金鯧魚皮膠原蛋白肽改善光老化皮膚的作用研究

◎余 博

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 安慶 230036）

金鯧魚，一種海洋經(jīng)濟(jì)魚類，是近年來我國(guó)華南地區(qū)具有代表性的海水養(yǎng)殖品種之一。金鯧魚皮中含有豐富的膠原蛋白，據(jù)廖偉等研究，采用酶解法提取的金鯧魚皮膠原蛋白主要屬于Ⅰ型膠原[1]；對(duì)比大鯢、鯉魚源的膠原蛋白，金鯧魚皮膠原蛋白具有更高的變性溫度，同時(shí)還含有大量與抗氧化性有關(guān)的疏水性氨基酸。我們推測(cè)這些差異可能使金鯧魚皮膠原蛋白具有更特殊的生物學(xué)活性?；诖耍疚囊越瘀K魚皮為原料，制備膠原蛋白抗氧化肽，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性對(duì)光老化皮膚組織抗氧化能力及膠原蛋白合成的影響。

1 試驗(yàn)方法

1.1 魚皮膠原蛋白肽的制備

用自來水清洗魚皮后，將其剪成小塊，堿液浸泡24 h 以去除油脂，蒸餾水沖洗至pH=9.5，使用脂肪酶及堿性蛋白酶處理5 h，沉淀物浸泡2 h，而后用0.01 M 檸檬酸浸泡至腫脹，90 ℃水浴提取3 h，過濾后濃縮，噴霧干燥即得膠原蛋白。配置20 mg/mL 膠原蛋白溶液，50 ℃下用0.5%膠原蛋白酶酶解5 h，滅酶后使用堿性蛋白酶與胰蛋白酶質(zhì)量比為1:4 的復(fù)合酶酶解5 h，滅酶后濃縮凍干，得到魚皮膠原蛋白肽粉末，密封保存。

1.2 金鯧魚皮膠原蛋白肽分子量的測(cè)定

以金鯧魚皮膠原蛋白肽以及上述標(biāo)準(zhǔn)品為原料，流動(dòng)相分別配制5 mg/mL、1 mg/mL 的溶液，經(jīng)微孔過濾后進(jìn)樣。在0.5 mL/min 流速，214 nm 下進(jìn)行，取20 L 樣品溶液進(jìn)行分析。取得出的數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)值，使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行采集分析，與時(shí)間作標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算得出金鯧魚皮膠原蛋白肽樣品的分子量[2]。

1.3 氨基酸組成分析

準(zhǔn)確稱取金鯧魚皮膠原蛋白肽30 mg，加入體積為10 mL、濃度為6 M 的鹽酸溶液（溶液中含有0.5%巰基乙醇），而后使用氮?dú)膺M(jìn)行封管處理，在110 ℃條件下水解22 h，用超純水將水解液稀釋到體積為10 mL，并從水解液中取出1 mL 并在60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，再加入5～6 滴超純水洗滌、蒸干，重復(fù)3 次。然后加入0.02 M 鹽酸定容至5 mL，0.22 μm水膜層進(jìn)行過濾后的濾液放入液體瓶中，用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)上述過程處理后的濾液進(jìn)行測(cè)定。

1.4 DPPH 自由基清除率測(cè)定

分別將2 mL 金鯧魚皮膠原蛋白肽、羅非魚膠原蛋白肽、三文魚膠原蛋白肽以及2 mL 的0.15 mmol/LDPPH（以95%乙醇溶解）混合均勻。在黑暗中反應(yīng)30 min在517 nm 下測(cè)混合液吸光值，同時(shí)測(cè)定以等體積95%乙醇與樣液混合的吸光值，以及等體積95%乙醇與DPPH 混合液的吸光值。按式（1）計(jì)算金鯧魚皮膠原蛋白肽對(duì)DPPH 自由基的清除率：

1.5 ABTS 自由基清除率測(cè)定

ABTS 與過硫酸鉀混合在室溫、黑暗下反應(yīng)12～16 h。PBS 稀釋混合液至734 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)下吸光值為0.70±0.02。3.9 mL 稀釋液與0.1 mL 肽溶液混合反應(yīng)6 min 后，測(cè)量734 nm 處的吸光值。同條件下，PBS 代替肽溶液進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)出吸光值。按公式計(jì)算金鯧魚皮膠原蛋白肽、羅非魚膠原蛋白肽、三文魚膠原蛋白肽溶液的ABTS 自由基清除率：

式中：為空白樣品在734 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)處的吸光值；是試樣在該檢測(cè)波長(zhǎng)下的吸光度[3]。

1.6 還原力測(cè)定

將2.5 mL 肽溶液、2.5 mL pH=6.6 的磷酸鹽緩沖液、2.5 mL 1% 鐵氰化鉀溶液混合，并在50 ℃水浴20 min，冷卻后，加2.5 mL 10% 三氯乙酸，3 000 r/min 速度下離心10 min，取5 mL 上清液加入等體積超純水及1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，測(cè)定其700 nm 處的吸光度值。肽溶液的還原力以吸光值表示。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

以紫外線照射誘導(dǎo)建立光老化小鼠模型。用6%硫化鈉乙醇溶液對(duì)小鼠背部皮膚脫毛[4]。脫毛小鼠分為正常對(duì)照組（N）、模型組（M）和金鯧魚皮膠原蛋白肽高低劑量組（Tb-SCPH，Tb-SCPL），每組10 只小鼠。N、M 組都給予小鼠相同體積的生理鹽水；受試物高低劑量組分別灌胃300、600 mg/kg·d 的金鯧魚皮膠原蛋白肽，灌胃體積為1 mL/100 g·bw。光老化小鼠采用UVA 隔日照射的方式，前兩周，輻射劑量為最小紅斑劑量（MED），然后每周增加1 MED，4 MED 后保持不變，并采用紫外強(qiáng)度監(jiān)測(cè)儀記錄輻射量。末次灌胃0.5 h 后處死小鼠，取背部相同部位皮膚保存于-80 ℃?zhèn)溆肹5]。

1.8 皮膚中羥脯氨酸的測(cè)定

取皮膚組織約40 mg，130 ℃下封管水解4 h，移取0.5 mL 水解溶液，按照夏光華等的方法吸光值[6]，最后根據(jù)確定好的Hyd 標(biāo)準(zhǔn)曲線得出線性方程，并計(jì)算小鼠皮膚組織中Hyd 的濃度。

1.9 皮膚中抗氧化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

取皮膚組織適量，按照皮膚組織與生理鹽水1:9的比例進(jìn)行混合，使用離心機(jī)在7 000 r/min，4 ℃離心20 min，最后按試劑盒說明書測(cè)上清液中相關(guān)指標(biāo)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，LSD 法對(duì)結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05，差異有顯著性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tb-SCP 對(duì)DPPH 自由基清除率的影響

自由基清除劑能提供電子與DPPH 單電子配對(duì)，使混合液在檢測(cè)波長(zhǎng)處對(duì)光的吸收減少。圖1 為金鯧魚、三文魚、羅非魚魚皮膠原蛋白肽溶液對(duì)DPPH自由基清除率的影響。由圖1 可知，隨著肽溶液濃度增加，DPPH 自由基清除能力增強(qiáng)，且Tb-SCP 作用最顯著。在濃度為15 mg/mL 時(shí)，Tb-SCP 對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)45.11%。

圖1 金鯧魚、三文魚、羅非魚魚皮膠原蛋白肽溶液對(duì)DPPH 自由基清除率的影響圖

2.2 Tb-SCP 對(duì)ABTS 自由基清除率的影響

ABTS 在氧化劑的作用下會(huì)成為藍(lán)綠色的ABTS 自由基，自由基清除劑作用下該過程受到抑制。檢測(cè)波長(zhǎng)下吸光值的大小可間接反映肽溶液的抗氧化能力。圖2 表明隨著金鯧魚、三文魚、羅非魚的魚皮膠原蛋白肽濃度的增加，對(duì)ABTS 自由基的清除能力也變強(qiáng)。與前者相比，Tb-SCP 作用最為顯著，濃度15 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)93.97%。

圖2 金鯧魚、三文魚、羅非魚的魚皮膠原蛋白肽溶液對(duì)ABTS 自由基清除率的影響圖

2.3 Tb-SCP 對(duì)還原力的影響

溶液抗氧化能力可通過測(cè)定其還原能力來反映。通過測(cè)定肽溶液還原力可知，金鯧魚、三文魚、羅非魚的魚皮膠原蛋白肽溶液的還原力，都隨著濃度的增加而變大，三者中以Tb-SCP 的還原力最強(qiáng)，在溶液濃度為15 mg/mL 時(shí)，其吸光值達(dá)到了0.42。

2.4 Tb-SCP 對(duì)皮膚組織MDA 含量的影響

ROS 在體內(nèi)引起的過氧化使脂質(zhì)反應(yīng)為MDA，研究者往往通過測(cè)定組織內(nèi)MDA 含量反映組織受氧化造成損傷的程度，實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組MDA 含量較正常組增加了53.60%，說明紫外線照射造成了皮膚的氧化損傷，Tb-SCP 顯著地降低了小鼠皮膚中MDA 的含量，特別是高劑量組MDA 含量降低了28.70%，這些結(jié)果都表明Tb-SCP 能有效地抑制光老化皮膚中MDA 的含量，降低了小鼠體內(nèi)自由基的氧化反應(yīng)，減少了組織損傷。

2.5 Tb-SCP 提高皮膚組織羥脯氨酸含量

Hyp 是皮膚膠原蛋白合成的必需氨基酸，皮膚中羥脯氨酸含量變化可間接反映膠原蛋白的合成及含量情況，進(jìn)而反映皮膚衰老及恢復(fù)情況。實(shí)驗(yàn)表明：模型組皮膚羥脯氨酸含量遠(yuǎn)低于正常組小鼠皮膚，這說明紫外線照射引起膠原蛋白降解，羥脯氨酸流失，皮膚衰老；而Tb-SCP 明顯提高了皮膚中羥脯氨酸含量，這也表明其有助于促進(jìn)小鼠的膠原蛋白合成和延緩皮膚光老化引起的皮膚衰老。

3 討論

不同的抗氧化方法可以從不同的方面反映抗氧化劑的抗氧化能力，并闡述相關(guān)的抗氧化機(jī)制，本文主要選取測(cè)定了肽溶液對(duì)DPPH 自由基、ABTS 自由基的清除率和還原力，從自由基清除和還原能力兩方面的抗氧化機(jī)制評(píng)價(jià)Tb-SCP 的抗氧化活性。結(jié)果表明：Tb-SCP 具有很強(qiáng)的自由基清除能力和還原能力。將從金鯧魚皮中提取的膠原蛋白肽與市場(chǎng)上常見的淡水魚種羅非魚及深海魚種三文魚進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)金鯧魚皮膠原蛋白肽在自由基清除及還原方面能力均強(qiáng)于另兩個(gè)，充分證明了金鯧魚膠原蛋白肽具有良好的抗氧化性。

Hyp 是皮膚的成纖維細(xì)胞在合成膠原時(shí)所必需的氨基酸。與光老化組對(duì)比，Tb-SCP 組Hyp 含量顯著增高，這說明TbSCP 干預(yù)后，組織中膠原蛋白合成增高，降解降低。Tb-SCP 作用下，體內(nèi)抗氧化體系的平衡得到恢復(fù)，我們推測(cè)自由基所阻斷的TGF-β/smad 信號(hào)通路在Tb-SCP 的干預(yù)下得到了緩解，該通路中的重要因子TGF-β1 可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖。同時(shí)，該通路的恢復(fù)將指導(dǎo)體內(nèi)膠原蛋白合成增多，從而改善了皮膚光老化帶來的皮膚衰老問題。

4 結(jié)語

通過酶解法制備的Tb-SCP 分子量集中分布在500 Da，且具有良好的抗氧化能力。在體外可以有效清除自由基，在體內(nèi)具有良好的促進(jìn)體內(nèi)抗氧化體系平衡的作用。能提高光老化小鼠皮膚組織中GSH-Px、CAT 和SOD 的活力，降低MDA 含量，提高Hyp 含量，促進(jìn)膠原蛋白合成和抑制膠原蛋白降解，從而延緩光老化引起的皮膚衰老，是一種可供開發(fā)利用的抗光老化材料。