王 佩，王 濤，宋江雨，丁應(yīng)福，王廷賢，楊占偉，宋朝鵬，李靜超

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.云南省煙草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655000；3.福建省煙草公司南平市公司，福建 南平 353000）

烤煙上部煙葉占整株煙葉的30%～45%[1]，因其香氣濃度厚實(shí)且飽滿，有利于增加吃味濃度，在卷煙葉組配方中起主導(dǎo)作用[2]。但由于上部葉光照充足，烤后煙葉身份偏厚，淀粉、蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)物含量高，在烘烤過程中容易烤青和掛灰，導(dǎo)致煙葉上部葉工業(yè)可用性偏低[3]。紀(jì)成燦等[4]研究表明，造成翠碧一號（CB-1）上部煙葉烤后光滑的根本原因是淀粉分解不徹底。楊勝男等[5]研究發(fā)現(xiàn)，淀粉水解及酶解的程度與直鏈淀粉含量呈反比。研究玉米[6]、小麥[7]等作物抗性淀粉形成原因發(fā)現(xiàn)，直鏈淀粉經(jīng)過濕熱處理后會回生老化，形成難以被淀粉酶水解的抗性淀粉。直鏈淀粉含量高低直接影響抗性淀粉含量[8]。煙葉生長發(fā)育過程中，抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系[9]。徐夢曉等[10]研究表明，隨著煙葉的不斷成熟，抗性淀粉含量逐漸降低，直鏈淀粉和支鏈淀粉含量隨煙葉衰老呈下降趨勢；段史江等[9]研究表明，在烘烤過程中，變黃期是煙葉中抗性淀粉降解的主要時期。目前，通過調(diào)整烘烤工藝措施降低烤后煙葉淀粉含量取得了顯著進(jìn)展[11-13]。其中，閆鼎等[12]認(rèn)為，中溫中濕烘烤工藝能顯著降低煙葉淀粉含量；危阜斌等[13]研究發(fā)現(xiàn)，低溫慢變黃可使淀粉充分降解。

以往研究主要集中于煙葉烘烤過程中總淀粉含量的變化，關(guān)于不同烘烤工藝條件下煙葉抗性淀粉含量的變化尚未見報道。為此，以烤煙CB-1 上部葉為研究對象，通過對CB-1 烤后煙噴灑α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶混合溶液，探究烤后煙中是否存在抗性淀粉，以當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)烘烤工藝為對照，探究主變黃溫度對抗性淀粉含量的影響，旨在通過調(diào)整烘烤工藝降低烘烤過程中煙葉抗性淀粉含量，從而改善煙葉品質(zhì)，提高上部葉可用性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020—2021 年度在福建省南平市將口鎮(zhèn)松柏村進(jìn)行，以烤煙品種CB-1 為試驗(yàn)材料，田間移栽、施肥和其他田間管理措施均按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。采摘成熟度、部位一致的上部葉，采收煙葉當(dāng)天烘烤。烘烤過程中，每12 h取樣1 次，除去葉脈，將樣品立即冷凍于液氮中，-80 ℃保存，用于淀粉組分、淀粉酶以及抗性淀粉等含量的測定。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

1.2.1 烤后煙葉噴灑淀粉酶處理 參考劉勇等[14]的噴灑方法。取CB-1 上部葉的烤后煙葉，在烤后煙葉上噴灑α-胰淀粉酶（10 g/L）和淀粉葡糖苷酶（AMG，0.3 g/L）的混合溶液，置于常溫下（25 ℃）保存，于噴灑溶液后的0、12、24、36、48、60 h 分別對煙葉進(jìn)行取樣，每次隨機(jī)選取3片煙葉，測定淀粉含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。所有樣品均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2 設(shè)置不同主變黃溫度的烘烤工藝 參考任杰等[15]、魏碩等[16]的方法，在煙葉變黃期分別設(shè)置不同的溫度，煙葉烘烤共設(shè)置4個處理。

現(xiàn)行烘烤工藝（對照組，CK）：以福建當(dāng)?shù)睾婵竟に囂幚?，煙葉主變黃溫度集中在38～41 ℃。

低溫變黃工藝（T1）：將主變黃溫度設(shè)置為36 ℃，其他按當(dāng)?shù)睾婵竟に囘M(jìn)行。

中溫變黃工藝（T2）：將主變黃溫度設(shè)置為38 ℃，其他按當(dāng)?shù)睾婵竟に囘M(jìn)行。

高溫變黃工藝（T3）：將主變黃溫度設(shè)置為40 ℃，其他按當(dāng)?shù)睾婵竟に囘M(jìn)行。

4 種烘烤工藝設(shè)置溫濕度的變化曲線如圖1所示。

圖1 4種烘烤工藝設(shè)置溫度的變化曲線Fig.1 The temperature change curves of the four curing processes

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 超微結(jié)構(gòu)分析測定 參考楊勝男等[5]的方法，在葉片右側(cè)的第五和第六支脈之間，距離主脈3～5 cm 處切取0.5 cm×0.5 cm 葉肉組織，采用2.5%戊二醛溶液（pH 值7.2～7.4，0.1 mol/L PBS 緩沖液配制）進(jìn)行固定，室溫放置30 min 后，于4 ℃冰箱內(nèi)保存。采用透射電鏡觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)。

1.3.2 直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉的含量測定

采用雙波比色法測定直鏈淀粉和支鏈淀粉含量[17]。參考吳飛躍等[18]的方法測定淀粉含量，使用分光光度計在640 nm 下測定吸光度。其中每份樣品重復(fù)測定3次，其平均值即為該樣品的值。

1.3.3 抗性淀粉的含量測定 準(zhǔn)確稱取0.15 g冷凍干燥的煙葉樣品于研缽中研碎，加入4 mL α-胰淀粉酶，充分勻漿后轉(zhuǎn)移到EP管中，按照Megazyme公司的K-RSTAR試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.3.4 淀粉酶活性測定 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定淀粉酶活性[19]。酶活性單位定義：在37 ℃、pH 值5.6 的條件下，以1 mg 酶蛋白在10 min內(nèi)分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽糖為1個酶活性單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析（單因素ANOVA）及相關(guān)分析（Pearson 相關(guān)系數(shù)），采用LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)間的差異顯著性檢驗(yàn)；利用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 烘烤過程中煙葉淀粉降解情況分析

利用透射電鏡觀察煙葉烘烤過程中葉綠體內(nèi)的淀粉粒變化情況（圖2A）。結(jié)果顯示，隨烘烤的不斷進(jìn)行，緊貼細(xì)胞壁的葉綠體不斷降解，定色期基本降解完全。成熟鮮煙中葉綠體內(nèi)的淀粉粒數(shù)量多且體積大，隨葉綠體緊貼細(xì)胞壁。煙葉烘烤至變黃期，淀粉粒開始大量降解，此時淀粉粒游離至細(xì)胞中部，無序散落在細(xì)胞內(nèi)；進(jìn)入煙葉定色期，細(xì)胞內(nèi)所含淀粉粒數(shù)量極少，葉綠體已經(jīng)解體，此時大部分淀粉粒已降解完全；煙葉烘烤至干筋期，此時細(xì)胞內(nèi)已無法觀察出清晰的細(xì)胞器，嗜鋨顆粒含量相對較多，嗜餓顆粒與極少的淀粉粒無序散落在細(xì)胞中，細(xì)胞扭曲破裂嚴(yán)重。

烘烤過程中，淀粉含量和淀粉酶活性測定結(jié)果（圖2B）顯示，烘烤前期，淀粉含量與淀粉酶活性呈反比。烘烤24～72 h，淀粉酶活性較高，此時淀粉大量降解，烘烤72 h 后，淀粉酶活性持續(xù)降低，淀粉緩慢降解，進(jìn)入平臺期。綜上所述，煙葉在烘烤過程中，變黃期煙葉淀粉降解量最高；進(jìn)入定色期后，淀粉酶活性迅速下降，淀粉降解速度快速下降，淀粉含量緩慢下降；干筋期后，淀粉含量無明顯變化。

2.2 淀粉酶處理后煙葉淀粉含量變化

如圖3A 所示，噴灑淀粉酶溶液后，烤后煙葉淀粉含量為6.19%～6.84%，噴灑淀粉酶溶液對烤后煙葉中淀粉含量無顯著影響（P＞0.05）。噴灑淀粉酶溶液后，煙葉存放時間長短與淀粉含量無顯著關(guān)系（P＞0.05）。常溫下，淀粉酶溶液對烤后煙葉中的淀粉不具有酶解作用，說明煙葉淀粉中可能存在不能被淀粉酶酶解的組分（抗性淀粉）。圖3B 為抗性淀粉的顯色反應(yīng)，顏色越深，表明抗性淀粉含量越高。綜上，烤后煙葉中存在抗性淀粉，常溫下不易酶解。

圖3 噴灑淀粉酶溶液后煙葉淀粉含量（A）及顯色（B）Fig.3 Starch content（A）and visual detection（B）of tobacco leaves after spraying with amylase solution

2.3 不同烘烤工藝對烤后煙葉淀粉組分以及抗性淀粉含量的影響

2.3.1 不同烘烤工藝對烤后煙葉直鏈淀粉與支鏈淀粉含量的影響 測定不同烘烤工藝烘烤過程中煙葉直鏈淀粉與支鏈淀粉的含量發(fā)現(xiàn)，隨著烘烤時間的推進(jìn)，直鏈淀粉與支鏈淀粉含量均在變黃前中期迅速下降，而后緩慢下降（圖4）。隨著主變黃溫度的升高，直鏈淀粉與支鏈淀粉的降解量增加。烘烤0～48 h，CK、T1、T2、T3 處理煙葉的直鏈淀粉降解量分別為58.03%、22.92%、48.81%、51.40%，煙葉支鏈淀粉降解量分別為58.74%、34.23%、50.13%、53.56%。烘烤24 h后，T1處理煙葉中直鏈淀粉與支鏈淀粉開始快速降解。烘烤48 h 后，CK、T2、T3 處理煙葉直鏈淀粉、支鏈淀粉含量顯著低于T1 處理，隨后各處理煙葉直鏈淀粉和支鏈淀粉含量大幅度降低。烘烤120 h 后，各處理煙葉中的直鏈淀粉與支鏈淀粉含量逐漸趨于穩(wěn)定。CK、T1、T2、T3 處理烤后煙葉中直鏈淀粉含量分別為2.21%、2.59%、0.83%、1.98%，支鏈淀粉含量分別為3.64%、6.21%、3.10%、4.54%。綜上，變黃前中期，煙葉直鏈淀粉和支鏈淀粉降解量大，降解速度快；直鏈淀粉降解量T2＞T3＞CK＞T1，支 鏈 淀 粉 降 解 量T2＞CK＞T3＞T1，CK、T3 處理烤后煙葉中的直鏈淀粉與支鏈淀粉含量無顯著差異。T2 處理的烤后煙葉中直鏈淀粉與支鏈淀粉含量最低。

圖4 不同烘烤工藝條件下煙葉直鏈淀粉含量（A）和支鏈淀粉含量（B）Fig.4 Amylose content（A）and amylopectin content（B）of tobacco leaves under different curing conditions

2.3.2 不同烘烤工藝對烤后煙葉抗性淀粉含量的影響 研究不同烘烤工藝對抗性淀粉含量的影響，結(jié)果顯示，在4種烘烤工藝條件下，煙葉中抗性淀粉的降解規(guī)律總體上均呈現(xiàn)出先快速降解、再緩慢降解、最后趨于穩(wěn)定的變化趨勢，但不同烘烤工藝的抗性淀粉含量變化又具有各自的特征（圖5）。CK、T1、T2 和T3 處理的烤后煙葉中抗性淀粉含量分別為2.48%、3.25%、1.84%、2.61%?？剐缘矸酆吭谧凕S期急劇下降，其中在變黃前中期（0～48 h），CK、T2 和T3 處理煙葉的抗性淀粉含量急劇下降，降解量分別為54.47%、58.36%和56.18%，T1處理煙葉抗性淀粉含量在變黃中后期（24～72 h）迅速下降，降解量為45.55%。進(jìn)入定色期之后，4 種處理煙葉的抗性淀粉含量均少量下降。T1 處理煙葉中的抗性淀粉降解時間晚于其他3 個處理，且T1 處理煙葉中的抗性淀粉降解量低于CK、T2 和T3 處理煙葉，說明抗性淀粉的降解可能與變黃期溫度相關(guān)。綜上，烘烤過程中主變黃溫度不同，抗性淀粉降解量也存在較大差異，CK、T1、T2、T3 處理煙葉中抗性淀粉降解量分別為64.27%、54.01%、73.34%、63.34%。與當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)烘烤工藝相比，T2處理煙葉中的抗性淀粉降解量較高，T1 處理煙葉中的抗性淀粉降解量較少，T3 處理煙葉中的抗性淀粉含量與常規(guī)烘烤工藝下煙葉的抗性淀粉含量無顯著差異。

圖5 不同烘烤工藝烘烤過程中的抗性淀粉含量Fig.5 Content of resistant starch in different curing processes

2.4 烤后煙葉抗性淀粉與淀粉組分間的相關(guān)性

烤后煙葉抗性淀粉和直鏈淀粉、支鏈淀粉之間的相關(guān)性見表1。由表1 可知，烤后煙葉抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量呈顯著正相關(guān)（r=0.856），煙葉抗性淀粉含量與支鏈淀粉/直鏈淀粉無顯著關(guān)系。

表1 烤后煙葉抗性淀粉與淀粉組分間的相關(guān)性Tab.1 Correlation between resistant starch and starch components in roasted tobacco leaves

3 結(jié)論與討論

在大田生長期，煙葉葉片以積累淀粉為主，成熟采收的煙葉經(jīng)過烘烤調(diào)制加工，煙葉內(nèi)淀粉轉(zhuǎn)化降解[20-23]。本研究中，隨著煙葉烘烤的不斷進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)的葉綠體與細(xì)胞壁間的間隙不斷增大，葉綠體不斷降解，葉綠體內(nèi)的淀粉粒也不斷降解，且無序地散落在細(xì)胞中，這與劉朝營等[24]的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，變黃期是煙葉淀粉降解的主要時期，變黃前中期淀粉大量降解。煙葉烘烤進(jìn)入定色期后，淀粉酶活性快速下降，淀粉含量無顯著變化，可能因?yàn)槎ㄉ跍囟扔绊懥说矸勖富钚?，進(jìn)一步影響了淀粉的降解。

本研究中，對烤后煙葉噴灑淀粉酶溶液，發(fā)現(xiàn)烤后煙葉中淀粉含量沒有顯著差異，這說明淀粉中可能存在不能被淀粉酶酶解的組分。結(jié)合抗性淀粉的顯色反應(yīng)可知，烤后煙葉中存在抗性淀粉?？竞鬅熑~中的抗性淀粉可能有2 種來源：一是直鏈淀粉經(jīng)濕熱處理回生老化，形成難以被淀粉酶水解的抗性淀粉[25]；二是煙葉本身所具有抗性淀粉，且含量隨煙葉生長發(fā)育不斷累積[10]。有研究表明，抗性淀粉含量隨水稻生育期的推進(jìn)呈現(xiàn)遞增狀態(tài)[26]。

本研究通過將常規(guī)烘烤工藝與3種主變黃烘烤工藝下煙葉中的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)不同主變黃工藝下煙葉中的直鏈淀粉與支鏈淀粉含量均隨烘烤的持續(xù)進(jìn)行呈下降趨勢。低溫變黃工藝處理中直鏈淀粉和支鏈淀粉大量降解時間晚于當(dāng)?shù)睾婵竟に嚒⒅袦刈凕S工藝和高溫變黃工藝處理，低溫變黃工藝處理烤后煙葉中直鏈、支鏈淀粉含量也顯著高于當(dāng)?shù)睾婵竟に?、中溫變黃工藝和高溫變黃工藝處理，這可能是因?yàn)榈蜏刈凕S工藝處理主變黃溫度較低，淀粉酶活性較低，因而導(dǎo)致低溫變黃工藝處理淀粉分解不徹底，烤后煙葉淀粉含量高。烘烤48～72 h，中溫變黃工藝和高溫變黃工藝處理直鏈、支鏈淀粉含量與低溫變黃工藝處理存在顯著差異，說明在煙葉變黃期，適當(dāng)升高主變黃溫度，延長主變黃時間，可有效降低直鏈淀粉和支鏈淀粉含量，這與王懷珠等[27]研究結(jié)果一致，可能原因是延長主變黃時間可推遲淀粉酶到達(dá)活性高峰的時間，有利于直鏈、支鏈淀粉的降解。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，抗性淀粉與直鏈淀粉存在顯著正相關(guān)關(guān)系，這與前人[28-30]的研究結(jié)果一致。煙葉抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量密切相關(guān)，說明在烘烤過程中，可通過調(diào)控直鏈淀粉含量進(jìn)而調(diào)控抗性淀粉含量。

通過設(shè)置不同主變黃溫度，發(fā)現(xiàn)相比于常規(guī)烘烤工藝處理、低溫變黃工藝和高溫變黃烘烤工藝處理，中溫變黃工藝處理即延長38 ℃的時間有利于充分降低煙葉中抗性淀粉含量，進(jìn)而降低烤后煙葉中淀粉含量。高溫變黃工藝T3 中的抗性淀粉在烘烤0～48 h 降解量較高，烘烤72 h 之后抗性淀粉少量降解，這可能是因?yàn)殡S著烘烤的不斷進(jìn)行，溫度不斷升高，煙葉失水困難，影響了淀粉酶等酶活性的發(fā)揮，不利于煙葉抗性淀粉的降解。常規(guī)烘烤與高溫烘烤之間的抗性淀粉含量無顯著差異，可能是因?yàn)? 個處理烘烤前期煙葉淀粉降解過快，導(dǎo)致后期淀粉停止降解時間較早。低溫變黃工藝于變黃初期抗性淀粉降解量較少，烘烤24～72 h，抗性淀粉急劇降解，烘烤72 h 后少量降解，烤后煙葉抗性淀粉含量較高，這可能是因?yàn)樽凕S前期溫度較低，且停留時間較長，沒有充分激發(fā)淀粉酶等酶的活性，進(jìn)一步影響了抗性淀粉的降解。中溫變黃工藝將主變黃溫度設(shè)置在38 ℃，延長主變黃時間，發(fā)現(xiàn)此工藝下抗性淀粉降解量高，且烤后煙葉中抗性淀粉含量低，這可能是因?yàn)?8 ℃有效激發(fā)了降解抗性淀粉相關(guān)酶的活性，同時延長了有效的變黃時間。煙葉烘烤環(huán)境溫度的升高和有效延長關(guān)鍵溫度點(diǎn)的時間，可有效降低煙葉抗性淀粉的含量，進(jìn)一步降低烤后煙葉淀粉含量，這與張瀟駿等[31]、宮長榮等[32]研究一致。

綜上，煙葉在烘烤變黃期間淀粉大量降解，CB-1烤后煙葉中存在抗性淀粉；煙葉變黃前中期，直鏈淀粉、支鏈淀粉以及抗性淀粉均大量降解；烤后煙葉抗性淀粉與直鏈淀粉間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，可通過調(diào)控直鏈淀粉含量進(jìn)一步調(diào)控抗性淀粉含量；相比于常規(guī)烘烤工藝、低溫主變黃烘烤工藝、高溫主變黃烘烤工藝，采用中溫主變黃（38 ℃）烘烤工藝、延長主變黃時間能更好地降解煙葉中存在的抗性淀粉，進(jìn)一步降低烤后煙葉中淀粉含量，提高煙葉CB-1上部葉可用性。