李揚波 董衛(wèi)國

結直腸癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，根據世界衛(wèi)生組織2020年發(fā)表的數(shù)據，結直腸癌發(fā)生率在世界惡性腫瘤排行表中居第3位,而且全球死亡病例數(shù)超93萬例，僅次于肺癌[1]。中國仍是結直腸癌高發(fā)國家，2015年新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)分別為388000和187000例[2]。盡管現(xiàn)代診療技術在癌癥治療領域取得了巨大進展，但是結直腸癌容易轉移，86%的終末期結直腸癌患者會在確診5年內死亡[3]。目前，結直腸癌的主要治療方式是手術和聯(lián)合放化療，但是由于化療藥物如5-氟尿嘧啶耐藥性問題日益嚴重，導致治療效果不盡人意。因此，有必要尋找新型低毒且高效的天然抗癌藥物，構建新的化療方案，避免結直腸癌耐藥性問題的進一步惡化。

紫檀芪是最初從紫檀心材中分離出來的植物代謝產物，廣泛存在于藍莓、葡萄等漿果中。紫檀芪是白藜蘆醇的天然類似物，但是比白藜蘆醇具有更強的親脂性和更高的細胞攝取潛力[4]。紫檀芪具有廣泛的藥理作用，如抗炎、降低血糖血脂以及營養(yǎng)神經等作用。既往研究證實，紫檀芪可對乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多種腫瘤發(fā)揮治療作用，但對結直腸癌的抗癌作用機制尚不明確[5～8]。本研究探討了紫檀芪在結直腸癌細胞增殖和凋亡過程中的作用及其機制。

材料與方法

1.實驗材料：人結直腸癌細胞株SW480、HCT116、DLD-1和人結腸上皮細胞NCM460購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；紫檀芪購自美國Selleck公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司; 青霉素、鏈霉素、CCK-8試劑盒、Hoechst 33258染色試劑盒、ROS檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司; Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司; Apaf-1、AIF、Bax、Bcl-2、Cyt C、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GAPDH、PCNA、survivin兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

2.細胞培養(yǎng)和分組：人結直腸癌細胞株(SW480、HCT116、DLD-1)和人結腸上皮細胞NCM460在質量濃度為100g/L胎牛血清、1%抗生素溶液(青霉素 100U/ml和鏈霉素100g/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)基， 37℃、體積分數(shù)為5%的CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選用處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗，分為梯度濃度紫檀芪處理組和陰性對照組，陰性對照組加入同濃度的DMSO。

3.細胞增殖實驗：用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。將細胞(5×103個/孔)接種在96孔培養(yǎng)板中，第2天更換上清液，在含有紫檀芪(0、10、20、40、60、80、120、160μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、24、48h。每孔加入CCK-8溶液10μl，再孵育2h，用酶標儀測定450nm處的吸光度(A)值。

4.Hoechst 33258熒光染色法： 利用Hoechst 33258染色試劑盒檢測細胞凋亡。將處于指數(shù)生長期的細胞種植于6孔板，培養(yǎng)24h。用含有紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，然后固定細胞，用PBS沖洗3次，按照說明書用Hoechst 33258染色液染色。在熒光顯微鏡下觀察和捕捉細胞凋亡的形態(tài)學特征。

5.Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細胞術：利用Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。將處于指數(shù)生長期的細胞種植于6孔板，培養(yǎng)24h。用含有紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，收集每孔細胞，PBS沖洗兩遍，離心收集細胞沉淀，按照說明書設置單染組和雙染組，單染組只加5μl Annexin V-PE或7-AAD，雙染組兩者均加，置于室溫避光孵育15min，隨后用流式細胞儀檢測。

6.ROS測定實驗：利用ROS檢測試劑盒測定細胞內ROS水平。將細胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后用不同濃度的紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)再培養(yǎng)24h。細胞在含10μmol/L DCFH-DA的1ml培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)20min，用PBS洗滌3次。然后用熒光顯微鏡觀測。

7.線粒體膜電位測定實驗：利用帶有JC-1探針的線粒體膜電位檢測試劑盒測定細胞線粒體膜電位。將細胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后用不同濃度的紫檀芪(0、20、40、80μmol/L)再培養(yǎng)24h。次日去除上清液，并用JC-1染料處理細胞1h，最后使用流式細胞儀檢測和分析細胞。

8.Western blot法檢測：經上述紫檀芪處理后，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。蛋白質經10% SDS-PAGE電泳分離后，轉膜，含濃度為5%的脫脂牛奶TBST中室溫封閉1h，TBST清洗4次，每次5min。隨后4℃下一抗孵育過夜，TBST清洗4次后，在室溫黑暗條件下二抗孵育1h，再用TBST洗滌4次，最后用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描。

結 果

1.紫檀芪抑制結直腸癌細胞的增殖：將3株結直腸癌細胞暴露于不同濃度的紫檀芪，CCK-8實驗結果顯示，紫檀芪能抑制結直腸癌細胞的增殖，且呈劑量和時間依賴性, 而在正常人結腸上皮細胞NCM460中，紫檀芪對其增殖的抑制作用較弱 (圖1)。此外，可觀察到SW480對紫檀芪最敏感，因此選SW480進行以下的實驗。

圖1 紫檀芪對細胞增殖的影響A.不同濃度的紫檀芪處理結直腸癌細胞(HCT116、SW480、DLD-1) 24h;B.不同濃度的紫檀芪對NCM460細胞的影響; C.不同濃度的紫檀芪處理 SW480 細胞 12、24和48h

2.紫檀芪促進結直腸癌細胞的凋亡：Hoechst 33258染色用于評估暴露于紫檀芪的結直腸癌細胞的細胞核，正常細胞核呈藍色熒光，而凋亡細胞核呈明亮的藍色熒光，伴有碎裂和染色質濃縮。隨機選擇的視野顯示，經紫檀芪處理后，結直腸癌細胞的細胞核凋亡水平增加，且呈劑量依賴性。流式細胞術的結果進一步顯示，紫檀芪處理組與對照組比較，結直腸癌細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 圖2)。

圖2 紫檀芪對結直腸癌細胞凋亡的影響A.Hoechst 33258染色觀察凋亡細胞(×100)； B.流式細胞術檢測凋亡率。與對照組比較，*P<0.05

3.紫檀芪通過線粒體途徑促進結直腸癌細胞凋亡：為了確定紫檀芪是否通過線粒體凋亡途徑促進結直腸癌細胞凋亡，評估了ROS水平和線粒體膜電位水平的變化。結果表明，與對照組比較，紫檀芪提高了結直腸癌細胞內ROS水平，降低了線粒體膜電位水平，且呈劑量依賴性(P<0.05, 圖3)。Western blot法檢測用于評估線粒體凋亡途徑相關蛋白的水平。結果顯示，與對照組比較，紫檀芪處理結直腸癌細胞24h后，AIF、Apaf-1、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達量增加，Bcl-2、PCNA、survivin表達量減少，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 圖4)。

圖3 紫檀芪對結直腸癌細胞內ROS及線粒體膜電位的影響A.DCFH-DA 探針染色觀察胞內ROS水平(×200)；B.流式細胞術檢測線粒體膜電位水平

圖4 紫檀芪對結直腸癌細胞線粒體途徑的影響與0μmol/L比較，*P<0.05

討 論

抗癌藥物主要通過誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮作用，而細胞凋亡途徑主要有兩種：外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑[9]。內源性細胞凋亡主要通過線粒體途徑來實現(xiàn)，是一種進化上高度保守的細胞凋亡形式，對多細胞生物的發(fā)育和內環(huán)境穩(wěn)定中起著舉足輕重的作用[10]。線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放是維持線粒體動態(tài)穩(wěn)定的核心環(huán)節(jié)，特殊刺激施加于線粒體可以使MPTP的開閉狀態(tài)改變，實現(xiàn)線粒體通透性的變化，從而在線粒體途徑中發(fā)揮著關鍵作用[11]。ROS主要來源于線粒體，而線粒體又是ROS的靶標之一， MPTP短期且可逆地開放會釋放少量ROS，有利于細胞生長；然而，持續(xù)且不可逆地打開MPTP會導致ROS的爆炸性釋放，從而導致氧化應激反應損傷線粒體膜完整性甚至細胞[12]。ROS的積累會損傷線粒體膜，導致氧化應激損傷線粒體膜， 隨后MPTP持續(xù)開放，從而使得細胞內具有促進凋亡的蛋白Cyt C和AIF從線粒體釋放，在細胞質中不斷累積[13,14]。緊接著，Cyt C與半胱氨酸蛋白酶家族因子Apaf-1相互作用，Bcl-2家族蛋白被釋放到細胞質中，加速細胞凋亡過程[15]。

傳統(tǒng)化療藥物隨著耐藥性的增加，對癌癥的治療效果有限，且細胞毒性等不良反應影響了患者的生活質量[16]。目前，開發(fā)新型低毒、高效的抗結直腸癌藥物，探索其作用機制成為研究熱點[17]。紫檀芪作為植物產生的天然代謝產物，在多種腫瘤中已證明具有高效的抗癌作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪誘導肝癌細胞氧化應激，通過線粒體途徑抑制肝癌細胞增殖、促進肝癌細胞凋亡[18]。然而，紫檀芪對結直腸癌細胞的抑制作用機制暫不明確，本研究探討了紫檀芪對結直腸癌細胞的抑制作用機制。

經不同濃度的紫檀芪處理結直腸癌細胞后，結果顯示，紫檀芪顯著抑制了結直腸癌細胞的增殖，并且抑制作用呈劑量和時間依賴性。此外，DCFH-DA探針染色和流式細胞術結果分別表明了紫檀芪可以提高結直腸癌細胞的ROS水平、降低線粒體膜電位水平。同時，Hoechst 33258染色和Annexin V-PE/7-AAD雙染流式結果表明紫檀芪能夠顯著促進結直腸癌細胞凋亡，提示紫檀芪可能激活氧化應激、通過線粒體途徑誘導結直腸癌細胞凋亡。因此，筆者進一步通過Western blot法測定線粒體凋亡途徑相關蛋白的表達水平。結果顯示，與對照組比較，紫檀芪處理組細胞的Apaf-1、AIF、Bax、Cyt C、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的水平顯著升高，Bcl-2、PCNA和survivin的水平顯著降低。綜上所述，紫檀芪可增加結直腸癌細胞內ROS水平、降低線粒體膜電位水平，通過線粒體途徑促進結直腸癌細胞的凋亡，并且抑制細胞增殖、遷移和侵襲，提示紫檀芪具有治療結直腸癌的潛在應用價值。