陳麗飛，李嘉峻，劉云怡慧，白 云，孟 緣，李 江，周蘊薇

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學 林學與草學學院，吉林 長春 130118；2.定西市水土保持科學研究所，甘肅 定西 743000；3.吉林農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，吉林 長春 130118）

萱 草（Hemerocallisspp.）屬 阿 福 花 科（Asphodelaceae）萱草屬（Hemerocallis），多年生草本植物，民間多稱其“忘憂草”[1-2]。萱草屬植物分布廣泛、適應性強、品種繁多、觀賞價值高，被稱為中國的“母親花”。大苞萱草（Hemerocallis middendorffii）是現(xiàn)代萱草的原始親本之一，主要分布在我國東北、華北等地。大苞萱草抗旱能力強、花色艷麗，而且具有二次開花特性，可廣泛應用于各類園林綠地或進行盆栽裝飾。

干旱不僅限制著植物的正常生長發(fā)育，還會影響植物體的代謝功能，降低光合速率、蒸騰速率以及抑制植物生長[3]。干旱是植物非生物脅迫的主要原因之一，迫使植物發(fā)生形態(tài)和生理變化[4]。植物對干旱脅迫的響應主要表現(xiàn)為根系和葉片結構的改變，生理水平主要表現(xiàn)為光合作用、滲透調(diào)節(jié)代謝、抗氧化代謝及激素物質等方面的變化，而分子水平則是調(diào)控抗旱調(diào)節(jié)基因和功能基因的表達，改變功能性蛋白和有機分子合成酶的編碼，進而影響干旱信號轉導以及激素、滲透物質的合成和積累[5]。

WRKY 轉錄因子的主要特征在于其包含60 個左右氨基酸DNA 結合區(qū)的WRKY 域，其中包含一個高度保守的七肽序列（WRKYGQK）。WRKY 轉錄因子在植物防御生物及非生物脅迫中發(fā)揮著關鍵作用[6]。超表達的WRKY 家族基因能夠幫助植物在干旱環(huán)境中維持較好的水分狀況，緩解因干旱所造成的萎蔫及生長抑制[7]。在大豆研究中，過表達的GmWRKY54可能通過激活ABA 以及Ca2+信號通路來控制氣孔的關閉，增強大豆的抗旱能力[8]。在干旱脅迫下，植物會受到諸如活性氧（ROS）損傷等次生脅迫損傷。VlWRKY48能提高葡萄過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶活性，清除活性氧來提高其抗旱性[9]。

目前，對于大苞萱草的開發(fā)利用還不充分，關于大苞萱草在分子層面響應干旱脅迫的研究鮮見報道，不利于深入研究大苞萱草的抗旱機制。鑒于此，以大苞萱草為試驗材料，基于轉錄組數(shù)據(jù)，采用生物信息學分析方法對干旱脅迫下的大苞萱草WRKY 基因（HmWRKY）進行鑒定、構建進化樹、分析和預測蛋白質理化性質以及蛋白質二級結構等，根據(jù)HmWRKY基因的表達特性，明確候選基因，為進一步研究HmWRKY基因功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

供試材料大苞萱草取自吉林農(nóng)業(yè)大學野生花卉資源圃，選取田間長勢一致且植株健壯的大苞萱草幼苗移栽至高13 cm、直徑10 cm 的塑料花盆中，單株單盆，栽培基質為草炭、珍珠巖按體積比3∶1混合配制成的營養(yǎng)土，進行正常的盆栽管理。緩苗后，將供試材料分為對照組（CK 組）和干旱脅迫處理組（D組）。干旱處理前使各組均處于飽和含水狀態(tài)，處理后，CK 組每3 d 澆一次水，D 組采取自然失水脅迫的方式處理。于5 d 后的10：00 對CK 組和D組進行取樣，每組處理設置3個重復，將嫩葉和新根放入液氮中帶回并存放在-80 ℃冰箱保存，備用。RNA 的提取、質控、建庫及轉錄組的三代測序均由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2 HmWRKY基因家族成員鑒定

以大苞萱草轉錄組測序結果為材料。在TAIR網(wǎng) 站（https://www.arabidopsis.org/）下 載 擬 南 芥WRKY 基因家族的轉錄因子序列和蛋白質序列，共72 個。通過本地blast+進行比對，篩選出大苞萱草的WRKY 轉錄因子。利用Smart（http://smart.emblheidelberg.de/）在線軟件進行鑒定以確保含有WRKY 保守域，通過NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）在線軟件進行結構域完整性的預測。

1.3 HmWRKY基因家族成員生物信息學分析

1.3.1 HmWRKY 基因家族聚類分析及多重序列比對 利用MEGA 7 對HmWRKY 轉錄因子蛋白構建進 化 樹（Neighbor-joining，NJ），Bootstrap 設 置 為1 000次重復，其余參數(shù)選擇默認值[10]。利用序列分析軟件DNAMAN 6.0 對HmWRKY 蛋白序列進行多重序列比對，截取包含WRKY 結構域與鋅指結構的氨基酸序列，通過TBtools 軟件的SeqLogo 繪制HmWRKY轉錄因子保守結構域的logo圖。

1.3.2 HmWRKY 基因家族的理化性質分析 利用ExPASy ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）對HmWRKY蛋白的理化性質進行預測，其中包括氨基酸序列長度、分子質量、蛋白質等電點、總平均親水性、不穩(wěn)定系數(shù)以及脂溶性系數(shù)。使 用CELLO v.2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）對HmWRKY 家族成員進行植物細胞的亞細胞定位，整理數(shù)據(jù)進行匯總。

1.3.3 HmWRKY 蛋白二級結構預測 利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa-sopma.html）在線軟件對大苞萱草WRKY蛋白質二級結構進行預測。

1.3.4 HmWRKY 蛋白保守基序分析 通過在線軟件MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）對HmWRKY 蛋白保守基序進行搜索，搜索參數(shù)設置為最大搜索數(shù)量20 個，ZOOPS 參數(shù)設置為Zero or one occurrence per sequence，其余參數(shù)使用網(wǎng)頁默認設置。最后使用TBtools將HmWRKY轉錄因子蛋白保守基序可視化。

1.3.5 HmWRKY 基因家族在葉和根中的表達分析 利用北京諾禾致源科技股份有限公司提供的售后平臺工具NovoMagic（https://magic.novogene.com/customer/main#/login）分別制作處理組與對照組葉和根中HmWRKY基因家族41個成員的表達模式熱聚圖。

1.4 HmWRKY 基因實時熒光定量PCR（qRTPCR）分析

將公司測序后剩余的樣品進行液氮研磨，使用RNApure Plant Kit（DNase Ⅰ）植物RNA 提取試劑盒（DNase Ⅰ）提取葉片總RNA，使用NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis（gDNA Purge）反轉錄試劑盒合成cDNA，使用NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus 試劑盒進行qRT-PCR，使用Primer 5.0進行qRT-PCR 引物設計（表1），內(nèi)參基因為HfEF-1α（GenBank No.MT096368）[11]。qRT-PCR反應體系為2×SYBR Mix 主混合物10 μL，上下游引物各1 μL，模板（cDNA）2 μL，ddH2O 6 μL。反應程序：預變性95 ℃1 min；95 ℃20 s、60 ℃20 s、72 ℃30 s，40 個循環(huán)。試驗進行3 次生物學重復，采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量[12]。

表1 HmWRKY基因qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences for HmWRKY gene

2 結果與分析

2.1 HmWRKY基因家族成員鑒定

通過本地blast+與擬南芥WRKY 轉錄因子進行比對，從轉錄組測序結果中共篩選出182 個大苞萱草WRKY 轉錄因子。利用在線軟件Smart鑒定以確保含有WRKY 保守域，通過NCBI 在線軟件預測結構域的完整性。最終得到41 個大苞萱草WRKY 轉錄因子，并將這些基因命名為HmWRKY1—HmWRKY41。

2.2 HmWRKY基因家族成員生物信息學分析

2.2.1 HmWRKY 基因家族聚類分析及多重序列比對 將41 個HmWRKY 蛋白與72 個擬南芥WRKY蛋白進行多序列分析并通過軟件構建進化樹（圖1）。WRKY DNA 結構域（DBD）的特征是在其N 端有一個不變的七肽WRKYGQK 氨基酸基序，在其C端包含一個鋅指結構。根據(jù)WRKY 結構域的數(shù)量和鋅指狀基序的特征將WRKY 轉錄因子分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類，其中Ⅱ類分為5個亞類。

圖1 大苞萱草和擬南芥WRKY轉錄因子聚類分析Fig.1 Cluster analysis of WRKY transcription factors in Hemerocallis middendorffii and Arabidopsis thaliana

WRKY 結構域高度保守，多重序列比對結果如圖2 和圖3 所示。WRKYGQK 的氨基酸序列存在替換的現(xiàn)象。Ⅰ類共有8個HmWRKY轉錄因子，含有2 個WRKY 結構域，鋅指結構為CX7CX24～25HXH 型。Ⅱ類共有30 個HmWRKY 轉錄因子，只含有1 個WRKY 結構域且鋅指結構為CX7CX25HXH 型，Ⅰ類和Ⅱ類轉錄因子均有不同程度的七肽結構變異和鋅指結構缺失的現(xiàn)象。Ⅲ類有4 個HmWRKY 轉錄因子，含有1 個WRKY 結構域，鋅指結構為CX7CX25HXC 型，Ⅲ類HmWRKY 轉錄因子相對保守，七肽結構不發(fā)生變異且鋅指結構完整。

圖2 HmWRKY轉錄因子家族保守結構域分析Fig.2 Conservative domain analysis of HmWRKY transcription factor family

圖3 HmWRKY轉錄因子家族保守結構域分析Fig.3 Fig.3 Conservative domain analysis of HmWRKY transcription factor family

2.2.2 HmWRKY 基因家族的理化性質分析HmWRKY 基因家族成員的理化性質差異性較大（表2），HmWRKY 轉錄因子的氨基酸數(shù)目在92（HmWRKY11）～641（HmWRKY7），分 子 質 量 在10 551.76（HmWRKY11）～69 972.1（HmWRKY7）ku，理論等電點在4.97（HmWRKY26）～9.99（HmWRKY24），脂溶性指數(shù)在47.08（HmWRKY26）～75.93（HmWRKY6），41 個HmWRKY 轉錄因子的親水性平均值均為負值，判定為親水性蛋白。除HmWRKY2、HmWRKY4、HmWRKY5、HmWRKY27、HmWRKY41 為穩(wěn)定蛋白外，其余均為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＞40）。HmWRKY 家族成員亞細胞定位結果如表3所示，除HmWRKY41 定位在線粒體中外，其余的HmWRKY轉錄因子均定位在細胞核中。

表2 HmWRKY轉錄因子蛋白的理化性質Tab.2 Physicochemical properties of HmWRKY transcription factor proteins

續(xù)表2 HmWRKY轉錄因子蛋白的理化性質Tab.2（Continued）Physicochemical properties of HmWRKY transcription factor proteins

2.2.3 HmWRKY 蛋白的二級結構預測 41 個HmWRKY 轉錄因子蛋白二級結構均含有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈以及無規(guī)卷曲，無其他二級結構（表4）。絕大多數(shù)HmWRKY 蛋白都表現(xiàn)出無規(guī)卷曲數(shù)＞α-螺旋數(shù)≥延伸鏈數(shù)＞β-折疊數(shù)的特點，但少數(shù)蛋白質，如HmWRKY11、HmWRKY16、HmWRKY17等表現(xiàn)出無規(guī)卷曲數(shù)＞延伸鏈數(shù)＞α-螺旋數(shù)＞β-折疊數(shù)的特點。

表4 HmWRKY轉錄因子蛋白二級結構Tab.4 Secondary structure of HmWRKY transcription factor proteins %

續(xù)表4 HmWRKY轉錄因子蛋白二級結構Tab.4（Continued）Secondary structure of HmWRKY transcription factor proteins %

2.2.4 HmWRKY 蛋白保守基序分析 HmWRKY蛋白序列的保守基序預測結果見圖4。Motif 1 是WRKY 轉錄因子的特征基序且組成了WRKY 結構域。除HmWRKY24、HmWRKY26、HmWRKY27 和HmWRKY30外，其他成員均包含Motif 1。Motif 2和Motif 5 共同構成C2H2型的鋅指結構域，存在于大多數(shù)HmWRKY 轉錄因子中。Ⅰ類成員幾乎全包含Motif 5、Motif 17 以 及 在N 端、C 端 分 別 含 有1 組Motif 1 和Motif 2。Ⅱ類成員的Motif種類繁多，但呈現(xiàn)出在進化樹中親緣關系較近的各亞類成員，包含Motif 種類也基本一致的規(guī)律，如Ⅱa 亞類與Ⅱb 亞類 除HmWRKY2 外，均 包 含Motif 19；Ⅱc 亞 類HmWRKY33 和HmWRKY39 的Motif 種類完全相同且成員多數(shù)包含Motif 4；Ⅱd 亞類HmWRKY14 和HmWRKY37包含的Motif種類以及排列順序完全相同，其他成員幾乎都包含Motif 7。Ⅲ類成員中存在的Motif種類比較單一，只包含Motif 1和Motif 2。

圖4 HmWRKY轉錄因子家族保守基序Fig.4 Conserved motif of HmWRKY transcription factor family

2.2.5 HmWRKY 基因家族在葉和根中的表達分析 根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)的分析，對比HmWRKY 基因家族的41 個成員在不同處理下葉和根中的表達見圖5，在葉中有10 個上調(diào)基因，29 個下調(diào)基因，其中HmWRKY25和HmWRKY32在 葉 中 無 表 達。HmWRKY22、HmWRKY9上 調(diào) 較 明 顯，HmWRKY2、HmWRKY11、HmWRKY12、HmWRKY20、HmWRKY26、HmWRKY30、HmWRKY34和HmWRKY36下 調(diào) 較 明顯。41 個HmWRKY基因在根中均有表達，其中有20 個上調(diào)基因，21 個下調(diào)基因。HmWRKY4、HmWRKY8、HmWRKY14、HmWRKY15、HmWRKY22、HmWRKY23、HmWRKY24、HmWRKY35在受到干旱脅迫時，表達量上調(diào)較為明顯。HmWRKY2、HmWRKY16、HmWRKY27、HmWRKY30、HmWRKY41在下調(diào)基因中表達量變化較為明顯。

圖5 大苞萱草葉片和根中HmWRKY基因在不同處理下的表達模式熱聚圖Fig.5 Thermopolygram of HmWRKY gene expression pattern under different treatments in leaves and roots of Hemerocallis middendorffii

HmWRKY差異基因的表達變化如圖6 所示，在葉中共發(fā)現(xiàn)10 個差異基因，1 個上調(diào)基因，9 個下調(diào)基因。大苞萱草受到干旱脅迫后，只有HmWRKY9的表達量升高。下調(diào)的差異基因中HmWRKY2、HmWRKY26和HmWRKY30的表達量變化顯著。在根中發(fā)現(xiàn)4 個差異基因，其中3 個上調(diào)基因，1 個下調(diào)基因。HmWRKY4和HmWRKY24上調(diào)趨勢比較明顯，可能在根系中起到積極的調(diào)控作用。此外，通過葉和根的差異基因比對發(fā)現(xiàn)，HmWRKY2在2個組織內(nèi)均有表達且均為負表達，表達量變化十分明顯。

圖6 大苞萱草葉片和根中HmWRKY差異基因在不同處理下的表達水平Fig.6 Expression of HmWRKY differential gene under different treatments in leaves and roots of Hemerocallis middendorffii

2.3 候選差異基因的qRT-PCR驗證

為了驗證候選差異基因HmWRKY9在葉中表達量的正確性，進行qRT-PCR 分析。結果如圖7 所示，HmWRKY9在受到干旱脅迫后，表達量升高，正向響應了干旱脅迫。HmWRKY9的qRT-PCR 結果與轉錄組測序的變化趨勢基本一致，從而驗證了轉錄組數(shù)據(jù)的準確性。

3 結論與討論

WRKY 基因家族在植物體中響應生長發(fā)育、生物脅迫以及非生物脅迫等過程，在非生物脅迫中對干旱脅迫反應的調(diào)控網(wǎng)絡發(fā)揮重要作用。CmWRKY10通過ABA 途徑來調(diào)控菊花的干旱耐受性[13]，水稻在干旱脅迫條件下過表達OsWRKY11可增強其耐旱性[14]，過表達AtWRKY30轉基因植株能夠顯著提高小麥的耐旱能力[15]。以上研究均揭示了WRKY轉錄因子家族成員可提高植物抗旱能力。

本研究基于轉錄組測序，共挖掘出41 個HmWRKY 轉錄因子。將HmWRKY 基因家族與已公布的擬南芥WRKY 基因共同構建進化樹并進行聚類分析，HmWRKY 基因家族的分類與擬南芥WRKY 基因家族的分類一致，表明本試驗轉錄組數(shù)據(jù)具有可靠性，HmWRKY 基因家族在進化上相對保守。WRKY 轉錄因子的七肽和鋅指結構是WRKY 基因行使功能的兩大基團，隨著植物進化，這兩大基團的氨基酸組成也有所變化。Ⅰ類HmWRKY 轉錄因子中只有HmWRKY41N 端的七肽結構發(fā)生變異，變異為“WRKYGPK”，Ⅱ類HmWRKY 轉錄因子的七肽結構易發(fā)生變異，其中變異為“WKKYGQK、WRKYGKK、WRKYGEK”[16-17]。Ⅲ類HmWRKY 轉錄因子的結構域相比前兩類保守，沒有發(fā)生變異情況。ZHANG 等[16]針對真核生物WRKY 基因的研究發(fā)現(xiàn)，WRKY 家族成員有19 個WRKY 結構域的變異，WRKYGEK 和WRKYGKK 是2 個常見的變異。EULGEM 等[17]在香蕉和楊樹中也發(fā)現(xiàn)七肽變異類型為WRKYGKK 的WRKY 轉錄因子蛋白，其中的變異類型與本研究結果一致。YU等[18]認為高度保守的WRKY 結構域可以特異識別靶基因啟動子區(qū)內(nèi)的W-BOX 元件從而調(diào)控該基因的活性，進一步發(fā)揮其生物學功能。因此，具有變異的WRKY 結構域的HmWRKY 轉錄因子可能會影響其發(fā)揮生物學功能。保守基序分析表明，絕大多數(shù)HmWRKY 蛋白含有的特征基序構成不同，如Ⅰ類成員多數(shù)含有2 組Motif 1、Motif 2 和Motif 5，Ⅱa和Ⅱb 亞類的特征基序是Motif 19，Ⅱc 亞類特征基序為Motif 4，Ⅱd和Ⅱe亞類的特征基序均為Motif 7，而Ⅲ類成員中只存在2 種Motif，保守基序種類不同說明這些成員在進化過程中發(fā)生了不同程度的變異，這可能與基因家族的分類及功能調(diào)控有關。

通過對干旱脅迫下HmWRKY基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，41個HmWRKY基因在葉和根中的表達量變化均有不同，少數(shù)HmWRKY基因如HmWRKY6、HmWRKY29等在干旱脅迫前后葉和根中的表達量變化不明顯，而HmWRKY22、HmWRKY36等在處理前后葉和根中的表達量變化相對顯著。另外，HmWRKY6在干旱處理前不表達，處理后開始表達，HmWRKY21和HmWRKY38則相反，說明HmWRKY6、HmWRKY21和HmWRKY38可能與大苞萱草的抗旱性相關。已有研究表明，擬南芥中部分WRKY 轉錄因子可在植物抵御干旱脅迫的過程中起到重要調(diào)控作用。AtWRKY28和AtWRKY57均能提高植株的耐旱性[19-20]。過表達AtWRKY29可使擬南芥植株變小且葉片顏色變深，增強其抗旱能力[21]。AtWRKY33可通過直接調(diào)控CesA8 參與干旱脅迫[22]。AtWRKY40可以通過增強植株的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力來維持細胞吸水，從而提高植株對干旱脅迫的抵抗力[23]。過表達AtWRKY57的擬南芥耐旱性顯著提高[19]。本研究通過大苞萱草轉錄組測序結果得到13個差異基因，部分差異基因與上述擬南芥抗旱基因具有較近的親緣關系，如HmWRKY2、HmWRKY3、HmWRKY4、HmWRKY9、HmWRKY30和HmWRKY34。這 也 間 接 表 明 ,HmWRKY2、HmWRKY3、HmWRKY4、HmWRKY9、HmWRKY30和HmWRKY34可能通過促進或抑制自身的表達來參與大苞萱草響應干旱脅迫的過程。大苞萱草受到干旱脅迫的前后，HmWRKY2均存在于葉和根中，HmWRKY2的表達量變化均為顯著下降且HmWRKY2與AtWRKY40同 源 性 較 高。因 此，HmWRKY2可能通過抑制其表達在大苞萱草抵御干旱脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。

本研究基于大苞萱草的轉錄組數(shù)據(jù)，首次對大苞萱草WRKY 基因家族進行鑒定，初步確定了41個HmWRKY基因。通過對HmWRKY 轉錄因子的結構特征及在不同處理下葉和根中表達量的綜合分析，揭示了大苞萱草WRKY 基因家族成員可能與大苞萱草抗旱方面相關，為HmWRKY 轉錄因子家族的功能研究以及抗性基因篩選提供參考。確定HmWRKY9為候選基因，后續(xù)將開展HmWRKY9的功能驗證工作，探討其是否與大苞萱草的抗旱性有關。