復(fù)合保鮮劑對冷凍牛蛙保鮮效果的影響

任中陽，黃香蘭，崔雅清，焦 敏，石林凡，2，楊 燊，2，郝更新，2，邱緒建，2，陳玉峰，趙永強(qiáng)，翁武銀，2

（1. 集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021；2. 廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建廈門 361021；3. 浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點實驗室，浙江杭州 310014；4. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510300）

0 引言

牛蛙屬于兩棲綱、無尾目蛙科，是一種大型食用蛙。牛蛙生長速度快，味鮮肉嫩、營養(yǎng)豐富，具有一定的藥用價值，由于其具有高蛋白、低脂肪的特點而深受消費者喜愛。除了牛蛙肉外，牛蛙皮、牛蛙油也能被充分利用，可產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)效益，因而牛蛙也逐漸成為我國重要水產(chǎn)品之一。牛蛙表面的活性肽在抑菌方面具有一定作用[1]。牛蛙富含蛋白質(zhì)，死后會出現(xiàn)僵直、解僵、自溶和腐敗的現(xiàn)象，肌肉中的ATP 會分解釋放能量，使蛙體體溫上升，其新鮮度也會受到影響，還會造成營養(yǎng)物質(zhì)損失、品質(zhì)下降、貨架期縮短等問題[2]。牛蛙保藏不當(dāng)，難以保證其品質(zhì)，因此研究牛蛙保鮮技術(shù)具有重要意義。

目前，有關(guān)水產(chǎn)品保鮮的方法有物理方法、化學(xué)方法和生物方法，化學(xué)方法是通過加入食品保鮮劑以延長食品保質(zhì)期，常用化學(xué)保鮮劑有磷酸鹽、檸檬酸、苯甲酸等，雖然單一保鮮劑的種類比較繁多，但單一保鮮技術(shù)與保鮮劑在食品保鮮中不具有優(yōu)勢，只針對某一特定的腐敗菌發(fā)揮作用，促使復(fù)合保鮮技術(shù)的研究開發(fā)[3]。水產(chǎn)品在凍藏過程中，若形成大且不均勻的冰晶會對水產(chǎn)品品質(zhì)造成不良影響[4]。選擇合適的凍藏方式或保鮮劑可減少對品質(zhì)的損害。水產(chǎn)品在凍藏過程中蛋白質(zhì)會發(fā)生變性和品質(zhì)下降，酶活性下降，黏度變低，蛋白質(zhì)分子凝集，空間立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5]。蛋白質(zhì)變性后，凍結(jié)水產(chǎn)品的組織質(zhì)地變干變硬，加工適宜性下降，產(chǎn)品缺乏彈性。而采用保鮮劑可有效改善凍藏品在凍結(jié)過程中發(fā)生的品質(zhì)問題。

目前，常用的保鮮劑主要有4 類，分別是復(fù)合磷酸鹽、糖類、蛋白水解產(chǎn)物、抗凍蛋白[6]。有關(guān)牛蛙保鮮劑的研究與技術(shù)開發(fā)還不完善[7]。當(dāng)前，有關(guān)牛蛙的研究主要包括其基本營養(yǎng)成分分析、營養(yǎng)學(xué)、組織學(xué)、藥用價值和生理學(xué)和養(yǎng)殖等方面[8]。牛蛙作為一種低脂肪、高營養(yǎng)的食品，應(yīng)用范圍廣且具有一定的發(fā)展前景，目前有很多有關(guān)于水產(chǎn)保鮮的研究，但對牛蛙保鮮有待深入探究。因此通過研究復(fù)合磷酸鹽類保鮮劑，分析焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉及六偏磷酸這3 類保鮮抗凍劑復(fù)合對于牛蛙冷凍效果的影響，以此為牛蛙保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活牛蛙，購自廈門市集美區(qū)石鼓路水產(chǎn)市場；氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、氯化鈣、氯化鎂，西隴科學(xué)股份有限公司提供；無水乙醚、氫氧化鈉、ATP、三羧酸（Tricarboxylic acid，TCA）、硝酸、硫酸亞鐵、三聚磷酸鈉、六偏磷酸鈉、焦磷酸鈉、海藻糖、乙酸鎂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；Tris- 馬來酸、乙二醇雙（2- 氨基乙基醚） 四乙酸（Ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA） 溶液、鉬酸銨、山梨糖醇、甘油，上海麥克林生化科技有限公司提供；Lowry 試劑盒，深圳子科生物科技有限公司提供。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750 型紫外熒光分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品；Avanti J-26xp 型冷凍離心機(jī)，貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品；G:Box 型凝膠電泳成像儀，英國Syngene 公司產(chǎn)品；SX2-10-13 型馬弗爐，上海石研電爐有限公司產(chǎn)品；Avanti J-26xp 型高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品；Q-2000 型差式掃描量熱儀，美國TA 公司產(chǎn)品；FJ-200 型恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

將牛蛙宰殺清洗干凈后，取牛蛙大腿部位和整只牛蛙，采用一定濃度復(fù)合保鮮劑，優(yōu)化最佳磷酸鹽配比，通過復(fù)合磷酸鹽浸泡處理1 h，放入冰箱凍藏3 個月，用于DSC 測定。

1.3.2 單因素試驗

固定處理條件：1%海藻糖，0.5%山梨糖，1%氯化鈉和1%甘油，分別探究3 種保鮮劑即焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下對牛蛙的保鮮效果。3 種保鮮劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度設(shè)為0.1%，0.5%，1%，3%，5%。

1.3.3 保鮮劑復(fù)合正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以冰點和相變焓為指標(biāo)，按正交表進(jìn)行復(fù)配。每組重復(fù)2 次，浸泡1 h 后采用DSC 法測定冰點和相變焓的變化確定保鮮劑最佳配比。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計/%

1.3.4 冰點測定

參考李紅梅等人[9]方法測定，略有改動。稱取4～8 mg 牛蛙肉進(jìn)行測定，空白坩堝為參比，以5 ℃/min降溫至-30 ℃，用1 ℃/min 升溫到3 ℃。利用DSC數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析，獲取牛蛙的冰點和相變焓等熱力學(xué)參數(shù)。

1.3.5 水分含量測定

參考宋健[10]的方法，略有改動。事先準(zhǔn)備好干燥皿，取相同質(zhì)量牛蛙肉置于3 個干燥皿中，置于105 ℃烘箱內(nèi)，烘制1.5 h 后取出，將蓋子蓋好后于干燥器中回溫，再烘制30 min，降溫后進(jìn)行稱重，至前后2 次相差不大于0.000 5 g。

1.3.6 蛋白質(zhì)含量測定

參考黎勇等人[11]的方法略有改動。配制2 mol/L氫氧化鈉溶液50 mL，加入牛蛙肉后攪拌1 h，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心10 min。取上清稀釋5 倍，利用Lowry 法于波長750 nm 處測定吸光度，用于蛋白質(zhì)的定量。用蒸餾水進(jìn)行調(diào)零，以水作為對照，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出牛蛙中蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 粗脂肪含量測定

參考Cunha A F 等人[12]的方法，略有改動。取約4 g 經(jīng)處理的牛蛙肉包好放入抽提筒中，加入無水乙醚至瓶容量2/3 處，在40 ℃水浴抽提6～12 h，直至脂肪完全浸出為止。將收集瓶中乙醚水浴蒸發(fā)至1～2 mL時，于100 ℃下烘干2 h，放入干燥儀器冷卻后稱量，重復(fù)以上步驟至恒質(zhì)量。

1.3.8 牛蛙總灰分測定

參考Akinyele I O 等人[13]利用馬弗爐灰化法，略有所改動。將坩堝先烘干，稱約0.1 g 樣品放入坩堝燒1 h，冷卻后放入馬弗爐。于550 ℃下灼燒3 h，取出冷卻1 h，重復(fù)上述步驟2 次，取出后冷卻稱重。

1.3.9 SDS- PAGE 凝膠電泳

參照夏軒澤等人[14]做法有所改動。先是進(jìn)行牛蛙試驗原液的配制，600 μL 蛋白質(zhì)樣品和400 μL 上樣緩沖液作為電泳樣品，使樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL，混合反應(yīng)0.5 h。采用6%濃縮膠與8%分離膠，初始電壓為8 V，當(dāng)進(jìn)入分離膠后，將電壓提高到12 V，電泳1 h。用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色10 min，用體積比1∶1 醋酸乙醇混合脫色液脫色，用凝膠電泳成像儀拍照分析。

1.3.10 ATP 酶活性測定

參照許萍等人[15]做法并有所改動。用0.6 mol/L KCl（pH 值7） 提取牛蛙蛋白，取4 個平行樣品分別加入10 mmol/LCa2+溶液、2 mmol/LMg2+溶液、2 mmol/L Mg2+溶液和0.1 mmol/L Ca2+溶液、2 mmol/L Mg2+溶液和0.5 mmol/L EGTA 溶液各7.9 mL，各添加20 mmol/L ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，反應(yīng)8 min 后，添加15%TCA 溶液5 mL，反應(yīng)結(jié)束后在常溫下放置15 min，取3 mL 反應(yīng)液，以轉(zhuǎn)速7 060 r/min 離心5 min。取1 mL 離心后的上清液，加入硫酸亞鐵鉬酸銨溶液2 mL，顯色1 min 后，于波長660 nm 處測吸光度。

1.3.11 牛蛙鹽溶蛋白含量測定

參考Han Z Y 等人[16]的方法有所改動。取1 g 牛蛙大腿組織至濃度為0.6 mol/L 的KCl 溶液50 mL中，在冰水浴中使用均質(zhì)儀器以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速處理，攪拌浸提1 h，混合物以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心10 min，用Lowry 法測蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)使用Origin 2019 軟件作圖，用SPSS 和Excel 軟件進(jìn)行方差和顯著性分析，顯著性水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對牛蛙冰點的影響見圖1。

圖1 磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對牛蛙冰點的影響

焦磷酸鈉、三聚酸鈉、六偏磷酸鈉不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)對牛蛙冰點的影響結(jié)果。由圖1 可知，3 種保鮮劑在合適的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)均可在一定程度上降低牛蛙冰點。新鮮牛蛙的冰點和相變焓分別為-0.8 ℃和231.7 J/g。牛蛙肉的冰點和相變焓均隨磷酸鹽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而下降。在同質(zhì)量分?jǐn)?shù)情況下，焦酸鈉復(fù)合抗凍劑浸泡的魚肉冰點和相變焓下降最明顯。當(dāng)復(fù)合抗凍劑中焦磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于3%時，牛蛙的冰點和相變焓不再發(fā)生明顯的變化。其原因可能是牛蛙在凍藏中，肌肉細(xì)胞與組織細(xì)胞中冰晶會不斷形成變大，使肌肉蛋白變形，隨著焦磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，冰點降低，冰晶逐漸變小，從而減少牛蛙蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞[17]。而當(dāng)三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%時，牛蛙肉冰點與相變焓變化較小，可能是由于牛蛙在凍藏時，肌肉中的結(jié)合水脫離，導(dǎo)致分子內(nèi)形成二硫鍵，使蛋白質(zhì)凝聚發(fā)生變性[18]。六偏磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%時，牛蛙肉冰點與相變焓變化差異不顯著，由此可見，在焦磷酸鈉、三聚酸鈉、六偏磷酸鈉3 種保鮮劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～3%，有利于冰點降低，綜合考慮3 種保鮮劑均選取1%～3%用于后續(xù)的優(yōu)化試驗。

2.2 復(fù)合保鮮對牛蛙冰點的影響

保鮮劑復(fù)合正交試驗結(jié)果見表2。

由表2 可知，根據(jù)極差R分析，各因素對牛蛙冰點的變化影響順序為A＞B＞C，即焦磷酸鈉＞三聚磷酸鈉＞六偏磷酸鈉。最優(yōu)條件為A3B2C2，即3%焦磷酸鈉，2%三聚磷酸鈉和2%六偏磷酸鈉。將此復(fù)合保鮮劑應(yīng)用于牛蛙的貯藏保鮮上，能有效抑制大冰晶的形成。抑制冰晶的生長，有利于食品在低溫條件下的貯藏[19]。若不加控制，隨貯存時間延長，冰晶增大不利于肉制品的保藏[20]。

表2 保鮮劑復(fù)合正交試驗結(jié)果

2.3 牛蛙成分分析

試驗測得牛蛙水分含量達(dá)80.57%，粗脂肪含量僅為0.40%，蛋白含量為4.60%。

牛蛙基本成分見表3。

表3 牛蛙基本成分

試驗所用的牛蛙蛋白質(zhì)含量明顯高于其魚肉、牛肉、雞肉和豬肉[21-23]。牛蛙屬于高蛋白低脂肪且營養(yǎng)價值較高的優(yōu)質(zhì)肉類[24]。灰分是樣品經(jīng)高溫灼燒后殘留下來的無機(jī)物，屬于營養(yǎng)的參考指標(biāo)之一，研究測定的牛蛙肉灰分含量明顯高于其他動物肉[25]。

2.4 牛蛙蛋白質(zhì)的凝膠電泳結(jié)果分析

牛蛙蛋白質(zhì)電泳結(jié)果圖見圖2。

圖2 牛蛙蛋白質(zhì)電泳結(jié)果圖

由圖2 可知，蛋白質(zhì)分子量在32～44 kDa 的條帶清晰。72 kDa 左右的蛋白，包括分子量在98～100，135，170 kDa 等處的條帶也能看到。最明顯看到的是分子量在200 kDa 左右的蛋白質(zhì)條帶顏色深且清晰。分子量40 kDa 處為輔肌動蛋白，分子量在32 kDa 左右為前Ⅰ型膠原α1鏈，分子量35 kDa 是角蛋白13，分子量72 kDa 為信號識別例子亞基和分子量135 kDa 的膠原蛋白α1鏈，與樊雨梅等人[26]的分析結(jié)果相一致。100 kDa 是副肌球蛋白，200 kDa處為肌球蛋白重鏈，200 kDa 以上條帶密集且顏色最深，可能是堿溶性蛋白和膠原蛋白的特征條帶，這與楊慧等人[27]研究大鯢肌肉分離蛋白特性結(jié)果相似。綜上所述，試驗所用的牛蛙，其蛋白主要是肌球蛋白和肌動蛋白。

2.5 酶活性對比

復(fù)合保鮮劑處理對牛蛙ATP 酶活性的影響見圖3。

圖3 復(fù)合保鮮劑處理對牛蛙ATP 酶活性的影響

凍藏過程中所形成的冰晶和升高的離子濃度會使蛋白質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致肌球蛋白球狀頭部的Ca2+-ATPase 酶活下降，因此在凍藏過程中Ca2+-ATPase 酶活的變化情況可以作為肉冷凍保護(hù)效果的指標(biāo)[28]。由圖3 可知，新鮮牛蛙Ca2+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Mg2+-EGTA 酶活性分別為0.31，0.35，0.45，0.35 μmol/mg·min，未經(jīng)保鮮劑浸泡處理凍藏3 個月后酶活性分別為0.09，0.16，0.10，0.08 μmol/mg·min，經(jīng)保鮮劑處理后酶活性分別是0.22，0.25，0.29，0.13 μmol/mg·min。由此可見，經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理后的牛蛙酶活性都有明顯升高趨勢，其中未經(jīng)處理的Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力和使用復(fù)合保鮮劑處理的試驗組未經(jīng)處理而凍藏3 個月的對照組酶活性顯著性降低，這也間接說明，復(fù)合保鮮劑的浸泡前處理在減緩牛蛙品質(zhì)下降中起到了顯著的效果[29]。參考李志鵬等人[30]的試驗發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致Ca2+-ATP酶活性下降的原因是因為在凍藏過程中，肌球蛋白球狀頭部構(gòu)象發(fā)生改變或者相互聚集，與所研究結(jié)果一致。結(jié)果表明，在試驗條件下的復(fù)合保鮮劑即2%六偏磷酸鈉，2%三聚磷酸鈉和3%焦磷酸鈉，同未經(jīng)處理的牛蛙相比，可使牛蛙的酶活提高至1.5 倍以上。這表明復(fù)合保鮮劑對冷凍牛蛙的ATP 酶活性有明顯的保護(hù)作用。2.6 鹽溶性含量對比牛蛙肉中肌肉蛋白的功能性質(zhì)主要由鹽溶性蛋白肌原纖維蛋白體現(xiàn)，測定鹽溶性蛋白的含量可以反映凍藏過程中牛蛙功能特性的變化。

牛蛙鹽溶蛋白質(zhì)量濃度對比見圖4。

由圖4 可知，新鮮牛蛙鹽溶蛋白質(zhì)量濃度2.83 mg/mL，未經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理是1.86 mg/mL，經(jīng)保鮮劑處理是2.33 mg/mL。試驗表明，2%六偏磷酸鈉、3%焦磷酸鈉、2%三聚磷酸鈉的保鮮劑復(fù)合的處理，有效抑制了鹽溶性蛋白質(zhì)量濃度的下降。復(fù)合磷酸鹽中的磷酸根離子可以增強(qiáng)魚肉離子強(qiáng)度，提高pH 值，增強(qiáng)肌動球蛋白的親水性，延緩蛋白質(zhì)的冷凍變性[31]。

3 結(jié)論

試驗通過對牛蛙進(jìn)行基本成分的測定，對比新鮮牛蛙加保鮮劑冷凍前后ATP 酶活性和鹽溶蛋白含量，探究了復(fù)合保鮮劑對于牛蛙冷凍效果的影響。試驗結(jié)果表明，牛蛙的水分含量為80.57%，粗脂肪含量為0.41%，粗灰分含量為1.10%，蛋白含量為4.6 mg/mL。通過電泳分析蛋白質(zhì)分子量表明大多集中在40 kDa 和200 kDa 左右。3 種保鮮劑對牛蛙冰點影響的優(yōu)化結(jié)果為3%焦磷酸鈉，2%三聚磷酸鈉和2%六偏磷酸鈉的復(fù)合保鮮劑。經(jīng)牛蛙肌肉ATP 酶活性和鹽溶蛋白含量的對比，表明經(jīng)此復(fù)合保鮮劑浸泡1 h 后冷凍牛蛙ATP 酶活性比未處理組牛蛙的酶活性提高至1.5 倍以上。新鮮牛蛙的鹽溶蛋白含量是2.83 mg/mL。未經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理而冷凍后的是1.86 mg/mL，但經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理冷凍后為2.33 mg/mL。試驗表明，3 種保鮮劑復(fù)合能有效降低冷凍對牛蛙的傷害，提高其新鮮度，為牛蛙保鮮提供了理論基礎(chǔ)。