殼寡糖對過氧化氫誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的改善作用及機(jī)制

劉 朋，侯智興，茅洪維，李 恒,*，龔勁松，蔣 敏，許泓瑜，許正宏，史勁松,*

（1.糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；4.糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122）

氧化應(yīng)激與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其引起的過量氧自由基或活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以導(dǎo)致DNA和細(xì)胞大分子大規(guī)模損傷，如改變膜的流動(dòng)性和通透性、破壞細(xì)胞骨架、促進(jìn)蛋白變性等，最終引起細(xì)胞凋亡、癌變等在內(nèi)的細(xì)胞功能障礙現(xiàn)象[1-2]。因此，抗氧化應(yīng)激治療成為改善疾病進(jìn)程的有效策略之一。殼寡糖（chitooligosaccharides，COS）作為自然界中的一種低聚寡糖，具有抗腫瘤、抗凝、傷口修復(fù)、抗氧化等生理活性。此外，COS在酒精性肝損傷、脂肪肝、肝癌等多種肝臟疾病中均表現(xiàn)出較好的改善效果，但其具體作用機(jī)制仍然不清楚[3-5]。鑒于氧化應(yīng)激在肝臟疾病中的重要作用[6-7]，本實(shí)驗(yàn)利用過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)肝細(xì)胞L-02建立氧化應(yīng)激細(xì)胞損傷模型，分析COS對其保護(hù)作用，為COS的保肝作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

COS（聚合度2～4） 揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司；胎牛血清 以色列Biological Industries公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、活性氧熒光探針（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）上海碧云天生物試劑公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 上海翊圣生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、H2O2美國Sigma-Aldrich公司；SYBR Green Mix試劑盒 瑞士Hoffmann-La Roche公司；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒 日本同仁公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan MK3全波長酶標(biāo)儀 德國Eppendorf公司；CFX96 Touch熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析儀美國Bio-Rad公司；CytoFlex流式細(xì)胞儀 美國Beckman公司；實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模態(tài)分析儀 江蘇瑞明生物科技有限公司；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

L-02細(xì)胞生長在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3.2 L-02細(xì)胞存活率檢測

待細(xì)胞生長至對數(shù)期后，用胰蛋白酶消化以獲得細(xì)胞懸液，96 孔板中每孔加入相同體積的L-02細(xì)胞懸液（1.2×104個(gè)），靜置培養(yǎng)24 h。棄上清液，并加入添加或不添加COS（終質(zhì)量濃度31.25、62.5、125、250、500、1 000 μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后吸棄每孔培養(yǎng)基，用pH 7.5磷酸鹽緩沖溶液（phosphatebuffered saline，PBS）沖洗3 遍，更換含10% CCK-8溶液的無血清培養(yǎng)基，避光孵育1.5～2.0 h后于450 nm波長處檢測OD值，根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3 H2O2刺激L-02細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立

96 孔板每孔加入同體積L-02細(xì)胞懸液（1.2×104個(gè)），待細(xì)胞貼壁后，添加不同濃度H2O2（0.5、1、2、4、8 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)1 h。然后通過CCK-8檢測不同分組細(xì)胞在450 nm波長下的吸光度，細(xì)胞存活率計(jì)算同1.3.2節(jié)，通過計(jì)算細(xì)胞存活率以確定H2O2造模濃度。

同體積的L-02細(xì)胞懸液加入96 孔板中（1.2×104個(gè)）。細(xì)胞分為對照組、模型組（H2O2組）、低劑量組（質(zhì)量濃度100 μg/mL COS）、中劑量組（質(zhì)量濃度200 μg/mL COS）和高劑量組（質(zhì)量濃度400 μg/mL COS）。待細(xì)胞完全貼壁后，根據(jù)分組不添加或添加不同質(zhì)量濃度的COS至培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在最后1 h時(shí)加入H2O2（終質(zhì)量濃度為1 mmol/L、母液濃度為880 mmol/L）。后續(xù)細(xì)胞存活率檢測同1.3.2節(jié)，ROS水平分析方法見1.3.4節(jié)。

1.3.4 ROS水平測定

激光共聚焦顯微鏡分析：細(xì)胞處理參照1.3.3節(jié)。細(xì)胞在H2O2處理后，去掉培養(yǎng)基并用PBS清洗3 遍后，加入10 mmol/L DCFH-DA探針（終濃度為10 μmol/L），避光37 ℃孵育30 min后，無血清培養(yǎng)基清洗3 遍。然后加入Hoechst 33342探針孵育15 min進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染。最后，在發(fā)射波長（λex）/激發(fā)波長（λem）＝488 nm/525 nm和λex/λem＝346 nm/460 nm條件下經(jīng)激光共聚焦顯微鏡拍照觀察。

流式細(xì)胞儀分析：步驟同上，在獲得細(xì)胞懸液（1×106個(gè)/100 μL）后加入1 μL DCFH-DA探針避光37 ℃孵育30 min后，850 r/min離心3 min，PBS清洗掉未進(jìn)入細(xì)胞的游離探針。最后重懸于PBS中，選擇熒光素5-異硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）通道進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

單細(xì)胞納米生化分析：步驟同上，分析質(zhì)量濃度400 μg/mL COS對損傷單細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，倒掉培養(yǎng)基并用PBS清洗3 遍后，更換0.5 mL新鮮無血清培養(yǎng)基。參照Zheng Xinting等[8-9]方法，在正常1640培養(yǎng)基中孵育，記錄穩(wěn)態(tài)背景熒光（F0），之后將光纖納米探針精確插入單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，隨即在培養(yǎng)基中添加0.5 mL質(zhì)量濃度20 μmol/L DCFH-DA探針溶液，通過熒光檢測系統(tǒng)在單個(gè)細(xì)胞中測定熒光強(qiáng)度（F1）以動(dòng)態(tài)觀察胞內(nèi)ROS水平變化情況。

1.3.5 線粒體膜電位變化測定

細(xì)胞處理參照1.3.3節(jié)。在獲得細(xì)胞懸液（1×106個(gè)/100 μL）后加入質(zhì)量濃度5 μg/mL羅丹明123探針避光37 ℃孵育30 min后，850 r/min離心3 min，PBS清洗去掉未入胞的游離探針。最后重懸于PBS中，選擇FITC通道進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.3.6 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析

分離總RNA后，根據(jù)Hifair?III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將0.5 μg RNA逆轉(zhuǎn)成目標(biāo)cDNA。反應(yīng)體系為200 ng cDNA，各5 nmol/L的上下游引物，SYBR Green混合物，總體系體積為10 μL，在95 ℃15 s、60 ℃ 30 s條件下反應(yīng)，共40 個(gè)循環(huán)。測定核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 p45-related factor 2，Nrf2）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）、半胱氨酸蛋白酶 9（Caspase9）、β細(xì)胞淋巴瘤-2（β-cellymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)蛋白X（Bcl-2-associated X protein，Bax）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）基因的相對表達(dá)水平，并用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析。引物序列見表1。

表1 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物序列Table 1 Primer sequences used for florescence quantitative polymerase chain reaction

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P＜0.05具有顯著性差異。所有數(shù)據(jù)結(jié)果用GraphPad Prism 5軟件分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 COS對L-02細(xì)胞存活率的影響

COS處理24 h后，與對照組比較，COS在質(zhì)量濃度31.25～1 000 μg/mL范圍內(nèi)對L-02細(xì)胞增殖能力無顯著影響（P＞0.05）（圖1）。

圖1 COS對L-02細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of COS on L-02 cell viability

2.2 H2O2對L-02細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的影響

由圖2可知，隨H2O2濃度的增加，L-02細(xì)胞增殖活力逐漸降低，與對照組比較，當(dāng)1 mmol/L H2O2刺激細(xì)胞1 h時(shí)細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.05），而且細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出明顯的皺縮、變圓及觸角斷裂等變化。綜合考慮，選擇1 mmol/L H2O2誘導(dǎo)L-02細(xì)胞1 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 H2O2對L-02細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of H2O2 on proliferation of L-02 cells

2.3 COS對損傷L-02細(xì)胞增殖活力的改善作用

如圖3所示，相較于對照組，H2O2組細(xì)胞增殖活力顯著降低（P＜0.05）。與H2O2組相比，低劑量組（質(zhì)量濃度100 μg/mL COS）對細(xì)胞增殖活力無顯著改善作用（P＞0.05），而中劑量和高劑量COS可以顯著提高H2O2損傷L-02細(xì)胞的增殖活力（P＜0.05）。進(jìn)一步觀察細(xì)胞形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，COS明顯改善了氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞皺縮、變圓等狀態(tài)。

圖3 COS對H2O2損傷L-02細(xì)胞的改善作用Fig.3 Ameliorative effect of COS on proliferation and morphology of H2O2-injured L-02 cells

2.4 COS對損傷L-02細(xì)胞ROS水平的改善作用

DCFH-DA是檢測ROS的最常用探針，本身無熒光，滲透進(jìn)胞內(nèi)后熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。經(jīng)DCFH-DA探針檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，H2O2組的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，經(jīng)COS處理后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度則呈下降趨勢（圖4A）。通過流式細(xì)胞儀定量分析發(fā)現(xiàn)，H2O2組平均熒光強(qiáng)度高度顯著高于對照組（P＜0.001），與H2O2組比較，COS中高劑量組平均熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05）（圖4B）。另外，通過單細(xì)胞納米生化分析儀檢測發(fā)現(xiàn)，加入DCFH-DA探針后，與對照組比較，H2O2組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，高劑量COS干預(yù)組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度則明顯低于H2O2組，結(jié)果表明，COS處理后可以緩解胞內(nèi)ROS水平升高（圖5）。

圖4 COS對H2O2損傷L-02細(xì)胞ROS水平的改善作用Fig.4 Effect of COS on ROS level in H2O2-injured L-02 cells

圖5 L-02單細(xì)胞中ROS水平變化Fig.5 Changes in ROS level in single L-02 cells

2.5 COS對損傷L-02細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響

線粒體膜電位的下降象征了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。如圖6所示，相較于對照組，H2O2組中線粒體膜電位下降的細(xì)胞占比高度顯著提高（P＜0.001）。與H2O2組相比，質(zhì)量濃度200 μg/mL和400 μg/mL COS處理則極顯著或高度顯著降低了該部分細(xì)胞的占比（P＜0.01、P＜0.001）。以上結(jié)果說明COS的處理能夠明顯改善由H2O2造成的L-02細(xì)胞凋亡。

圖6 COS對H2O2損傷L-02細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響Fig.6 Effect of COS on mitochondrial membrane potential of H2O2-injured L-02 cells

2.6 COS對H2O2損傷L-02細(xì)胞炎癥和凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量的影響

鑒于氧化應(yīng)激損傷與細(xì)胞凋亡之間具有直接關(guān)系，為進(jìn)一步評(píng)估COS對損傷細(xì)胞的修復(fù)作用，本實(shí)驗(yàn)探究了損傷細(xì)胞炎癥、凋亡相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)量。如圖7所示，與對照組比較，H2O2組細(xì)胞炎癥因子相關(guān)基因IL-6、TNF-α和凋亡相關(guān)基因Caspase 3、Caspase 9、BaxmRNA相對表達(dá)量極顯著或高度顯著提高（P＜0.01、P＜0.001）；與H2O2組相比，COS處理后細(xì)胞炎癥因子相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因存在下降趨勢，而與對照組比較，Bcl-2mRNA相對表達(dá)量在H2O2組細(xì)胞中高度顯著下降（P＜0.001）。經(jīng)COS處理后，Bcl-2mRNA相對表達(dá)量較H2O2組顯著升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。

圖7 COS對H2O2損傷L-02細(xì)胞炎癥和凋亡相關(guān)基因水平的影響Fig.7 Effect of COS on mRNA expression levels of inflammation- and apoptosis-related genes in L-02 cells injured by H2O2

2.7 COS對H2O2損傷L-02細(xì)胞Nrf2/HO-1通路的調(diào)控作用

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Nrf2與其下游調(diào)控因子HO-1二者通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為探究COS的潛在作用機(jī)制，分析了Nrf2和HO-1mRNA相對表達(dá)量。如圖8所示，與對照組比較，H2O2組細(xì)胞Nrf2、HO-1mRNA相對表達(dá)量高度顯著或極顯著提高（P＜0.001、P＜0.01）；與H2O2組相比，中、高劑量COS孵育后Nrf2、HO-1mRNA相對表達(dá)量顯著或極顯著下降（P＜0.05、P＜0.01）。這說明Nrf2/HO-1通路可能參與了COS抗L-02細(xì)胞損傷的作用過程中。

圖8 COS對H2O2損傷L-02細(xì)胞Nrf2/HO-1通路的影響Fig.8 Effect of COS on Nrf2/HO-1 signaling pathway in H2O2-injured L-02 cells

3 討 論

氧化應(yīng)激反應(yīng)在腫瘤、炎癥以及神經(jīng)性疾病中均發(fā)揮重要作用，而肝臟作為機(jī)體主要的解毒器官，在物質(zhì)代謝和解毒過程中極易受到氧化應(yīng)激的損傷，從而引起肝臟的炎癥、水腫甚至壞死現(xiàn)象發(fā)生[10-12]。機(jī)體內(nèi)過量ROS的出現(xiàn)是氧化應(yīng)激的主要表現(xiàn)形式，主要由肝臟中的線粒體產(chǎn)生，并由抗氧化酶、II相代謝酶等清除ROS，從而維持氧化還原系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)[13-14]。然而有害刺激可以打破氧化應(yīng)激的平衡狀態(tài)，氧化應(yīng)激刺激能夠通過線粒體、死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡及病理損傷[15]。因此，以高水平ROS為特征的氧化應(yīng)激與肝病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系越來越密切，尋找具有高抗氧化能力的ROS清除劑顯得十分有必要。

COS作為天然抗氧化劑，被廣泛應(yīng)用于功能性食品的開發(fā)利用，已有報(bào)道顯示COS擁有抗炎、降血脂、降血糖、心腦血管疾病保護(hù)等獨(dú)特的生理活性[5-7,16-18]。H2O2通過誘導(dǎo)ROS的過量產(chǎn)生導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或脂質(zhì)損傷，是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型最常用的促氧化劑[19]。本實(shí)驗(yàn)通過H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞L-02氧化應(yīng)激反應(yīng)，用來探究COS對肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的改善效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COS可以降低H2O2誘導(dǎo)L-02細(xì)胞氧化應(yīng)激的ROS水平，改善細(xì)胞增殖活力及細(xì)胞病理狀態(tài)。監(jiān)測單個(gè)細(xì)胞內(nèi)ROS動(dòng)態(tài)變化有助于了解COS對其作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給予H2O2刺激后，與對照組相比，未經(jīng)COS處理的L-02細(xì)胞內(nèi)ROS水平高度顯著升高（P＜0.001），然而，COS處理組的胞內(nèi)ROS水平則一定程度上低于H2O2組。

鑒于氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡具有直接誘導(dǎo)關(guān)系，因此，評(píng)估COS對損傷L-02細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用十分有意義。細(xì)胞生理功能的正常發(fā)揮依賴于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)形成的梯度電位，因此，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞早期凋亡的一種表現(xiàn)形式[20]。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)線粒體膜電位降低或喪失，能量耗盡，而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21-23]。在H2O2誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，線粒體膜電位明顯下降，COS可以顯著改善損傷細(xì)胞的線粒體膜電位下降情況。Caspase 3作為Caspase家族成員之一，是參與細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵蛋白酶，扮演著細(xì)胞凋亡實(shí)施者的角色[24]。Bcl-2和Bax是目前已知的Caspase 3上游調(diào)控基因，Bax在外界刺激因素下可以聚集到線粒體膜上，并通過形成多聚體形式破壞線粒體膜，從而影響膜內(nèi)離子濃度，促進(jìn)促凋亡因子的釋放[25-26]。促凋亡因子會(huì)激活Caspase 9，而活化的Caspase 9進(jìn)一步誘導(dǎo)Caspase 3活化。但是Bcl-2的高表達(dá)可以抑制促凋亡因子的釋放，平衡氧化應(yīng)激反應(yīng)，阻斷凋亡進(jìn)程[27]。本研究中COS可以抑制H2O2誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中Caspase 3、Caspase 9、Bax基因水平的高表達(dá)，提高Bcl-2基因水平，進(jìn)一步體現(xiàn)出COS對損傷細(xì)胞的抗凋亡效果。有研究發(fā)現(xiàn)，COS在神經(jīng)元損傷和腸道氧化應(yīng)激損傷中均可以通過降低Caspase家族的表達(dá)水平從而發(fā)揮保護(hù)作用[28-29]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。Nrf2作為細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白，介導(dǎo)著胞內(nèi)凋亡、炎癥等多種生理反應(yīng)，可增強(qiáng)下游抗氧化酶的表達(dá)，在機(jī)體抗氧化應(yīng)激過程中起重要作用。然而，本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，H2O2刺激提高細(xì)胞中Nrf2基因的表達(dá)水平，且COS可逆轉(zhuǎn)其水平。陳晶晶等研究發(fā)現(xiàn)，H2O2亦可誘導(dǎo)SH-EP1細(xì)胞中Nrf2的高表達(dá)[30]。在生理狀態(tài)下，Nrf2以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其級(jí)聯(lián)效應(yīng)。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)進(jìn)一步檢測細(xì)胞核內(nèi)Nrf2及其下游因子的蛋白水平變化情況，以剖析COS改善L-02細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制。

綜上，COS可改善H2O2誘導(dǎo)L-02細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激損傷，研究結(jié)果可為COS的進(jìn)一步功能評(píng)價(jià)和應(yīng)用提供一定的參考。