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      乳制品中糠氨酸和乳鐵蛋白常用檢測方法綜述

      2023-04-07 00:06:56徐大江馬占峰趙麗娟
      中國乳業(yè) 2023年1期
      關(guān)鍵詞:氨酸鐵蛋白毛細管

      徐大江,馬占峰,趙麗娟,李 波

      哈爾濱市產(chǎn)品質(zhì)量綜合檢驗檢測中心,黑龍江哈爾濱 150090

      0 引言

      隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展,人們對乳制品的需求日益旺盛。乳制品的消費價值絕不僅僅是脂肪、蛋白質(zhì)、糖類、維生素等營養(yǎng)物質(zhì),還有其中存在的很多生物活性成分,其含量雖然少但作用卻大,可以參與人體的重要生理功能。目前市場貨架上最為常見的常溫奶,所采用的加工工藝為超高溫瞬時殺菌工藝,即用134 ℃左右的高溫,把原奶瞬間消毒4 s,雖然可以殺滅細菌,但與此同時也破壞了牛奶中很多熱敏感的活性物質(zhì)。因此,2016年國家奶業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟發(fā)起實施了推動奶業(yè)可持續(xù)發(fā)展的專項研究項目——優(yōu)質(zhì)乳工程,在提倡“優(yōu)質(zhì)乳產(chǎn)自本土”的同時,更是提倡用科學(xué)的低溫巴氏殺菌工藝,即加工溫度72~80 ℃,時間15 s,最大限度地保留了牛奶中的天然活性營養(yǎng)。

      目前,國家優(yōu)質(zhì)乳核心標準規(guī)定,優(yōu)質(zhì)乳的技術(shù)指標除了主要包括脂肪、蛋白質(zhì)、非脂乳固體、污染物[1]、真菌毒素、微生物、營養(yǎng)成分[2]等,還包括一些熱敏感和生物活性物質(zhì)指標如糠氨酸、乳鐵蛋白等。本文從優(yōu)質(zhì)乳中熱敏感和生物活性物質(zhì)指標糠氨酸和乳鐵蛋白的檢測方法進行綜述,為今后研究糠氨酸、乳鐵蛋白的檢測方法提供參考。

      1 糠氨酸及其檢測方法

      糠氨酸是乳制品中美拉德反應(yīng)早期所產(chǎn)生的系列產(chǎn)物之一,是判斷乳制品受熱程度的重要指標之一[3],其和乳制品中活性營養(yǎng)成分含量負相關(guān)[4]。通過檢測乳制品中的糠氨酸含量可以鑒定巴氏殺菌乳中是否摻入復(fù)原乳或添加乳粉、煉乳等,還可以確定乳制品的加工工藝參數(shù)[5~11]。目前,在乳制品中糠氨酸的主要檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和毛細管色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。

      1.1 高效液相色譜法

      2004年國際標準化組織國際乳制品聯(lián)合會(IDF)發(fā)布的ISO18329和我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 939中檢測乳制品中的糠氨酸含量的方法均為高效液相色譜法。何瑛等[12]進一步優(yōu)化了流動相組合、色譜柱類型和酸水解條件,即選擇了以三氟乙酸作為離子對試劑+甲醇的流動相體系組合,耐受高比例的水相以及更低pH流動相的HSS T3色譜柱,采用10.6 mol/L鹽酸溶液進行酸水解試驗,結(jié)果為:標準曲線線性的R2=0.999 7,方法檢出限1.5 mg/100 g蛋白質(zhì),在5~30mg/L的加標濃度下,加標回收率91.48%~91.73%,相對標準差(RSD)值為0.13%~0.37%。黃文強等[13]也采用5 mL,0.1%三氟乙酸溶液流動相配制工作液,未采用腐蝕性的鹽酸,避免鹽酸對色譜柱的損傷,選擇耐受低酸度流動相的C18 SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5 μL)反相色譜柱,相對于普通C18 色譜柱,延長了色譜柱使用壽命,結(jié)果為:標準曲線線性的R2=0.999 0,加標回收率為90.6%~93.8%,測定含量135 mg/100g蛋白質(zhì)時,RSD值為0.73%。

      高效液相色譜法具有分離能力高、分離時間短、靈敏度高、柱效高、可反復(fù)使用、流動相可控等優(yōu)點,但缺點是色譜柱造價比較高,乳制品前期處理時間長(24 h),糠氨酸上機液過酸容易導(dǎo)致色譜系統(tǒng)損壞等。

      1.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

      采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測乳制品中的糠氨酸,可先將樣品中的蛋白質(zhì)進行水解,選用固相萃取柱凈化樣液,利用液相色譜將凈化液中的糠氨酸進行分離,再通過質(zhì)譜采用正離子化模式和多反應(yīng)監(jiān)測模式對糠氨酸進行定性定量分析。具體步驟是在密閉的玻璃瓶中加入100 mg樣品和4 mL 6mol/L的鹽酸,封閉玻璃瓶,110 ℃烘箱中加熱水解20 h,水解后過濾,取400 μL水解液使用氮氣吹干,用流動相定容上機,檢出限0.003 mg/L,線性范圍0.009~1.000 mg/L[14]。

      液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的前處理方法與高效液相色譜法相似,具有簡便、抗干擾、靈敏度高等優(yōu)點。但液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法相對于高效液相色譜法對上機液和流動相要求更高,使得液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的前處理過程更加復(fù)雜。

      1.3 毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用法

      毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用法是一種新型的分離檢測技術(shù),以毛細管為分離通道、利用待測物之間淌度和分配行為上的不同從而實現(xiàn)分離,再通過質(zhì)譜檢測樣品離子強度以進行定性和定量,是分析生物大分子物質(zhì)的有力工具。具體步驟是在樣品水解完成后,過濾,然后使用氮氣吹干;使用流動相定容上機;在使用毛細管電泳之前,新的毛細管電泳必需使用0.1 mol/L鹽酸潤洗5 min,之后,使用超純水潤洗5 min,以避免質(zhì)譜中電噴霧電離源被污染[15]。毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用法的糠氨酸檢出限為0.07 mg/L,定量限為0.25 mg/L,回收率為77%~97%。

      毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用法對生物大分子具有較好地分離檢測效果,但是毛細管電泳和質(zhì)譜接口還存在一定缺陷,可能會降低檢測靈敏度,維護成本較高。

      2 乳鐵蛋白及其檢測方法

      乳鐵蛋白作為生鮮牛乳中的天然成分,具有廣譜的抗菌、消炎、抑制腫瘤細胞生長及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用?!皣覂?yōu)質(zhì)乳工程”提出鈣和蛋白質(zhì)只是乳制品的基礎(chǔ)指標,天然活性營養(yǎng)才是乳制品真正的核心價值,而乳鐵蛋白是優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳天然活性營養(yǎng)之一。目前,尚未出臺檢測乳制品中的乳鐵蛋白的國家標準,本文結(jié)合行業(yè)標準、團體標準等進行乳鐵蛋白檢測方法的總結(jié),其常用檢測方法有免疫學(xué)分析法,包括免疫擴散法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析快速檢測法;色譜法,包括高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細管電泳法、凝膠電泳檢測法。

      2.1 免疫學(xué)分析法

      2.1.1 免疫擴散法

      免疫擴散法是將混有乳鐵蛋白抗體的瓊脂糖,凝凍后打一些小孔,以小孔為中心的抗原-抗體反應(yīng)沉淀帶環(huán)狀區(qū)域被染色,通過觀察沉淀帶環(huán)的直徑與乳鐵蛋白抗原濃度的關(guān)系即可定量測定待測樣品中乳鐵蛋白的含量。龔廣予等[16]建立隨機免疫擴散法檢測乳鐵蛋白,通過乳鐵蛋白與抗血清的免疫反應(yīng),經(jīng)過了染色、脫色和清洗,最終測量到反應(yīng)沉淀帶的直徑與抗體濃度成正比,證明免疫擴散法可用于檢測乳制品中乳鐵蛋白的含量。

      該方法成本相對低廉,但操作步驟相對復(fù)雜,檢測耗時相對較長,并且檢測結(jié)果需通過人為精確測量環(huán)的直徑才能得到結(jié)果,容易產(chǎn)生人為不確定度,故在實際檢測中的應(yīng)用并不廣泛。

      2.1.2 酶聯(lián)免疫法

      酶聯(lián)免疫法是目前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測方法。它是使用與酶連接的抗原或抗體與乳鐵蛋白抗體或抗原產(chǎn)生反應(yīng),再根據(jù)反應(yīng)顏色的程度進行該抗原定性和定量的方法。由于酶的催化效率很高,故可極大地放大反應(yīng)的結(jié)果,從而使該方法有很高的靈敏度。豐東升等[17]用乳鐵蛋白為抗原免疫小鼠,獲得13 株單克隆抗體作為一抗,用辣根過氧化物酶標記的多克隆抗體為二抗,建立了牛乳鐵蛋白的雙抗體夾心ELISA檢測方法,最低檢測限為0.05 ng/mL,檢測范圍為0.05~3.20 ng/mL。張英華等[18]應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測定牛初乳中乳鐵蛋白的含量,最小檢出量為0.5 ng/mL,淺性范圍為0.8~100.0 ng/mL,標準曲線相關(guān)性為0.996。鄭云鵬等[19]采用市售乳鐵蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒,檢測了奶粉中乳鐵蛋白含量,加標回收率為87.21%~115.6%,準確性高,優(yōu)化后的樣品前處理方案使得檢測結(jié)果穩(wěn)定性也更高。

      酶聯(lián)免疫法雖然靈敏度高,但因其特異性對試劑的選擇性高,不能同時分析多種成分,僅能對單一蛋白質(zhì)進行分析,不適合用于大批量的樣品分析。

      2.1.3 免疫層析快速檢測法

      免疫層析快速檢測法是將免疫標記技術(shù)與層析技術(shù)相結(jié)合的一種檢測技術(shù)。利用標記物的顯色特性和層析的分離技術(shù)檢測待測物。劉楚新[20]以轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白牛奶為檢測對象,研發(fā)出2 種膠體金免疫層析試紙條,實現(xiàn)了乳鐵蛋白的快速檢測,結(jié)果與常規(guī)檢測方法一致,可作為牛奶中乳鐵蛋白檢測的有效方法。

      該方法可對大量樣本中的目標物質(zhì)進行快速篩查,而且不需要對樣品進行前處理,與其他化學(xué)檢測方法相比,具有簡便、快速、特異性強的優(yōu)點。但該方法會出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果的風(fēng)險,不適用于復(fù)雜乳制品及相關(guān)食品的檢測,也不適用于執(zhí)法機構(gòu)進行判別確證。

      2.2 色譜分析法

      2.2.1 高效液相色譜法

      高效液相色譜法是利用不同物質(zhì)在固定相和流動相之間極性大小不同從而進行分離,并被特定檢測器檢測的一種檢測技術(shù)。廖菁菁等[21]建立了高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的檢測方法,即用0.08 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液在pH=8.0時提取樣品,經(jīng)肝素親和柱凈化處理,用C4反相色譜柱分離,DAD檢測器于280 nm處檢測,方法檢出限為5 mg/100 g,回收率為81.0%~92.0%。梁政洋等[22]用水牛的乳蛋白多態(tài)性規(guī)律,建立指紋圖譜快速區(qū)分水牛乳和荷斯坦牛乳,選擇C8色譜柱;檢測波長設(shè)定為215 nm;柱溫:45 ℃;用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸乙腈進行梯度洗脫,分離出的κ-CN/A、αs2-CN、κ-CN/B、αs1-CN、β-CN、β-LgB、α-La峰面積相對標準偏差(RSD)<5%,對乳蛋白進行分離后建立指紋圖譜,當(dāng)荷斯坦牛乳摻入2%時可被檢測到。

      該方法因具有反應(yīng)靈敏、結(jié)果準確、重復(fù)性好等優(yōu)點,可作為團體標準乳制品中乳鐵蛋白測定的標準檢測方法,但因乳制品的基質(zhì)成分相對復(fù)雜,需要肝素親和柱進行凈化處理,對樣品純度要求較高,且設(shè)備昂貴。

      2.2.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

      高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是通過肝素親和色譜法純化乳鐵蛋白,然后用于篩選胰蛋白酶標記肽,選擇特征肽,并通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法從純化的水解產(chǎn)物中進行鑒定,進而實現(xiàn)乳鐵蛋白定量檢測。張敏等[23]建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛乳和嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量的方法。具體步驟是將樣品加水溶解,經(jīng)過二硫蘇糖醇和碘代乙酰胺溶液反應(yīng),加入胰蛋白酶進行酶解,用乙腈水溶液定容上機。標準曲線線性R2>0.995,平均加標回收率為93.5%~117.1%,相對標準偏差為1.4%~6.7%。

      該方法可用于牛乳中乳鐵蛋白的測定,但前處理過程需將乳鐵蛋白酶解,而活性與非活性乳鐵蛋白均可參與此過程,致使最終的檢測結(jié)果為樣本中乳鐵蛋白的總量,并不能區(qū)分樣本中活性乳鐵蛋白與非活性乳鐵蛋白。

      2.2.3 毛細管電泳法

      毛細管電泳法是以毛細管為分離通道、以高壓電場為驅(qū)動力,根據(jù)待測物質(zhì)分離柱效不同而實現(xiàn)分離的一種液相分離技術(shù)。該方法的柱效隨分子量的增大而上升,而乳鐵蛋白是生物大分子,可用該方法進行快速準確檢測。劉宇等[24]建立的動態(tài)涂層毛細管電泳檢測乳鐵蛋白的方法,可檢測出乳鐵蛋白A、乳鐵蛋白B、乳鐵蛋白C、乳鐵蛋白D,4 種不同乳鐵蛋白原料的純度,RSD分別為1.0%,0.8%,1.2%,0.9%。顧媛等[25]建立了嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的檢測方法,樣品經(jīng)脫脂、去沉淀富集、過濾凈化,結(jié)果為:標準曲線線性R2=0.999 2,平均回收率為92.8%。雖然毛細管電泳對生物大分子物質(zhì)具有較好的分離檢測效果,但是毛細管壁易吸附乳鐵蛋白,導(dǎo)致檢測重復(fù)性差,不能滿足基體復(fù)雜樣品中乳鐵蛋白的測定。

      2.2.4 凝膠電泳檢測法

      凝膠電泳檢測法是選擇一種能夠與乳鐵蛋白結(jié)合的DNA作為探針分子,根據(jù)DNA乳鐵蛋白結(jié)合物與未結(jié)合乳鐵蛋白的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率不同,結(jié)合條帶的是否減少及減少程度,從而實現(xiàn)對乳鐵蛋白含量的檢測。孫娜娜等[26]建立了一種毛細管凝膠電泳檢測乳鐵蛋白的方法,利用乳鐵蛋白和DNA序列的特異性結(jié)合,根據(jù)游離DNA峰面積減少程度實現(xiàn)乳鐵蛋白的定性定量分析。

      此方法無需借助色譜、光譜等大型儀器,無需樣品預(yù)處理,通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測具有快速、低成本、通量高的特點,但操作相對繁瑣,不適合大批量樣品的測定。

      3 結(jié)論

      隨著乳品企業(yè)開發(fā)高品質(zhì)乳制品力度的加強,靈敏、可靠、快速、容易普及的檢測方法和手段也急需跟進,為乳制品的安全保駕護航。傳統(tǒng)的檢測方法有些方法簡便,但靈敏度差;有些雖然靈敏度高,但樣品處理繁瑣、儀器昂貴,因而不適于高頻次、高通量的檢測。未來建議繼續(xù)重點開發(fā)高效、快捷的檢測方法和檢測設(shè)備,以提高乳制品中糠氨酸和乳鐵蛋白的檢測效率。

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