛蓬松、精神萎靡，有呼吸癥狀；16日齡死亡3只；17日齡死亡4只；18日齡死亡2只，剩余3只雞未死亡，但發(fā)育遲緩，采食量及飲水量下降。

對(duì)試驗(yàn)組死亡雞只進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)脾臟腫大出血，胰腺出血，腺胃黏膜易脫落，胃壁增厚、法氏囊腫大、有黏液，肺水腫出血，氣管喉頭出血，胸腺出血，腎腫大出血，氣囊增厚、個(gè)別有干酪物。

對(duì)試驗(yàn)組未死亡雞只進(jìn)行剖檢，其中2只雞法氏囊腫大，另1只雞組織器官正常；1只雞氣囊有干酪物，肺出血，肝臟正常，腎臟出血，法氏囊腫大、有黏液，氣管出血，腸道血管充血。

對(duì)照組雞只未死亡，發(fā)育正常，病理學(xué)剖檢未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。

2.5 分子生物學(xué)檢測(cè)對(duì)試驗(yàn)中所有編號(hào)樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3～6所示。

注：M為 DNA Marker 1 000；1.病死雞組織液；2.試驗(yàn)組雞胚尿囊液；3.對(duì)照組雞胚尿囊液；4.空白組雞只組織液；5.試驗(yàn)組口、鼻以及泄殖腔棉拭子；6.對(duì)照組口、鼻以及泄殖腔棉拭子：7.試驗(yàn)組死亡雞組織液；8.試驗(yàn)組未死亡雞組織液；10.對(duì)照組未死亡雞組織液。Note：M.DNA Marker 100 0;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth，nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth，nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.圖3 禽流感病毒PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR results of avian influenza virus

注：M為DNA Marker 1 000；1.病死雞組織液；2.試驗(yàn)組雞胚尿囊液；3.對(duì)照組雞胚尿囊液；4.空白組雞組織液；5.試驗(yàn)組口、鼻以及泄殖腔棉拭子；6.對(duì)照組口、鼻以及泄殖腔棉拭子;7.試驗(yàn)組死亡雞組織液；8.試驗(yàn)組未死亡雞組織液；10.對(duì)照組未死亡雞組織液。Note：M.DNA Marker 1 000;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth，nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth，nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.圖4 H9亞型禽流感病毒PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR results of avian influenza H9 subtype virus

注：M為DNA Marker 1 000；1.病死雞組織液；2.試驗(yàn)組雞胚尿囊液；3.對(duì)照組雞胚尿囊液；4.空白組雞組織液；5.試驗(yàn)組口、鼻以及泄殖腔棉拭子；6.對(duì)照組口、鼻以及泄殖腔棉拭子;7.試驗(yàn)組死亡雞組織液；8.試驗(yàn)組未死亡雞組織液；10.對(duì)照組未死亡雞組織液。Note：M.DNA Marker 1 000;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth，nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth，nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.圖5 雞毒支原體PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 PCR results of Mycoplasma gallisepticum

注：M為DNA Marker 1 000；1.病死雞組織液；2.試驗(yàn)組雞胚尿囊液；3.對(duì)照組雞胚尿囊液；4.空白組雞組織液；5.試驗(yàn)組口、鼻以及泄殖腔棉拭子；6.對(duì)照組口、鼻以及泄殖腔棉拭子;7.試驗(yàn)組死亡雞組織液；8.試驗(yàn)組未死亡雞組織液；10.對(duì)照組未死亡雞組織液。Note：M.DNA Marker 1 000;1.Tissue fluid from dead chickens;2.Experimental group chicken embryo allantoic liquid;3.Control group chicken embryo allantoic fluid;4.Blank group chicken tissue fluid;5.Cotton swabs from mouth，nose and cloaca of the experimental group;6.Control group cotton swabs from mouth，nose and cloaca;7.Tissue fluid of dead chickens in the experimental group;8.Undead chicken tissue fluid in the experimental group;10.Undead chicken tissue fluid in the control group.圖6 雞傳染性支氣管炎病毒PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.6 PCR results of avian infectious bronchitis virus

3 討論與結(jié)論

通過將病死雞病料組織液接種在雞胚上，可使雞胚致死，并且有血凝現(xiàn)象發(fā)生，說明病料含有毒力較強(qiáng)的血凝性病原；動(dòng)物回歸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雞死亡率達(dá)75%，說明病毒致死性強(qiáng)；通過分子生物學(xué)檢測(cè)確定雞群發(fā)生了雞傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒混合感染。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒檢測(cè)結(jié)果呈陽性，說明試驗(yàn)組前期發(fā)生了雞傳染性支氣管炎和H9亞型禽流感病毒排毒，后期死亡雞未檢出雞傳染性支氣管炎病毒，H9亞型禽流感病毒和雞毒支原體檢測(cè)結(jié)果呈陽性；未死亡雞檢測(cè)出雞毒支原體；對(duì)照組未檢出陽性病原。綜上所述，該雞場前期可能發(fā)生雞毒支原體隱性感染，機(jī)體免疫力低下。使用雞傳染性支氣管炎4/91 QX型二聯(lián)減毒疫苗免疫后，隨著時(shí)間的推移，疫苗毒力累計(jì)量增加，進(jìn)一步損害機(jī)體免疫器官，導(dǎo)致繼發(fā)感染H9亞型禽流感病毒，出現(xiàn)大量雞只死亡。