孔玉鳳 譚浩 肖幸

[關(guān)鍵詞]阿爾茨海默病；文癡方；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；槲皮素

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease，AD）是以認(rèn)知障礙、精神及行為異常和社會(huì)功能減退為特征的疾病，是癡呆的最常見(jiàn)病因。根據(jù)2019年《世界阿爾茨海默病報(bào)告》，預(yù)計(jì)到2050年全球AD患者人數(shù)將增加至15200萬(wàn)[1]。AD主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，在中醫(yī)上屬于“癡呆”“健忘”等范疇，病位在腦，為本虛標(biāo)實(shí)證，腎虛、髓海虧虛為本，痰濁瘀血閉阻腦絡(luò)為標(biāo)。文癡方是全國(guó)第一批名老中醫(yī)藥專家胡毓恒在前人的基礎(chǔ)上總結(jié)得出的良方，由人參、肉蓯蓉、淫羊藿、三七、何首烏等組成，治以補(bǔ)腎健脾、豁痰祛瘀，具有很好的臨床療效[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來(lái)研究中藥治療疾病的有效手段，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、數(shù)據(jù)分析等揭示藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討文癡方治療AD的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 文癡方活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索文癡方中所有組成藥物的化學(xué)成分，設(shè)置生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行篩選，獲得文癡方的活性成分。將有意義的活性成分的InChlKey輸入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，得到標(biāo)準(zhǔn)SMILES結(jié)構(gòu)文件，并將其導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homosapiens”，獲得活性成分靶點(diǎn)信息，選擇Probability>0.5的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。將重復(fù)值刪除后，最終得到活性成分的靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)獲取

在TherapeuticTargetDatabase（TTD）數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Alzheimer’sdisease”作為關(guān)鍵詞對(duì)AD相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，在GeneCards中設(shè)定RelevanceScore≥15為篩選條件，并將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的疾病靶點(diǎn)合并，去重后獲得AD的疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)

將藥物活性成分作用靶點(diǎn)與AD疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析，取交集，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)，即為文癡方治療AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 GO富集和KEGG通路分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG分析

1.5 藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，再利用NetworkAnalyzer功能獲得的度和中介度等參數(shù)對(duì)模型進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分和作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，并剔除重復(fù)值，共獲得文癡方153個(gè)活性成分及127個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出9600個(gè)疾病靶點(diǎn)，設(shè)定RelevanceScore≥15，可篩選出706個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)，在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出139個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)，去重后共獲得791個(gè)AD相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)

將藥物活性靶點(diǎn)及疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析，共獲得46個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖1）。

2.4 GO富集分析

運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，富集結(jié)果設(shè)置以P值<0.05進(jìn)行篩選，共富集到生物學(xué)過(guò)程208條、分子功能63條、細(xì)胞組成45條，分別篩選出前10位使用微生信網(wǎng)站將富集結(jié)果進(jìn)行可視化分析（圖2）。

發(fā)現(xiàn)生物過(guò)程包括：G蛋白偶聯(lián)5-羥色胺受體信號(hào)通路、激酶活性的積極調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)自磷酸化等；分子功能包括：酶結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性等；細(xì)胞組分包括：樹(shù)突、質(zhì)膜、受體復(fù)合物等。

2.5 KEGG通路分析

運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，富集結(jié)果設(shè)置以P值<0.05進(jìn)行篩選，共富集到56條通路，使用微生信網(wǎng)站將富集結(jié)果進(jìn)行可視化（圖3），包括癌癥信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、AD、PI3K-Akt信號(hào)通路等。

2.6 文癡方-活性成分-作用靶點(diǎn)-通路-AD相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將文癡方的主要活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路、疾病信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，建立文癡方-活性成分-作用靶點(diǎn)-通路-AD相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4），該網(wǎng)絡(luò)中共包含182個(gè)節(jié)點(diǎn)和463條邊，每條邊代表兩者之間存在相互作用的關(guān)系，邊數(shù)越多表示該節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵程度越高。從圖中可以看出，槲皮素度值最大，其次是山柰酚、木犀草素，由此可以認(rèn)為，文癡方治療AD的主要活性成分可能是槲皮素、山柰酚和木犀草素。同時(shí)，在該網(wǎng)絡(luò)中，AKT1、EGFR、VEGFA、SRC、MMP9、MMP2、GSK3B、KDR是排名前8的靶點(diǎn)基因，這些靶點(diǎn)可能是文癡方治療AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。癌癥信號(hào)通路、AD、PI3K-Akt信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、神經(jīng)退行性變的信號(hào)通路是排名前5的信號(hào)通路，提示這些通路可能是文癡方治療AD的關(guān)鍵信號(hào)通路。由此可見(jiàn)，文癡方可能通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療AD。

3 討論

《內(nèi)經(jīng)精義》云：“事物所以不忘，賴此記性，記在何處，則在腎經(jīng)。益腎生精化為髓，而藏于腦”，提示腎虛髓海不足會(huì)引起癡呆健忘。陳士鐸《石室秘錄》指出“痰氣最盛，呆氣最深”，提示痰濁也是癡呆健忘的致病因素之一?！镀⑽刚摗吩唬骸吧蠚獠蛔?，腦為之不滿……皆由脾胃先虛，而氣不上行之所致也?！碧崾酒⑻撋υ?，氣不上行可以導(dǎo)致癡呆；同時(shí)，脾為生痰之源，脾胃虛弱運(yùn)化失常致痰濁內(nèi)生亦可發(fā)生癡呆。《傷寒論》有云“其人喜忘者，必有蓄血。所以然者，本有久瘀血，故令喜忘”，提示瘀血也可導(dǎo)致癡呆健忘。因此有人提出[3]，“腎虛髓虧為本，痰瘀阻滯為標(biāo)”是AD的病機(jī)特點(diǎn)。文癡方從其病機(jī)入手，補(bǔ)腎健脾、豁痰祛瘀，有中醫(yī)理論的支持。

從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)文癡方治療AD進(jìn)行分析。以上數(shù)據(jù)表明，AKT1、EGFR、VEGFA、SRC、MMP9、MMP2、GSK3B、KDR是文癡方治療AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。PI3K/Akt是一條調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生存及凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路，神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，在AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要調(diào)控作用。研究證實(shí)[4]，AD模型小鼠中，PI3K/Akt通路活性被抑制后β-淀粉樣蛋白（Aβ）大量沉積可導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)障礙。鄭清等[5]通過(guò)電針改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能障礙，并推斷其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路、誘導(dǎo)自噬、促進(jìn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)清除有關(guān)。（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）又稱血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，具有直接營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的作用，還可以促進(jìn)移植和內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、存活和分化，具有潛在的促進(jìn)腦修復(fù)的作用[6]。糖原合酶激酶3β（GSK3B）能夠促進(jìn)Aβ的沉積和以過(guò)度磷酸化Tau蛋白為核心的神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成。一項(xiàng)研究通過(guò)生物計(jì)算方法整合了大量文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及基因表達(dá)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)研究顯示，VEGFA、AKT1、GSK3B與AD的發(fā)病息息相關(guān)[7]。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）可參與調(diào)節(jié)腦發(fā)育和神經(jīng)元的存活與功能調(diào)節(jié)等活動(dòng)，被認(rèn)為是治療β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的記憶喪失的首選靶點(diǎn)[8]。研究表明，Src基因編碼形成的Src蛋白激酶可能可以促進(jìn)淀粉樣蛋白依賴性小膠質(zhì)細(xì)胞增生，從而促進(jìn)炎癥變化及AD的發(fā)生發(fā)展，抑制Src激酶活性可減輕AD小鼠模型中淀粉樣蛋白相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞增生，減輕炎癥反應(yīng)，減緩AD的發(fā)展[9]。MMP又稱基質(zhì)金屬蛋白酶，可通過(guò)影響Aβ的代謝、參與Tau低聚物的形成、破壞腦部屏障功能、促進(jìn)神經(jīng)炎癥、影響突觸可塑性等改變AD的病理進(jìn)程[10]。

槲皮素、山柰酚和木犀草素是文癡方治療AD的主要活性成分，三者都屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化的作用，可通過(guò)減少Aβ的形成、抑制Tau蛋白磷酸化、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡等途徑治療AD[11]。槲皮素具有神經(jīng)保護(hù)作用[12]，可改善AD的學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能[13]。據(jù)報(bào)道，槲皮素可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞外β-淀粉樣變性，并減少海馬和杏仁核中的tau蛋白變性、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小膠質(zhì)細(xì)胞增生，從而保護(hù)三重轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的AD病理表現(xiàn)和相關(guān)認(rèn)知缺陷[14]。多項(xiàng)研究顯示[15-18]，山柰酚具有神經(jīng)保護(hù)作用，可作為AD的潛在神經(jīng)保護(hù)劑。一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)研究顯示[19]，木犀草素可能通過(guò)激活PI3K/Akt通路，抑制氧化應(yīng)激及Tau蛋白的磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，初步探討了文癡方治療AD的潛在機(jī)制，通過(guò)槲皮素、山柰酚和木犀草素等關(guān)鍵成分對(duì)核心靶點(diǎn)AKT1、EGFR、VEGFA、SRC、MMP9、MMP2、GSK3B、KDR的調(diào)控，最終作用于PI3K-Akt信號(hào)通路、AD、癌癥信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、神經(jīng)退行性變等相關(guān)通路，為文癡方治療AD提供了理論依據(jù)。