葉偉文 ，李 卓 ，賴燁才，秦 飛 *，林添煒

（1. 廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司 白云山制藥總廠，廣東 廣州 510515；2. 廣東省化學(xué)藥原料與制劑關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室，廣東 廣州 510515）

頭孢克肟最早由日本藤澤制藥株式會社研發(fā)成功，為第一個第三代口服頭孢菌素類廣譜抗生素，臨床用于治療敏感菌引起的呼吸道系統(tǒng)感染、尿道感染、膽道感染等，劑型包括顆粒劑、膠囊劑、片劑等[1-2]。頭孢克肟屬于生物藥劑學(xué)藥物分布分類系統(tǒng)（BDDCS）的4類藥物（低溶解性、低滲透性）[3]，在水中不溶。難溶性藥物原料的粒度控制對于口服固體制劑尤其重要，不僅直接影響制劑生產(chǎn)過程的混合、制粒、壓片等工序，還會影響產(chǎn)品的溶出度和生物利用度，因此，建立有效的頭孢克肟原料粒度的檢測方法，對于產(chǎn)品的工藝開發(fā)，降低產(chǎn)品批間差異及保證產(chǎn)品的臨床有效性均有重要意義。

2020年版中國藥典（四部）收載了3種粒度和粒度分布的測定方法：顯微鏡法、篩分法和激光散射法，其中激光散射法基于米氏散射理論和費朗霍夫近似理論，通過測量散射光的能量分布從而得到粒徑的大小和分布[4]。激光散射法與傳統(tǒng)的顯微鏡法和篩分法相比，操作簡單，檢測靈敏度高，測定范圍廣（0.02～3500 μm），測量結(jié)果不易受人為因素影響，近年較多應(yīng)用于原輔料的粒度控制。

2016年2月6 日，國務(wù)院明確指出，凡是未按照與原研藥品質(zhì)量和療效一致原則獲批上市的仿制藥，均須開展一致性評價[5]，因此國內(nèi)的頭孢克肟品種基本都需要開展一致性評價研究。

本研究對采用激光散射法測定頭孢克肟粒度進行了方法學(xué)考察，對比頭孢克肟原料不同粒徑對其顆粒劑體外溶出曲線的影響，并與參比制劑的體外溶出曲線進行對比，為頭孢克肟制劑的研發(fā)和生產(chǎn)控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Malvern Mastersizaer 2000型激光粒度儀（Scirocco 2000干法進樣器，英國馬爾文儀器有限公司）；Olympus BX-41顯微鏡（奧林巴斯株式會社）；UV-2600紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；FADT-1202RC自動溶出儀（上海富科思分析儀器有限公司）；FAVD-25智能真空脫氣儀（上海富科思分析儀器有限公司）；CPA225D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；ACS-6型電子計量天平（廣州市中興電子衡器廠）；GF-300型電子天平（廣州市艾安得儀器有限公司）；PLB-3多功能制粒包衣機（重慶廣廈干燥設(shè)備工程公司）；HLSG-20A濕法混合顆粒機（北京航空制造工程研究所）；XL-250型旋轉(zhuǎn)式顆粒機（常州市佳發(fā)制粒干燥設(shè)備有限公司）；HLS-50實驗室料斗混合機（浙江小倫制藥機械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

頭孢克肟細粒（參比制劑，規(guī)格：50 mg，批號：CB011，長生堂制藥株式會社）；頭孢克肟對照品（批號：130503-201706，含量89.2 %，中國食品藥品檢定研究院）；頭孢克肟（批號：AP004-1903-2074，AP004-1905-2032，AP004-1904-2009，AP004-1904-2028，AP004-1904-2013，AP004-1903-2068，AP004-1903-2029，AP004-1806-2039，AP004-1801-2026，浙江普洛得邦制藥有限公司）；蔗糖（批號：20190428，嘉興市白浪淀粉制品有限公司）；阿拉伯膠（批號：190201，湖北葛店人福藥用輔料有限責(zé)任公司）；羥丙基纖維素（批號：188406，Aqualon Company）；甜橙粉末香精（批號：20190201-A7，佛山市三水百花香料香精科技有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 粒度測定方法的選擇

根據(jù)2020年版中國藥典（四部）通則中激光散射法[4]，分別嘗試采用濕法和干法測定頭孢克肟原料粒度。頭孢克肟在水中不溶，因此選用純化水作為濕法的分散劑較為適合。取適量頭孢克肟原料分散于水中，發(fā)現(xiàn)原料部分沉于底部，部分浮于液體表面，簡單的攪拌難以分散均勻，通過超聲、加入助懸劑十二烷基硫酸鈉、吐溫80等手段分散效果得以改善，但分散系統(tǒng)不穩(wěn)定，測定過程出現(xiàn)遮光度持續(xù)上升的現(xiàn)象，無法準(zhǔn)確測定樣品粒度。頭孢克肟無引濕性，采用干法測定無需對樣品進行前處理，操作簡單快捷，因此選用干法作為測定頭孢克肟原料粒度分布的方法。

2.2 方法學(xué)考察

設(shè)置光學(xué)參數(shù)，對儀器分散氣壓、進樣頻率、遮光度、測量時間等進行考察，并對最終確定的方法進行精密度和重復(fù)性試驗。

2.2.1 光學(xué)參數(shù)的選擇 頭孢克肟為白色至淡黃色結(jié)晶性粉末，選擇吸收率為0.1，折射率為1.81。

2.2.2 分散氣壓的選擇 一般地，分散氣壓大小會直接影響樣品的分散狀態(tài)，對測定結(jié)果產(chǎn)生較大影響，因此，首先考察氣壓對測定結(jié)果的影響。初步選擇遮光度0.5 %～5.0 %，進樣頻率50 %，測量時間8 s，分別設(shè)置不同分散氣壓0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 bar，平行取頭孢克肟原料6份，分別測定6次（n=6）并計算RSD，繪制分散氣壓-粒度分布圖，結(jié)果見表1和圖1。

表1 不同分散氣壓的檢測結(jié)果（n=6）

圖1 不同氣壓的粒度分布

從表1、圖1可見，隨著分散氣壓的逐漸增大，樣品逐步分散，粒徑逐漸變小，當(dāng)分散氣壓增大至2.5 bar以后，樣品d(0.1)、d(0.5)、d(0.9)的變化趨于平緩，表明分散壓力足夠大后，樣品充分分散，粒徑分布基本穩(wěn)定，測定結(jié)果RSD均較小。但隨著分散氣壓的增大，顆粒發(fā)生破碎的風(fēng)險也會增加，為了避免分散氣壓過大可能對顆粒造成破碎，綜合考慮選擇分散氣壓為2.5 bar。

2.2.3 進樣頻率的選擇 取頭孢克肟樣品，根據(jù)2.2.2項下結(jié)果設(shè)置分散氣壓為2.5 bar，設(shè)置進樣頻率25 %，50 %，75 %，測定結(jié)果見表2。

表2 不同進樣頻率的檢測結(jié)果（n=6）

由表2可見，進樣頻率為25 %時，測定結(jié)果RSD偏大，當(dāng)樣頻率為50 %，75 %時，測定結(jié)果RSD均較小，觀察發(fā)現(xiàn)，進樣頻率為25 %時，樣品進樣時的流動性略欠佳，會有細粉黏附在壁上，而在50 %和75 %進樣頻率下，樣品的流動性均較好，進樣均勻。結(jié)合測定結(jié)果，進樣頻率為50 %時，進樣速度合適，粒度分布的RSD值較小，能滿足測定要求。最終選擇進樣頻率為50 %。

2.2.4 遮光度的考察 取頭孢克肟樣品，根據(jù)2.2.3項下結(jié)果設(shè)置進樣頻率50 %，考察不同遮光度的粒度分布，測定結(jié)果見圖2。

圖2 不同遮光度的粒度分布（n=6）

由圖2可見，遮光度在0.5 %～5.0 %范圍內(nèi)，測量結(jié)果基本一致，說明遮光濃度對粒徑測定結(jié)果影響不大，因此選擇遮光度為0.5 %～5.0 %。

2.2.5 測量時間的考察 取頭孢克肟樣品，按2.2.4項下設(shè)置相關(guān)測定參數(shù)，考察測量時間分別為4，6，8，10 s的粒度分布，測定結(jié)果見表3。

表3 不同測量時間的檢測結(jié)果（n=6）

由表3可見，測量時間為4 s時，測定結(jié)果RSD偏大，當(dāng)測量時間為6～10 s時，測定結(jié)果RSD均較小，綜合選擇測量時間為8 s。

2.2.6 精密度試驗 根據(jù)方法學(xué)考察結(jié)果，選擇最佳的測定參數(shù)為：樣品吸收率0.1，折射率1.81，分散氣壓2.5 bar，進樣頻率50 %，遮光度0.5 %～5 %，測量時間8 s。由兩名不同的實驗人員，在不同日期取頭孢克肟原料適量，分別平行測定6次，測定結(jié)果見表4。

表4 精密度檢測結(jié)果（n=12）

根據(jù)USP中粒度測定方法的要求[6]，粒度分布中的中心值d(0.5)的RSD應(yīng)小于10 %，分布的邊界值d(0.1)和d(0.9)的RSD應(yīng)小于15 %，若數(shù)值小于10 μm時，RSD可放寬一倍。結(jié)果表明，重復(fù)性和中間精密度測定結(jié)果d(0.1)、d(0.5)和d(0.9)的RSD均小于2 %，說明本方法的精密度良好。

2.2.7 原料藥的顯微鏡觀察 頭孢克肟原料在顯微鏡下的粒度分布情況，見圖3。

圖3 頭孢克肟在顯微鏡觀察圖（批號：AP004-1903-2074）

由圖3可見，顯微鏡下觀察的頭孢克肟原料粒度分布情況與激光散射法測定結(jié)果基本一致。

2.3 樣品的測定

根據(jù)建立的頭孢克肟原料粒度檢測方法對多批不同粒度的原料進行測定，結(jié)果顯示所測定的9批原料，d(0.1)在1.36～8.57 μm范圍內(nèi)，d(0.5)在17.2～120.1 μm范圍內(nèi)，d(0.9)在47.2～189.2 μm范圍內(nèi)，詳見表5。

表5 頭孢克肟粒度測定結(jié)果（n=3）

2.4 頭孢克肟顆粒的制備

稱取處方量的頭孢克肟（為上述不同粒徑的原料）、蔗糖、阿拉伯膠，羥丙基纖維素，混合2 min，加入潤濕劑制軟材，將制備好的軟材置旋轉(zhuǎn)式顆粒機中制粒，流化干燥，最后加入處方量的甜橙粉末香精混勻，分裝即得頭孢克肟顆粒（自研制劑：A、B、C、D、E、F、G、H、I）。

2.5 頭孢克肟顆粒溶出曲線測定[7-8]

參考中國藥典（2020年版）二部收載的頭孢克肟顆粒溶出度測定法。取自制頭孢克肟顆粒和參比制劑，照溶出度測定法（槳法），以磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）900 ml為介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r/min，依法操作，于5，15，30，45 min時間點取樣5 ml（取樣后補液），并過0.45 μm微孔濾膜，精密量取2 ml濾液至10 ml量瓶，加溶出介質(zhì)定容，得供試品溶液。另取頭孢克肟對照品約11 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加溶出介質(zhì)適量使其溶解，再加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液，照紫外-可見分光光度法，在288 nm波長處分別測定吸光度，計算每袋的溶出量。結(jié)果見表6和圖4。結(jié)果表明，隨著原料粒徑d(0.9)的增大，其顆粒劑在pH 6.8介質(zhì)中的溶出速度呈減慢趨勢，自研制劑A、B、C及D在該介質(zhì)中15 min溶出度均大于85 %，與參比制劑一致，其對應(yīng)的頭孢克肟原料粒徑d(0.9)分別為47.2，54.3，68.5，78.3 μm。

表6 頭孢克肟顆在pH 6.8介質(zhì)中的溶出度測定結(jié)果（n=12）

圖4 頭孢克肟顆粒在pH6.8介質(zhì)中溶出曲線

3 討論

本研究建立了激光散射法（干法）測定頭孢克肟原料粒度分布的方法，考察了分散氣壓、進樣頻率、遮光度及測量時間對測定結(jié)果的影響，并進行了精密度試驗。結(jié)果表明，該法操作簡單、重復(fù)性好，可用于頭孢克肟原料的粒度控制。

中國藥典2020年版二部收載的頭孢克肟顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7]采用pH 7.2磷酸緩沖液作為溶出度的溶出介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，頭孢克肟在pH 7.2磷酸緩沖液中的溶解度大于其在pH 6.8磷酸緩沖液中的溶解度，區(qū)分力較弱。文獻報道頭孢克肟主要在小腸吸收[9]，因此本研究采用pH 6.8磷酸緩沖液作為篩選粒徑的溶出介質(zhì)更有利于實現(xiàn)與參比制劑體內(nèi)等效。實驗結(jié)果顯示頭孢克肟顆粒參比制劑在pH 6.8磷酸緩沖液中15 min溶出度大于85 %，若仿制制劑15 min溶出度大于85 %，可判斷與參比制劑溶出行為相似[10]，根據(jù)溶出結(jié)果，原料粒徑d(0.9)為78.3 μm時，其顆粒15 min的溶出度為86 %，與參比制劑一致，因此，為了實現(xiàn)自研制劑與參比制劑的溶出行為相似，降低BE試驗的風(fēng)險，應(yīng)控制原料粒徑d(0.9)≤75 μm。對于難溶性藥物，原料粒度是影響產(chǎn)品溶出的關(guān)鍵因素之一，另外溶出還會受處方和工藝因素影響，粒度的控制應(yīng)與處方和制備工藝相匹配，一般在確定處方和制備工藝后，應(yīng)再次考察粒度對溶出行為的影響，制定合適的控制標(biāo)準(zhǔn)，以降低產(chǎn)品的批間差異，保證產(chǎn)品質(zhì)量。

近年，隨著仿制藥一致性評價工作的深入開展，原料粒度的研究越來越受到關(guān)注，粒度的控制對產(chǎn)品的開發(fā)和穩(wěn)定生產(chǎn)，實現(xiàn)自研產(chǎn)品和原研產(chǎn)品質(zhì)量和療效一致起到關(guān)鍵作用。本研究采用激光散射法（干法）測定頭孢克肟原料的粒度，研究了不同粒徑原料對其顆粒劑溶出行為的影響，為頭孢克肟制劑的產(chǎn)品開發(fā)提供參考。