陳彧，周國英，彭江濤，董曉娜，饒丹丹，韓豫

1.海南省林業(yè)科學(xué)研究院(海南省紅樹林研究院)，海南?？?571100；

2.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410004

土沉香(Aquilaria sinensis)，又名白木香、女兒香、莞香、崖香，為瑞香科沉香屬植物，國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[1-2]，是中國名貴芳香類藥材沉香的唯一植物來源[3]，主產(chǎn)于海南、廣西、廣東、福建、臺(tái)灣等省份及香港特別行政區(qū)。健康的土沉香植株，在人為或者自然方式脅迫條件下樹干木材組織發(fā)生的生物化學(xué)防御反應(yīng)，導(dǎo)致酯類物質(zhì)逐漸增多的過程稱為結(jié)香，形成的樹脂的木塊為沉香[4]。沉香因具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等藥用功效[5]，在亞洲、中東和歐洲被廣泛用于醫(yī)藥。同時(shí)沉香具有獨(dú)特的香味，也是一種傳承歷史悠久的名貴香料，品質(zhì)好的沉香在市場上甚至可以賣到上萬元或者幾萬元的價(jià)格，被稱為“香中的鉆石”[6-7]。隨著沉香市場價(jià)格走高，土沉香的野生資源被人為濫伐，導(dǎo)致野生資源破壞。為了保護(hù)野生沉香資源，同時(shí)增加沉香產(chǎn)量，中國海南、廣東、臺(tái)灣、福建、廣西等地開始了廣泛的土沉香培育及促進(jìn)土沉香結(jié)香技術(shù)研發(fā)工作。目前關(guān)于土沉香的結(jié)香機(jī)制，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量研究[8-16]，無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但是大多數(shù)認(rèn)為土沉香結(jié)香與真菌侵染有關(guān)。目前從土沉香植物結(jié)香部位分離出的內(nèi)生真菌主要有黃綠墨耳菌(Melanotus flavolivens)、鐮刀菌(Fusarium)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、曲霉(Aspergillus)、磚紅鐮孢(Fusarium laseritum)、青霉(Penicillium)、毛霉(Mucor)、木霉(Trichoderma)、裂褶菌(Schizophyllum)、刺盤抱菌(Colletotrichum)等。但是關(guān)于是否促進(jìn)土沉香結(jié)香還存在爭議。該研究采用平板組織分離法從土沉香已結(jié)香部位分離內(nèi)生真菌；選用沉香主要成分芐基丙酮篩選耐藥性強(qiáng)的內(nèi)生真菌；通過輸液人工造香法測定內(nèi)生真菌侵染力及促進(jìn)結(jié)香研究，為后續(xù)高效生物復(fù)合結(jié)香誘導(dǎo)劑的研制及其應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)，為沉香產(chǎn)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自海南省海口市瓊山區(qū)云龍鎮(zhèn)海南省林業(yè)科學(xué)研究院（海南省紅樹林研究院）云龍科研基地（19°52′N，110°28′E）10 年生土沉香在人工創(chuàng)傷2 年自然結(jié)香木塊。沉香樣品采集后于48h內(nèi)進(jìn)行表面消毒。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：將馬鈴薯刮去表皮，切成大小基本一致的小塊，稱取200g 去皮后的馬鈴薯小塊，放入電磁爐中煮，煮至可用玻璃棒輕輕戳爛，之后用紗布過濾得到馬鈴薯濾液，往濾液中加入葡萄糖20g、瓊脂20g，最后加蒸餾水定容至1L。PDB 培養(yǎng)基中不需要添加瓊脂。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

利用已經(jīng)消毒的生長錐進(jìn)行取樣。取樣部位表面采用75%酒精進(jìn)行消毒，取樣后立即放入滅菌袋中，儲(chǔ)藏運(yùn)輸。在進(jìn)行下一次取樣之前，生長錐用75%酒精和無菌水滅菌，最后用無菌濾紙擦拭。

1.3.2 內(nèi)生真菌分離純化

樣品表面消毒，依次使用無菌水沖洗樣品表面3 次，沖洗完之后將樣品用滅菌好的鑷子夾入75%酒精中自然漂洗30s，漂洗過后在反復(fù)使用無菌水沖洗樣品表面3 次，沖洗完之后在將樣品放入升汞中自然浸泡3min，最后在使用無菌水反復(fù)沖洗4 次；吸取最后處理樣本的無菌水沖洗液涂布于完全培養(yǎng)基中作為相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)。若培養(yǎng)后出現(xiàn)菌落，則說明樣品表面消毒不徹底。

樣品表面消毒完成后，采用組織分離法用無菌刀片切去表面材料，將樣品的結(jié)香部分均切成小塊，將樣品對(duì)稱放置于含鏈霉素(50U/mL) 的PDA 平板上，恒溫箱中28℃培養(yǎng)。待有菌落形成后，使用菌絲尖端挑取法，將長出的菌落菌絲體轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上，重復(fù)純化3 次～4 次直至獲得純培養(yǎng)的菌株。

1.3.3 內(nèi)生真菌分子鑒定

使用真菌基因組DNA 提取試劑盒，提取篩選出來的內(nèi)生真菌DNA，利用真菌ITS 通用引物對(duì)從白木香中分離得到的內(nèi)生真菌基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；初步了解內(nèi)生真菌的分類地位。

1.3.4 促結(jié)香真菌篩選

（1）耐藥性優(yōu)勢菌株篩選

配制PDA 培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻到50℃～60℃，往培養(yǎng)基里滴加2 滴0.10%吐溫-80 作為乳化劑，加入沉香主要成分之一的芐基丙酮，快速混勻后倒平板，配置成體積分?jǐn)?shù)為0.05%濃度的芐基丙酮培養(yǎng)基。用6mm 的打孔器在接有活化好的內(nèi)生真菌的PDA 平板上打出直徑約為6mm 的圓形菌餅，然后用滅菌接種針各挑取1 塊圓形菌餅置于含芐基丙酮的培養(yǎng)基平板中央，同時(shí)以置于不含芐基酮的空白處理，每個(gè)處理和對(duì)照均設(shè)置3 次重復(fù)，置于26℃下恒溫避光培養(yǎng)4d 后，觀察真菌的生長狀況，計(jì)算芐基丙酮對(duì)菌株的抑制率，選取對(duì)耐受能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行下一步復(fù)篩。

（2）促結(jié)香真菌復(fù)篩

將分離出來并初步鑒定的內(nèi)生真菌接種到PDB培養(yǎng)基中，28℃、180r/min 搖床培養(yǎng)7d～9d，液體培養(yǎng)物經(jīng)慢速過濾得到孢子懸浮液備用。在8 年生土沉香植株高80cm 處用直徑0.8cm 電鉆打孔，采用輸液法將發(fā)酵液注射入樹體中，每個(gè)樹體注入200ml發(fā)酵液。將孢子懸浮液接種到8 年生土沉香樹上，每個(gè)菌種接種3 棵樹，三個(gè)月后觀察樹體注射孔顏色變化，并采取部分材料進(jìn)行燃燒，觀察燃燒情況，根據(jù)燃燒香味，初步篩選優(yōu)勢結(jié)香真菌。

1.3.5 促結(jié)香真菌分子鑒定

由于單基因鑒定對(duì)親緣關(guān)系較近的物種分辨率較低，鑒定誤差也相對(duì)較高；因此針對(duì)促結(jié)香真菌，采用多基因進(jìn)行聯(lián)合鑒定，以確保鑒定的準(zhǔn)確性。針對(duì)鐮刀菌屬促結(jié)香真菌，利用ITS、TEF、histone H3三基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增與鑒定；利用ITS、β-tub、RPB2 三基因?qū)γ邔俚拇俳Y(jié)香真菌進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定（引物序列、PCR 反應(yīng)程序及體系見表1、表2），委托湖南某公司完成PCR 產(chǎn)物測序。將測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中blast，在Gen Bank 數(shù)據(jù)庫中下載同源性高的基因序列，利用mafft 軟件進(jìn)行比后，在SequenceMatrix 軟件中進(jìn)行多基因序列的連接，最后在MEGA 7.0 軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，從而確定篩選的促結(jié)香真菌分類地位。

表1 基因引物序列及PCR 反應(yīng)程序Tab.1 Gene Primer Sequence and PCR Reaction Program

表2 PCR 反應(yīng)體系Tab.2 The PCR Reaction System

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離及鑒定

通過組織分離方法，共從土沉香結(jié)香木質(zhì)部中分離純化出34 株內(nèi)生真菌，根據(jù)ITS 單基因測序鑒定結(jié)果，可以初步分為10 個(gè)屬（鐮刀菌屬Fusarium、毛色二孢屬Lasiodiplodia、間座殼屬Diaporthe、Crassiparies、棒束孢屬Isaria、擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis、格孢腔屬Pleosporales sp、輪層炭菌屬Daldinia、環(huán)紋炭團(tuán)菌屬Annulohypoxylon、炭團(tuán)菌屬Hypoxylon），其中鐮刀菌屬4 個(gè)種共15 株占比44.11%、毛色二孢屬2 個(gè)種共7 株占20.58%、輪層炭菌屬2 個(gè)種5株占14.7%、Hypoxylon2 個(gè)種2 株占5.88%。

2.2 促結(jié)香真菌篩選結(jié)果

2.2.1 耐藥性優(yōu)勢菌株篩選

將分離篩選的34 株內(nèi)生真菌，分別接種在含有芐基丙酮（體積分?jǐn)?shù)0.05%）的PDA 培養(yǎng)基上，同時(shí)接種在空白的PDA 培養(yǎng)基上，3 次重復(fù)（結(jié)果見表3）。從表3 可以得出，芐基丙酮對(duì)所分離的內(nèi)生菌株均有一定程度的抑制作用，其中CX-3-2 的抑制率最低，為33.76%，該菌株的耐芐基丙酮的能力最強(qiáng)，CX-3 等15 個(gè)菌株的抑制率低于60%，具有一定的耐藥性，初步入圍耐藥性優(yōu)勢菌株，主要為鐮刀菌屬和毛色二孢菌屬真菌。

表3 優(yōu)勢耐藥內(nèi)生菌株耐芐基丙酮效果Tab.3 The Effect of Endogenous Fungi Resistant to Benzyl Acetone

注：菌落直徑大小為3 次重復(fù)平均值，抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑—處理菌落直徑）*100/（對(duì)照處理直徑-6）；同行中的“**”標(biāo)示在P＜0.01 水平差異顯著。

2.2.2 促結(jié)香真菌復(fù)篩

將2.2.1 初步篩選的15 株優(yōu)勢耐藥內(nèi)生菌孢子懸浮液接種到8 年生土沉香樹上，每個(gè)菌種接種3 棵樹。接種后三個(gè)月后，用砍刀將菌種發(fā)酵液注射孔及其周圍的表皮去掉后，部分處理肉眼觀察發(fā)現(xiàn)孔洞周圍的木質(zhì)部已經(jīng)發(fā)黑變色，變色方向主要是向兩端縱向延伸（圖1），能引起樹體接種口顏色變化的內(nèi)生真菌分別屬于鐮刀菌屬和毛色二孢菌屬真菌CX-1-1、CX-G-3-2、CX-1-2、CX-G-2-2、CX-1-5和CX-C3-1。因此選定CX-1-1、CX-G-3-2、CX-1-2、CX-G-2-2、CX-1-5 和CX-C3-1。將取出的黑色木塊組織肉眼觀察無腐化爛木現(xiàn)象，且經(jīng)燃燒試驗(yàn)后無異味黑煙，而是白色帶有淡香的煙氣。初步認(rèn)為，變色樹脂部分為沉香，所篩選的耐藥菌可以促進(jìn)結(jié)香。

圖1 菌液對(duì)土沉香樹體結(jié)香影響（A：注射菌液；B：侵染能力調(diào)查；C：注射孔顏色變化）Fig.1 Fungal Inoculation induces Agarwood in Aquilaria sinensis（A：Fungal Inoculation，B：Infection Investigation，C：Injection Hole Color Changes）

2.3 促結(jié)香真菌分子鑒定結(jié)果

將鐮刀菌屬真菌的三基因序列進(jìn)行Nu-cleotide Blast 分析，結(jié)果顯示CX-1-1 的ITS、TEF、histone H3 三基因分別與Genbank 登錄號(hào)MT529824.1、MN386735.1、MK482251.1 均具有99%的同源性，CX-1-2ITS 基因與 Genbank 登錄號(hào)MN871563.1 具有99%同源性，TEF 基因與Genbank登錄號(hào)JQ412106.1 具有100%同源性，histone H3基因與Genbank 登錄號(hào)KX681550.1 具有99%同源性；CX-G-2-2 的ITS 基因與Genbank 登錄號(hào)MT509801.1 具有100%同源性，TEF 和histone H3基因分別與 Genbank 登錄號(hào) MK414218.1 和GU737427.1 均具有99%同源性；CX-G-3-2 的ITS 和TEF 基因分別與Genbank 登錄號(hào)MF281192.1 和KC820964.1 均具有98%同源性，histone H3 基因與Genbank 登錄號(hào)KM231522.1 具有100%同源性。如圖2，CX-1-1 與Fusarium oxysporum、CX-1-2 與Fusarium fujikuroi、CX-G-2-2 與Fusarium proliferatum 和CX-G-3-2 與Fusarium solani 均聚在同一支，并且支持率分別為100%、95%、91%和100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征可以將菌株分別鑒定為CX-1-1 為Fusarium oxysporum（尖孢鐮刀菌）、CX-1-2 為Fusarium fujikuroi（藤倉鐮刀菌）、CX-G-2-2 為Fusarium proliferatum（層出鐮刀菌）、CX-G-3-2 為Fusarium solani（腐皮鐮刀菌）。

圖2 鐮刀菌屬三基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic Tree Obtained from Combined Sequence Data of ITS，TEF and Histone H3 Gene Regions and Generated from Maximum Likelihood Analysis of Fusarium

毛色二孢屬真菌三基因blast 結(jié)果顯示：CX-1-5 的ITS、β-TUB 和RPB2 三基因分別與Genbank 登錄號(hào)MN887200.1、MN867365.1 和MF410182.1 均具有100%同源性；CX-C3-1 的ITS 和RPB2 基因分別與 Genbank 登錄號(hào) MH644067.1 和XM_035516989.1 均具有99%同源性，β-TUB 基因與Genbank 登錄號(hào)MG813976.1 具有98%同源性；如圖3 所示，CX-1-5 與 Lasiodiplodia pseudotheobromae聚在同一分支，并且支持率有99%，CX-C3-1 與Lasiodiplodia theobromae 有97%的支持率聚在同一分支上；結(jié)合形態(tài)特征可將CX-1-5 鑒定為Lasiodiplodia pseudotheobromae（假可可毛色二孢）、CX-C3-1鑒定為Lasiodiplodia theobromae（可可毛色二孢）。

圖3 毛色二孢屬三基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic Tree Obtained from Combined Sequence Data of ITS，β-TUB and RPB2 Gene Regions and Generated from Maximum Likelihood Analysis of Diospora

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

采用平板組織分離法從土沉香結(jié)香部位分離內(nèi)生真菌，通過沉香主要成分芐基丙酮耐藥性初篩及打洞輸液法結(jié)香復(fù)篩土沉香優(yōu)勢結(jié)香真菌，并進(jìn)行分子鑒定。從已結(jié)香的土沉香木質(zhì)部中初步分離出內(nèi)生真菌34 株，通過形態(tài)學(xué)及ITS 分子初步鑒定歸于7 目7 科10 屬，其中鐮刀菌屬（Fusarium）為優(yōu)勢屬，其次為毛色二孢屬（Lasiodiplodia）。經(jīng)芐基丙酮耐藥性及人工造香復(fù)篩，篩選出6 種優(yōu)勢促結(jié)香真菌，鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、藤倉鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、假可可（毛色二孢Lasiodiplodia pseudotheobromae）、可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）。

3.2 討論

內(nèi)生真菌普遍存在于植物中，內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量與植物種類、生長環(huán)境、分離方法密切相關(guān)。該研究從已結(jié)香的沉香木質(zhì)部中初步分離出內(nèi)生真菌34 株，通過形態(tài)學(xué)及ITS 分子初步鑒定歸于7 目7 科10 屬，其中鐮刀菌屬為優(yōu)勢屬，其次為毛色二孢屬。張秀環(huán)等[17]從樹齡為7a 的白木香健康部位和樹脂形成部位共分離出42 株內(nèi)生真菌，還發(fā)現(xiàn)枝頂孢霉屬為健康部位優(yōu)勢菌屬，青霉屬為結(jié)香部位優(yōu)勢菌屬，而Gong[18]和王磊[19]、黃秋偉[20]等人研究均發(fā)現(xiàn)白木香結(jié)香部位中優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬，馬華明[21]通過對(duì)比土沉香創(chuàng)傷組和結(jié)香組真菌種類差異，認(rèn)為括多變根毛霉（Rhizomucor variabilis）、再育鐮刀菌（Fusarium proliferatum）和哈茨木霉（Hypocrea lixii），能促進(jìn)沉香的形成。該研究結(jié)果與前人分離真菌結(jié)論有差異也有相似之處，這可能與樣品的所處地域環(huán)境不同，該研究樣品來自土沉香原生地-海南，屬于潮濕溫暖熱帶地區(qū)，微生物多樣性更豐富，或者是環(huán)境條件這些外在因素影響了內(nèi)生真菌的侵染和多樣性，進(jìn)一步驗(yàn)證沉香的形成是多種真菌復(fù)合作用的結(jié)果。

內(nèi)生真菌與植株形成了互惠互利的共生關(guān)系，不但可以自身合成與宿主植物相似活性成分，還具有促進(jìn)宿主植物合成活性成分的能力[22]。芐基丙酮是沉香芳香族化合物的代表性活性成分，對(duì)于促進(jìn)結(jié)香的內(nèi)生真菌首先在一定程度上對(duì)沉香活性成分具有耐受性[20]。該研究通過沉香主要成分芐基丙酮耐藥性及人工造香篩選，篩選出6 株優(yōu)勢促結(jié)香真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)及多基因系列分子鑒定為尖孢鐮刀菌、藤倉鐮刀菌、層出鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、假可可毛色二孢、可可毛色二孢。Tabata 等人[23]研究發(fā)現(xiàn)5 種鐮刀菌均能促使白木香結(jié)香。陳旭玉等人[24]研究發(fā)現(xiàn)沉香木中優(yōu)勢菌種為可可毛色二孢菌，在可可毛色二孢菌的發(fā)酵液中檢測到茉莉酸類物質(zhì)，并且白木香愈傷組織在被其發(fā)酵液處理過后，可以檢測出3 種倍半萜物質(zhì)[25]。腐皮鐮刀菌與白木香粉末進(jìn)行固體發(fā)酵，經(jīng)過波譜分析鑒定出了7 種沉香的有效成分，腐皮鐮刀菌的發(fā)酵液也可以誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生倍半萜物質(zhì)[26]，并且在大米上進(jìn)行發(fā)酵后，其發(fā)酵產(chǎn)物中含有脂肪烴類、甾體類和鐮紅菌素類[27]。尖孢鐮刀菌的發(fā)酵液中會(huì)含有一種抗腫瘤的吲哚生物堿長春新堿和纖維素酶[28-29]。因此可推測在多種真菌的作用下，真菌和其發(fā)酵液產(chǎn)物對(duì)促進(jìn)白木香結(jié)香均具有一定的作用，為下一步生物復(fù)合結(jié)香誘導(dǎo)劑的研制奠定基礎(chǔ)。