韋廷舟, 文 怡, 王 超, 王 爽, 陳 云, 張澤穎, 范清鋒, 胡琬新, 龍治堅(jiān), 江世杰

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010; 2.四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院,四川自貢 643000;3.西南科技大學(xué)生物質(zhì)材料教育部工程研究中心,四川綿陽(yáng) 621010)

土壤鹽漬化是造成土地荒漠化的主要原因,嚴(yán)重影響土壤結(jié)構(gòu)和功能,對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生不可估量的損失[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前已有20%的耕地受到鹽分脅迫,而且鹽漬化土壤的面積仍呈現(xiàn)不斷增加趨勢(shì),預(yù)計(jì)到2050年全球?qū)⒂?0%的耕地受土壤鹽堿化的影響[3]。鹽漬化土壤中含有過(guò)高的鹽分,高鹽環(huán)境使植物產(chǎn)生滲透脅迫、質(zhì)膜損傷、離子不平衡等問(wèn)題,從而阻礙植物的生長(zhǎng)[4]。由于鹽脅迫對(duì)土地和作物的影響日益嚴(yán)重,亟待開(kāi)發(fā)一種高效可行的應(yīng)對(duì)策略解決全球糧食安全問(wèn)題,傳統(tǒng)方法是培育耐鹽新品種[5]或是開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因耐鹽植物[6],但因其效果不佳且在應(yīng)用過(guò)程中存在一定的局限性,亟須尋找一種有效可行的替代策略,近年來(lái)通過(guò)植物根際促生菌PGPR(plant growth-promoting rhizobacteria)改良鹽堿地土壤和提高植物抗逆性已然成為一種有效手段[7]。

植物根際促生菌PGPR是指生存于植物根際土壤中,具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)特性的有益微生物[8],也是目前用于鹽堿地微生物改良措施中應(yīng)用最為廣泛的微生物,PGPR通過(guò)激素促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用,從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[9]。吲哚乙酸IAA(indole-3-acetic acid)是植物內(nèi)源激素,作用于植物生長(zhǎng)發(fā)育全過(guò)程,影響植物細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)、分化以及種子萌發(fā)、根系發(fā)育等諸多過(guò)程。除此之外,IAA在植物對(duì)鹽脅迫等不良環(huán)境的響應(yīng)中也具有重要意義。已有研究表明,從植物根際土壤中分離出產(chǎn)IAA的PGPR能夠顯著促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[10]。從鹽堿地、海水等高鹽環(huán)境分離出的耐鹽PGPR能夠促進(jìn)植物在鹽脅迫環(huán)境中的生長(zhǎng);Li等從鹽堿地花生根際土壤中分離出1株能產(chǎn)IAA的陰溝腸桿菌HSNJ4,在模擬鹽脅迫條件下,接種HSNJ4菌能夠顯著增加油菜幼苗的根長(zhǎng)、株高、側(cè)根數(shù)量以及提高脯氨酸含量、抗氧化酶活性等指標(biāo),降低丙二醛含量,從而促進(jìn)油菜幼苗的生長(zhǎng)[11]。此外,PGPR還通過(guò)解鉀、產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)ACC脫氨酶等多種方式促進(jìn)植物生長(zhǎng);解鉀菌、溶磷菌通過(guò)分解土壤中的難溶性鉀、磷、硅等元素,使其轉(zhuǎn)變?yōu)橐妆恢参镂盏目扇軕B(tài)的鉀、磷、硅等元素[12];產(chǎn)ACC脫氨酶PGPR通過(guò)降解乙烯前體物ACC,抑制乙烯的合成,調(diào)節(jié)植物體乙烯的含量,從而對(duì)植物生長(zhǎng)起促進(jìn)作用[13]。周波等從檸條根際土壤中分離出一株具有產(chǎn)鐵載體功能的根際促生菌,接種菌株后能使檸條幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別增長(zhǎng)17.25%、6.68%、42.51%和20.67%,這說(shuō)明具有產(chǎn)鐵載體功能的PGPR能夠顯著促進(jìn)檸條的生長(zhǎng)[14]。因此利用耐鹽PGPR來(lái)改良鹽堿地具有較好的應(yīng)用前景。

四川省自貢市享有“鹽都”之稱(chēng),其特殊的地質(zhì)構(gòu)造孕育了地下豐富的鹽鹵資源,隨著鹽礦開(kāi)采過(guò)程中鹵水滲漏、礦鹽堆積、意外冒鹵事件均會(huì)導(dǎo)致大面積土壤鹽堿化,微生物群落對(duì)環(huán)境變化極為敏感,隨著環(huán)境變遷,土壤微生物的適應(yīng)性進(jìn)化被驅(qū)動(dòng),其種類(lèi)和結(jié)構(gòu)均不同于非鹽漬化污染的土壤[14]。因此本研究前期從自貢市長(zhǎng)山鎮(zhèn)鹽礦區(qū)周邊鹽漬化土壤中分離出1株耐鹽芽孢桿菌,通過(guò)測(cè)定其促生特性,在鹽脅迫下將其接種于甘藍(lán)型油菜種子,測(cè)定種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及其幼苗的根長(zhǎng)和株高,以期為耐鹽PGPR的開(kāi)發(fā)和鹽堿地的改良提供重要菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株及種子

本研究前期從自貢市榮縣長(zhǎng)山鎮(zhèn)鹽礦區(qū)污染的植物根際土壤中分離獲得一批具有耐鹽能力的細(xì)菌,經(jīng)分離純化保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室;大腸桿菌DH5α和枯草芽孢桿菌WB600作為對(duì)照菌株。試驗(yàn)所用甘藍(lán)型油菜種子由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。所有試驗(yàn)于2021年11月至2022年3月在四川省綿陽(yáng)市西南科技大學(xué)生物質(zhì)材料教育部工程研究中心完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株ST37的鑒定 將菌株接種于LB固體培養(yǎng)基中過(guò)夜活化,參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》觀察細(xì)菌基本特征(包括形態(tài)、顏色、邊緣、透明度等),并對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色。提取過(guò)夜培養(yǎng)的ST37菌株純培養(yǎng)物基因組DNA,以此為模板,使用通用引物F27/R1492進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至華大基因測(cè)序。獲得的16S rDNA序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析初步確定物種的分類(lèi)地位。

1.2.2 菌株ST37的耐鹽能力測(cè)定 對(duì)菌株的耐鹽性進(jìn)行分析,分別以大腸桿菌DH5α和枯草芽孢桿菌WB600為對(duì)照菌株。試驗(yàn)菌株經(jīng)過(guò)夜活化轉(zhuǎn)接于新鮮液體LB培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至菌液D600 nm為0.5,分別取培養(yǎng)物1 mL進(jìn)行梯度稀釋(10-1～10-5),每個(gè)稀釋度分別取10 μL至含有不同濃度NaCl(0、2%、4%、6%)的固體LB培養(yǎng)基表面,于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1 d,觀察菌株在不同鹽脅迫下的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 菌株ST37對(duì)油菜種子萌發(fā)的影響 用0.1% HgCl2對(duì)油菜種子進(jìn)行消毒并清洗后,分別置于ST37菌懸液(D600 nm=0.5)和無(wú)菌水中浸種1 h,待風(fēng)干后置于含無(wú)菌濾紙培養(yǎng)皿中,每個(gè)處理50粒油菜種子,分別加入等體積不同濃度的鹽溶液(0、50、100 mmol/L NaCl),以浸泡無(wú)菌水的種子為對(duì)照組,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5次重復(fù)。置于組培室,溫度設(shè)置為(20±2)℃,光照/黑暗為16 h/8 h處理。保持濾紙濕度,每日統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽數(shù),10 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率,并測(cè)定其株高和根長(zhǎng)。

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽勢(shì)=(前3 d發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.2.4 ST37菌株分泌IAA能力測(cè)定 將ST37菌株接種到含有100 mg/L色氨酸的King氏培養(yǎng)基中(以不含色氨酸的King氏培養(yǎng)液為對(duì)照),以加 100 μL 無(wú)菌水的培養(yǎng)液為空白對(duì)照,置于28 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)2 d。取培養(yǎng)物 10 000 r/min、4 ℃離心10 min的上清液4 mL,等體積加入比色液混勻,在黑暗中靜置0.5 h,立即測(cè)定D530 nm值,通過(guò)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算ST37菌株產(chǎn)IAA的量[15]。按照上述方法,通過(guò)在King培養(yǎng)基中添加不同濃度NaCl(0～4%)測(cè)定鹽脅迫對(duì)菌株產(chǎn)IAA能力的影響。

1.2.5 ST37菌株其他促生能力的檢測(cè) 利用CAS檢測(cè)液分析菌株產(chǎn)鐵載體能力[16];利用含鉀長(zhǎng)石的解鉀培養(yǎng)基檢測(cè)菌株解鉀能力[15];在ADF培養(yǎng)基上連續(xù)劃線(xiàn)5次分析菌株產(chǎn)ACC脫氨酶能力[15]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用MEGA11構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),SPSS 26.0對(duì)生理指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Origin 2017制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ST37的鑒定

ST37細(xì)菌在固體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,菌落呈淺黃色、圓形、邊緣凸起、表面光滑;經(jīng)革蘭氏染色鑒定ST37菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌。提取ST37菌株基因組DNA,以F27/R1492為引物擴(kuò)增16S rDNA片段,測(cè)序獲得1 434 bp序列,經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析,鑒定該菌為運(yùn)動(dòng)芽孢桿菌(Bacillusmobilis),系統(tǒng)發(fā)育分析也顯示菌株ST37與運(yùn)動(dòng)芽孢桿菌(NR_157731.1)親緣關(guān)系最近(圖1)。

2.2 ST37菌株對(duì)油菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

通過(guò)種子萌發(fā)試驗(yàn)研究ST37菌株在不同NaCl脅迫下對(duì)油菜種子萌發(fā)的影響。結(jié)果顯示,隨著鹽脅迫水平的增加,種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)隨之降低。與未接菌對(duì)照相比,接種ST37菌株能夠促進(jìn)種子的萌發(fā)。在0、50、100 mmol/L 的鹽脅迫下,接種ST37菌株的發(fā)芽勢(shì)比未接菌的分別提高15.00%、6.67%、2.50%;接種ST37菌株的發(fā)芽率比未接菌的分別提高0.84%、6.67%、4.40%(圖2),表明ST37菌株的接種對(duì)油菜種子的萌發(fā)具有一定的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示,接種ST37菌株的油菜株高和根長(zhǎng)均高于未接種的對(duì)照組的油菜苗株高和根長(zhǎng)。

在50、100 mmol/L NaCl處理后,接種ST37菌株的油菜苗株高分別增加了235.40%、217.78%,接種ST37菌株的油菜苗根長(zhǎng)分別增加了11.15%和100.00%。以上結(jié)果也說(shuō)明ST37菌株能夠顯著提高鹽脅迫下油菜苗的生物量(圖3)。

2.3 ST37菌株的耐鹽能力測(cè)定

通過(guò)比較試驗(yàn)菌株ST37和大腸桿菌DH5α、枯草芽孢桿菌WB600在不同NaCl脅迫下的生長(zhǎng)狀況,進(jìn)而評(píng)價(jià)其耐鹽能力(圖4)。結(jié)果顯示,與對(duì)照菌株相比,在2% NaCl處理下,菌株ST37和枯草芽孢桿菌WB600生長(zhǎng)狀況一致,均優(yōu)于大腸桿菌DH5α;在4%NaCl處理下,ST37菌株耐鹽能力強(qiáng)于DH5α而弱于WB600?？傮w而言,ST37菌株能夠耐受2%和4% NaCl 脅迫,具有一定的耐鹽能力。

2.4 鹽脅迫下菌株ST37產(chǎn)IAA能力

進(jìn)一步分析ST37菌株在不同NaCl脅迫下產(chǎn)IAA能力,結(jié)果顯示,ST37菌株產(chǎn)IAA能力隨NaCl濃度的增加而顯著降低。不加NaCl的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后,其分泌IAA的含量為6.82 mg/L;加入1% NaCl后,ST37菌株產(chǎn)IAA能力顯著降低,為不加NaCl對(duì)照組IAA含量的57.52%,加入3%～4%NaCl時(shí),其產(chǎn)IAA含量差異不顯著,維持在2.15～2.88 mg/L之間,表明ST37菌株在中度鹽脅迫下仍具有產(chǎn)IAA的能力(圖5)。

2.5 菌株ST37的促生特性分析

微生物除通過(guò)分泌IAA之外,還可以通過(guò)解鉀、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)ACC脫氨酶等方式評(píng)價(jià)其潛在促生能力。由圖6結(jié)果顯示,ST37菌株在含有鉀長(zhǎng)石的解鉀培養(yǎng)基上可產(chǎn)生明顯透明圈,說(shuō)明其具有分解難溶性鉀鹽的能力;通過(guò)與對(duì)照相比,ST37菌株的接種導(dǎo)致培養(yǎng)液顏色變紅變深,說(shuō)明該菌具有一定的產(chǎn)鐵載體能力;在ADF培養(yǎng)基上連續(xù)接種ST37菌株純培養(yǎng)物5次, 依然可以正常生長(zhǎng), 說(shuō)明其具有產(chǎn)ACC脫氨酶的能力?；谏鲜鲈囼?yàn)結(jié)果,表明ST37菌株可能通過(guò)產(chǎn)IAA、解鉀、產(chǎn)鐵載體、分泌ACC脫氨酶等方式使油菜幼苗表現(xiàn)出一定的耐鹽促生表型。

3 討論

本研究試驗(yàn)菌株ST37分離自鹽礦區(qū)污染的土壤中,高鹽環(huán)境長(zhǎng)期馴化使菌株產(chǎn)生一定的耐鹽能力,本研究通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證ST37菌株能夠耐受4%的NaCl,經(jīng)過(guò)16S rRNA基因測(cè)序初步鑒定ST37菌株是Bacillusmobilis,屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。目前,關(guān)于B.mobilis的研究較少;Korobov等從含有大量除草劑土壤中分離的B.mobilis能夠降解2,4,5-三氯苯氧基乙酸,接種該菌9 d后能夠降解培養(yǎng)基中62% 的2,4,5-三氯苯氧基乙酸,20 d后能夠有效降解土壤中的2,4,5-三氯苯氧基乙酸,去污程度達(dá)到58%,說(shuō)明該菌株能夠作為改善土壤農(nóng)藥的去污微生物菌劑[17]。杜慧慧等為尋找高效微生物肥料潛在菌株,從云南多葉樹(shù)根際土壤中篩選出41株解磷細(xì)菌,經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn),B.mobilis是41株解磷細(xì)菌中溶磷能力最強(qiáng)的菌株,說(shuō)明B.mobilis在去污、促生等方面具有一定的潛力[18]。

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)周期中最基本和最重要的階段,也是對(duì)鹽脅迫最為敏感的時(shí)期[8]。土壤中鹽分積累導(dǎo)致滲透勢(shì)增加,不利于種子吸收水分,阻礙種子內(nèi)部核酸和蛋白質(zhì)代謝[19],影響內(nèi)源激素合成,從而抑制種子萌發(fā)[20-21]。大量研究表明,在鹽脅迫下,接種耐鹽PGPR可以促進(jìn)種子萌發(fā)。本研究通過(guò)接種ST37菌株能夠有效緩解低鹽濃度(50 mmol/L NaCl)對(duì)油菜種子萌發(fā)的毒害作用,對(duì)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)以及株高、根長(zhǎng)等均有顯著的增益和改善作用。然而在高鹽脅迫下,ST37菌株緩解鹽脅迫的作用下降或不明顯,這與前人的研究結(jié)果[22]基本一致。有研究表明,接種耐鹽PGPR可以有效促進(jìn)植物根系對(duì)土壤礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用,增強(qiáng)植物體內(nèi)的離子平衡,增加植物種子對(duì)水分的吸收和利用能力,從而促進(jìn)植物種子的萌發(fā);但是過(guò)高的鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致種子胚細(xì)胞破裂,植物體內(nèi)代謝失調(diào),造成核酸蛋白合成受阻及毒素積累等,從而導(dǎo)致耐鹽PGPR緩解鹽脅迫能力下降[23]。

耐鹽PGPR通過(guò)自身代謝產(chǎn)生植物激素(如IAA等)、分泌ACC脫氨酶、產(chǎn)鐵載體等多種促生活性物質(zhì),或者具有將難溶性鉀、磷轉(zhuǎn)變?yōu)橹参镆孜盏目扇苄遭浐土椎哪芰?從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。IAA能促進(jìn)植物細(xì)胞生長(zhǎng),使細(xì)胞的體積和質(zhì)量增加,也是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育全過(guò)程的信號(hào)物質(zhì)[24]。研究表明,在處于高鹽等逆境條件下,植物自身合成IAA的能力受到抑制,外源IAA的介入能促進(jìn)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng),從而增強(qiáng)植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力[25];Li等從鹽堿地獲得1株分泌IAA的陰溝腸桿菌能夠顯著促進(jìn)油菜幼苗的生長(zhǎng),也證明了PGPR分泌的IAA能顯著促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[11]。本研究中ST37菌株不僅是中度耐鹽菌,而且在不同鹽濃度下能分泌IAA,從而在不同鹽脅迫下促進(jìn)植物種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng),這與前人研究結(jié)果基本一致。研究發(fā)現(xiàn),利用可合成ACC脫氨酶的細(xì)菌可以增強(qiáng)水稻在鹽脅迫下的生長(zhǎng)[26];陳小娟等從濱海鹽堿地根際土壤樣品中分離出2株芽孢桿菌,均具有分泌IAA、產(chǎn)鐵載體等促生能力,與施用普通有機(jī)肥相比,施用這2株菌的微生物肥料均能顯著增加玉米產(chǎn)量[27]。綜上,本研究中ST37菌株具有解鉀、分泌IAA、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)ACC脫氨酶等促生特性,且能在4% NaCl的鹽環(huán)境中生存,說(shuō)明該菌株在鹽脅迫中具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的潛力,其可能通過(guò)以上一種或多種方式促進(jìn)油菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng),然而,對(duì)于該菌詳細(xì)的促生機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究菌株ST37經(jīng)初步鑒定為Bacillusmobilis,具有耐受4% NaCl、產(chǎn)IAA、解鉀、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)ACC脫氨酶等能力。在鹽脅迫下,ST37菌株能夠促進(jìn)油菜種子萌發(fā)和油菜幼苗的生長(zhǎng),說(shuō)明該菌株具有一定的耐鹽促生特性。本研究ST37菌株可作為植物促生菌的理想候選菌株,在改善和修復(fù)鹽堿地方面具有一定的應(yīng)用潛力。