黃堂偉 許譽(yù)芝 黃振

摘 要：甘蔗遺傳背景復(fù)雜，采用常規(guī)育種方法進(jìn)行甘蔗品種選育耗時較長，對親本的要求也較高，雜交后代分離嚴(yán)重，且會攜帶一些不需要的基因。利用基因工程可定向?qū)胩囟ㄐ誀畹幕颍瑥亩嘤哂懈弋a(chǎn)量和高價值的作物。文章在系統(tǒng)描述各種遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基礎(chǔ)上，分析農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法、基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法、電穿孔轉(zhuǎn)化法和聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)法，發(fā)現(xiàn)主要的使用方法為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法，電穿孔轉(zhuǎn)化法和PEG介導(dǎo)法存在干擾因素較多，其主要問題是轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)基因株系鑒定結(jié)果不明確，還需進(jìn)一步完善。基因編輯技術(shù)主要是RNAi沉默法和CRISPR編輯法，但甘蔗基因組研究還未取得突破性進(jìn)展，因此基因編輯仍以基因沉默法為主要手段，可供甘蔗育種中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用時借鑒。

關(guān)鍵詞：甘蔗；基因工程；CRISPR技術(shù)；分子標(biāo)記；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號：S566.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-820X（2023）06-0027-07

收稿日期：2023-10-28

基金項目：廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目（2023KY1233）；廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)校級科研項目（XKJ2316）

通訊作者：黃振（1994-），男，講師，主要從事甘蔗育種研究工作，E-mail：huangzhenhn@163.com

第一作者：黃堂偉（1988-），男，講師，主要從事作物栽培及育種研究工作，E-mail：huangtw@gxnzd.edu.cn

0 引言

甘蔗是全球第一大糖料作物，也是重要的能源作物，世界糖產(chǎn)量的75%來源于甘蔗，而我國85%以上的糖產(chǎn)量來源于甘蔗［1］，因此，保證糖料供應(yīng)是保障國家蔗糖安全的重要舉措。甘蔗作為異源多倍體作物，遺傳背景復(fù)雜，生長周期較長，進(jìn)行傳統(tǒng)育種困難較多，很難同時改變多種不良性狀［2］。目前我國登記的甘蔗品種較多，但商業(yè)化種植品種依然較單一，只有新臺糖（ROC）、桂糖和桂柳系列等［3］。甘蔗育種主要目標(biāo)為高糖、高產(chǎn)、抗病、抗蟲、抗旱、宿根性長和適宜機(jī)械收割等，但通過常規(guī)育種很難達(dá)到目的。轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有縮短育種時間、按需導(dǎo)入目的基因和避免常規(guī)育種出現(xiàn)大量基因重組所導(dǎo)致的復(fù)雜篩選過程等優(yōu)勢［4］。通過轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)，在重要糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物及園藝作物增產(chǎn)、抗逆和改善品質(zhì)等方面已取得重大突破，培育了性狀優(yōu)異的小麥［5，6］、玉米［7］和水稻［8］等作物新品種。由于甘蔗直接用于榨糖或制備能源燃料，沒有人類直接食用過程，所以轉(zhuǎn)基因甘蔗株系不會對人體造成負(fù)面影響。因此，在國際上轉(zhuǎn)基因甘蔗被認(rèn)為是風(fēng)險最低（I級）的轉(zhuǎn)基因作物，科研工作者已在不斷探索基因工程在甘蔗上的應(yīng)用前景，發(fā)現(xiàn)其具有巨大應(yīng)用潛力［9］。文章對植物的遺傳轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)綜述，并討論目前適合于甘蔗轉(zhuǎn)基因育種的方案。在此基礎(chǔ)上闡述甘蔗通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種存在的困難，分析甘蔗轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育新品種的解決方案，針對存在的轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)基因株系鑒定結(jié)果不明確和愈傷組織培育易水漬化和褐化等問題，探討解決方法，旨在為甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用提供借鑒。

1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

1.1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌是一種土棲革蘭氏陰性細(xì)菌，具有將Ti質(zhì)粒的一部分移動并整合到被感染植物細(xì)胞核中的天然能力［10］。利用農(nóng)桿菌的這種能力，F(xiàn)raley等［11］已通過其開發(fā)的缺乏腫瘤形成基因的改良農(nóng)桿菌菌株，將目的基因轉(zhuǎn)移到植物中。利用該農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化具有轉(zhuǎn)化效率較高、轉(zhuǎn)運(yùn)的DNA片段經(jīng)常作為單一拷貝集成并穩(wěn)定遺傳給后代及設(shè)備成本低等優(yōu)點(diǎn)［12，13］。此外，較少的基因整合至受體植物基因組可防止目標(biāo)基因被沉默［14］。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是雙子葉植物中常規(guī)的基因轉(zhuǎn)移方法。禾本科單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然寄主，所以禾本科作物一直被認(rèn)為是難以應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的物種。這是因?yàn)閱巫尤~植物特別是草類，很少或不分泌酚類化合物［15］，且在細(xì)胞上缺乏依賴于根癌農(nóng)桿菌的受體位點(diǎn)，降低了T-DNA啟動子在單子葉植物中的活性［16］。但農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物已取得突破性進(jìn)展，通過使用分生組織轉(zhuǎn)化［17，18］、添加信號分子、使用單子葉植物啟動子［19］和超強(qiáng)農(nóng)桿菌菌株等，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)成熟［20］。禾本科植物水稻的農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化法已較成熟，與甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)的研究也快速進(jìn)展［21］。Arencibia等［21］在1998年建立了基礎(chǔ)性的農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化體系，為此后的研究提供了借鑒。Enríquez-Obregón等［22］采用農(nóng)桿菌侵染甘蔗愈傷組織，獲得了抗除草劑的轉(zhuǎn)基因甘蔗植株。滕崢等［23］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將外源冷調(diào)節(jié)基因Cbcor15a導(dǎo)入甘蔗愈傷組織，建立了高效、快速的甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化體系，為抗寒性甘蔗品種培育奠定了基礎(chǔ)。Matusuoka等［24］利用甘蔗品種的愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，其雙元載體pMLH7133-GUS含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶nptII基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶hpt基因和uidA基因，根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA101和LBA4404。李曉梅等［25］以川蔗23號甘蔗品種誘導(dǎo)的胚性愈傷組織為受體材料，首次利用較低濃度農(nóng)桿菌侵染液（OD600≈0.1）和較短的侵染時間（1.5 min）成功實(shí)現(xiàn)了Bt（cry1Ab）基因在甘蔗上轉(zhuǎn)化。NPTII蛋白在胃腸道很容易降解，對人體不產(chǎn)生有害影響，1994年美國環(huán)境保護(hù)局確認(rèn)其為安全蛋白，可用于商業(yè)用途［26］。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可將NPTII基因?yàn)楹Y選標(biāo)記基因的載體成功轉(zhuǎn)化至甘蔗品種Q117，為甘蔗轉(zhuǎn)基因方案提供借鑒［27，28］。

目前，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法用于甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化還存在愈傷組織分化效率較低導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率較低、培養(yǎng)階段農(nóng)桿菌在愈傷組織中很難被清除干凈導(dǎo)致污染嚴(yán)重、愈傷組織培養(yǎng)易發(fā)生水漬化和褐化及轉(zhuǎn)基因株系未能利用Southern blot技術(shù)鑒定等不足［29］。

1.2 基因槍法

20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，為植物基因工程提供了一種更簡便的方法［30］。利用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行植物基因轉(zhuǎn)化較簡便，無明顯的宿主限制，幾乎適用于任何受體材料，且僅需進(jìn)行簡單的組織培養(yǎng)，無需經(jīng)過復(fù)雜的原生質(zhì)體制備和培養(yǎng)階段。基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)對改善單子葉植物中具有較長生長時間物種的性狀更有效［31］。Bower和Birch［29］通過利用包被DNA的微粒高速轟擊胚胎愈傷組織，首次獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗植株，還發(fā)現(xiàn)對愈傷組織的轟擊速度較對懸浮細(xì)胞更高。在單子葉植物啟動子Emu的作用下將NPTⅡ基因轉(zhuǎn)化到甘蔗中，通過ELISA和Southern blot可驗(yàn)證轉(zhuǎn)化株系，如在1993年用基因槍將GUS基因?qū)敫收嵊鷤M織，并檢測到GUS基因的表達(dá)［32］；隨后，F(xiàn)ranks和Birch［31］、Arvinth等［32］、Christy等［33］、Rathus和Birch［34］研究發(fā)現(xiàn)，GUS和GFP基因可作為報道基因廣泛用于檢測轉(zhuǎn)基因甘蔗。隨著對基因槍法的研究越來越深入，越來越多的轉(zhuǎn)基因甘蔗相繼出現(xiàn)。張樹珍和鄭學(xué)勤［35］通過基因槍法分別用植物表達(dá)載體pBT和pUBT轉(zhuǎn)化甘蔗，再生植株的Southern雜交結(jié)果表明海藻糖合酶基因已整合到甘蔗基因組中。

在抗蟲方面，已報道的抗蟲基因有Cry1Ab基因、抑肽酶基因和Cry1Aa3基因［32，33，36］。Christy等［33］通過基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法將馬鈴薯蛋白酶抑制劑II和雪蓮凝集素基因轉(zhuǎn)入甘蔗，可得到抗螟蟲甘蔗。Arvinth等［37］應(yīng)用共轉(zhuǎn)效率較高的3種載體，用基因槍將Cry1Ab基因轟入2個巴西甘蔗栽培品種，也獲得抗螟蟲的轉(zhuǎn)基因品種，隨后通過抗性篩選、PCR檢測分析、生物測定和ELISA測試，證實(shí)基因已經(jīng)整合到甘蔗品種中。

應(yīng)用基因槍法進(jìn)行高效率遺傳轉(zhuǎn)化也存在不足，如需解決選擇哪個植物組織培養(yǎng)階段更合適問題，嵌合體多、外源基因插入拷貝數(shù)較多及所獲得轉(zhuǎn)基因株系遺傳穩(wěn)定性較差問題，微彈對甘蔗原生質(zhì)體傷害較大問題。因此，還需對基因槍的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化［34］。

1.3 電穿孔法

與應(yīng)用基因槍法成本高和效率低及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對受體基因型依賴性強(qiáng)和新植株體易褐化相比，電穿孔法已廣泛應(yīng)用于將外源大分子DNA（目的基因）轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，具有操作簡單、快速和成本低等特點(diǎn)，常以原生質(zhì)體為受體，所有細(xì)胞在轉(zhuǎn)化后處于相同生理狀態(tài)，方便觀察和比較［38］。Negrutiu等［39］研究表明，以電穿孔法對甘蔗的原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化可獲得再生甘蔗，為進(jìn)一步完善制備甘蔗原生質(zhì)體技術(shù)提供依據(jù)。Arencibia等［21］于1995年用電激法將攜帶CaMV35p-Gus-Nos基因的pBI121質(zhì)粒導(dǎo)入商業(yè)品種POJ2878和J60-5的胚性愈傷組織，電激后6～8周，經(jīng)GUS組織染色法和進(jìn)行Southern雜交證實(shí)得到轉(zhuǎn)基因甘蔗。樂花花等［40］、薛飛等［41］研究指出，利用電穿孔法進(jìn)行植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，增加載體DNA濃度可提高基因轉(zhuǎn)移效率，但轉(zhuǎn)移效率受電場強(qiáng)度、脈沖持續(xù)時間、施加脈沖數(shù)量及電穿孔介質(zhì)組成的影響。因此，進(jìn)一步開展電穿孔技術(shù)研究對于甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化可產(chǎn)生更大的促進(jìn)作用。

1.4 聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)法

PEG是植物遺傳轉(zhuǎn)化最常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑。Chen等［42］利用PEG為轉(zhuǎn)化劑，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至甘蔗愈傷組織，并通過探針雜交獲得轉(zhuǎn)基因株系。雖然PEG介導(dǎo)法仍存在一些局限性，但優(yōu)點(diǎn)在于原生質(zhì)體可在不同植物種類中分離和大量轉(zhuǎn)化。此外，基于氯化鎂和PEG協(xié)同作用的電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體記錄非常有效。

2 基因編輯新技術(shù)

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與機(jī)理

CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌和古生菌，最初是一段由長度為29 bp的重復(fù)片段和32～33 bp的非重復(fù)片段間隔相連的重復(fù)序列［43］，能為其自身提供一種獲得性免疫保護(hù)機(jī)制，把入侵的DNA整合到自身的DNA片段上，形成前體crRNA，并在tracrRNA協(xié)同幫助下最終形成成熟的crRNA；成熟的crRNA引導(dǎo)Cas蛋白復(fù)合物對入侵者進(jìn)行定點(diǎn)切割從而抵御質(zhì)粒DNA和外源病毒入侵。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)改造而來，由Cas9蛋白和sgRNA組成，在sgRNA的引導(dǎo)下通過識別保守的間隔相鄰基序，Cas9蛋白可對目標(biāo)DNA進(jìn)行特異性剪切。目標(biāo)DNA斷裂后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)啟動修復(fù)機(jī)制，其中，細(xì)胞的非同源末端連接修復(fù)（NHEJ）機(jī)制重新連接斷裂處的基因組DNA，并引入插入或缺失突變；同源重組修復(fù)（HDR）機(jī)制需有其模板參與，在斷裂處插入或替換基因片段［44］。但CRISRP/Cas9系統(tǒng)也存在脫靶問題，對該技術(shù)的優(yōu)化還需進(jìn)一步探究。

2.2 CRISRP/Cas9系統(tǒng)在植物基因編輯中的應(yīng)用

邢慧麗［45］通過優(yōu)化條件建立了一套可高效應(yīng)用于單子葉和雙子葉植物的CRISPR/Cas9基因組編輯方法，為植物基因功能研究提供了有用工具。Shan等［46］通過優(yōu)化的化膿鏈球菌Cas9（SpCas9），在兩端附著核定位信號（NLS）并表達(dá)sgRNA轉(zhuǎn)錄物，設(shè)計了2個靶向水稻八氫番茄紅素脫氫酶基因OsPDS的不同DNA鏈sgRNA，SP1和SP2破壞水稻原生質(zhì)體中的內(nèi)源基因，從原生質(zhì)體培養(yǎng)18 h開始，檢測到有效（15%）的定向誘變，通過PCR/限制性內(nèi)切酶（PCR/RE）分析以檢測2個靶區(qū)域的突變，實(shí)現(xiàn)在水稻和小麥中進(jìn)行定點(diǎn)修飾。Shan等［46］、Walt［47］利用根癌土壤桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)測定法（農(nóng)桿菌浸潤法）在模式植物煙草中共表達(dá)具有真核細(xì)胞核定位信號和sgRNA的Cas9變體，指出在擬南芥和煙草中應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可進(jìn)行基因修飾；Miao等［43］通過密碼子優(yōu)化Cas9蛋白，在水稻中獲得含有分蘗夾角控制基因LAZY1和葉綠素合成基因CAO1的突變植株。

2.3 CRISPR/Cas9在作物育種上的應(yīng)用

王延鵬等［48］利用基因組編輯技術(shù)，首次在六倍體小麥中獲得對白粉病具有廣譜抗性的TaMLO基因3個拷貝同時突變的材料；Zhou等［49］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除水稻溫敏型雄性不育TGMS基因，得到11個新的雄性不育品系，加快了不育系的培育過程，而且有利于雜種優(yōu)勢利用；Shi等［50］在玉米中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)改造乙烯反應(yīng)負(fù)調(diào)控因子ARGOS8基因的啟動子區(qū)域，獲得了新的抗旱玉米品種。美國農(nóng)業(yè)部2016年4月的批文顯示，美國政府許可CRISPR基因組編輯的生物可直接用于種植和銷售，無需額外對CRISPR改造的農(nóng)作物進(jìn)行監(jiān)管，為基因編輯技術(shù)用于農(nóng)產(chǎn)品的商業(yè)生產(chǎn)帶來了光明前景［47］。CRISPR/Cas系統(tǒng)目前屬于新型定點(diǎn)編輯技術(shù)，對甘蔗轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)程的推動具有重要意義。

3 分子標(biāo)記輔助育種

分子標(biāo)記技術(shù)從20世紀(jì)70年代開始在植物形態(tài)學(xué)上應(yīng)用，利用分子標(biāo)記輔助選擇引起了植物育種家的重視，并已用于建立小麥、玉米和水稻等基因圖譜［51］，構(gòu)建了18張關(guān)于甘蔗分子遺傳連鎖圖譜，使用標(biāo)記數(shù)為1500～2000個［52］，使用的分子標(biāo)記包括AFLP基因［53］、RFLP基因［54］、TRAP基因［55］、EST-SSR基因［55］和DART基因［56］等，但要想得到覆蓋整個甘蔗基因組的遺傳圖譜，需更多的單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記。此外，通過QTL定位對甘蔗相關(guān)性狀進(jìn)行研究，已獲得部分與抗病、抗逆、產(chǎn)量、糖分及農(nóng)藝性狀相關(guān)的數(shù)量性狀座位（QTL）位點(diǎn)［57］。

4 結(jié)語

隨著育種技術(shù)和栽培方法的不斷完善，甘蔗的產(chǎn)量和蔗糖含量已得到大幅度提升。通過傳統(tǒng)育種、選種和利用基因編輯技術(shù)，已獲得高糖（F2KP）、抗?。⊿rMV-P1）、抗蟲（Cry1Ac）及抗旱、抗寒和易脫葉甘蔗優(yōu)良品種［4］。目前，在甘蔗轉(zhuǎn)基因品種利用方面，CTB141175/01-A（CTC 20 BT）是由巴西甘蔗育種技術(shù)公司（Centro de Tecnologia Canavieira，CTC）研發(fā)、已通過巴西批準(zhǔn)的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因抗蟲甘蔗品種，也是世界上第一個獲得商業(yè)化生產(chǎn)許可的轉(zhuǎn)基因甘蔗品種；2013年由Persero公司（印度尼西亞）研發(fā)的轉(zhuǎn)基因抗旱甘蔗NXI-1T、NXI-4T和NXI-6T僅獲得印度尼西亞食用和環(huán)境安全證書而未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化；Zhao等［58］通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了抗蚜蟲甘蔗株系；廣西大學(xué)甘蔗研究課題組通過基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，已初步獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗株系，但基因槍介導(dǎo)法還需進(jìn)一步優(yōu)化以提高轉(zhuǎn)化效率［59］。由此可見，基因工程是快速實(shí)現(xiàn)作物性狀定向改變的有力工具，在提高作物遺傳潛力方面具有很大前景。根癌農(nóng)桿菌雖然是最常用的基因傳遞系統(tǒng)，可使目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體基因組，但試驗(yàn)方案還需進(jìn)一步優(yōu)化。目前，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、電穿孔法、PEG介導(dǎo)法等轉(zhuǎn)基因方法已應(yīng)用于轉(zhuǎn)化目的基因，新型基因定點(diǎn)編輯技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于甘蔗性狀選育，以及有分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、遺傳學(xué)和新一代測序技術(shù)等作為甘蔗品種選育的支撐，相信異源多倍體甘蔗在基因組編輯及突破性新品種選育方面會取得新的突破。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）