張柏生 ，熱依木古麗·阿布都拉，信學(xué)雷，范芳芳 ，李 茜

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆中藥炮制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830000；3. 中國科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆特有藥用資源利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830011）

洋甘菊（Matricarla chamomillaL.）的藥用歷史悠久。新疆民族藥中的多個(gè)處方含洋甘菊，《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（維吾爾藥分冊(cè)）中就收錄了3個(gè)包含洋甘菊的制劑。洋甘菊具有抗菌、抗炎、解痙、抗?jié)儭⒃鰪?qiáng)免疫力、降低血脂、降低血糖等作用，主要用于治療感冒、咳嗽，中風(fēng)等癥[1-2]。國內(nèi)外的大量研究表明洋甘菊中含黃酮類、酚酸類、香豆素類、萜類、揮發(fā)油、多糖類及其他化學(xué)成分[3-6]。這些成分是洋甘菊藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。其中咖啡?；鼘幩犷愐驯蛔C實(shí)具有抗炎、抗哮喘、抗腫瘤、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等作用[7-8]。在前期提取工藝研究基礎(chǔ)上，本研究以3, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岷?, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岬暮繛橹笜?biāo)，考察具有不同物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)（不同極性）的10種樹脂的靜態(tài)吸附-解吸能力，篩選出純化功能最好的樹脂型號(hào)AB-8。進(jìn)一步研究AB-8型大孔吸附樹脂富集洋甘菊活性部位過程中吸附量、上樣量、上樣濃度、解吸參數(shù)等因素的影響，使工藝更加適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695型超高效液相色譜系統(tǒng)，包括Waters 2489 UV/Visible Detector，Empower色譜工作站（美國Waters公司）；UV-2550型紫外可見分光光度儀（日本島津）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi）；FDU-2100型冷凍干燥器（日本EYELA）；DZF-6050B型真空干燥箱（上海齊欣）；MOOEL ESJ-6020型電子分析天平（沈陽龍騰）。

1.2 試藥

HPD-100，HPD-450，HPD-600，HPD-750型大孔吸附樹脂（滄州寶恩）；D101型大孔吸附樹脂（上海摩速）；D140，D4020，AB-8，NKA-9，X-5型大孔吸附樹脂（南開大學(xué)化工廠）；3, 4-二-O-咖啡?；鼘幩釋?duì)照品，4, 5-二-O-咖啡?；鼘幩釋?duì)照品（中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所自制）；乙腈，甲醇為色譜純（美國Fisher公司）；超純水。

1.3 藥材

洋甘菊藥材購自新疆伊犁地區(qū)昭蘇縣，為《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(cè)》收載，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院李玲主任藥師鑒定為菊科母菊屬一年生或多年生草本植物，拉丁名Matricarla chamomillaL.[9]。

2 方法與結(jié)果

2.1 洋甘菊活性部位的制備

取洋甘菊全草4 kg，加70 %乙醇回流提取2次，每次2 h，料液比1:30，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至0.20 g/ml。

2.2 咖啡?？鼘幩岷繙y(cè)定方法學(xué)研究

2.2.1 色譜條件 Thermo Golden Proshell C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱；以0.2 %甲酸-水溶液（A）和乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫，程序見表1。330 nm下采集指標(biāo)成分的峰面積；柱溫設(shè)置為35 ℃，流速設(shè)置為0.3 ml/min。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取3, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岷?, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品適量，置于50 ml量瓶中，加60 %甲醇超聲溶解，定容，搖勻，制成對(duì)照品溶液，每1 ml溶液中含3, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岷?, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岱謩e為43.3 μg/ml和33.5 μg/ml。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取樣品粉末（過40目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞圓底燒瓶中，精密加入60 %乙醇100 ml，稱定重量，浸泡30 min后加熱回流40 min，取出，放冷，用60 %乙醇補(bǔ)足重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 測(cè)定法 按2.2.1項(xiàng)色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μl，注入超高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算供試品中兩種咖啡?？鼘幩岬暮俊?/p>

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取3, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岷?, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6，7 ml于10 ml量瓶中，加60 %甲醇至刻度，搖勻，即得。按2.2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，進(jìn)樣量10 μl。以對(duì)照品峰面積（Y）對(duì)其濃度（X，μg/ml）進(jìn)行線性回歸。分別得到3, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岷?, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。

表2 線性回歸方程

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取3, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岷?, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品溶液適量，置于10 ml量瓶中，加60 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岱迕娣e的RSD分別為0.048 %和0.088 %，表明方法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取供試品粉末適量，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得3,5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岱迕娣eRSD值分別為1.23 %和0.68 %, 表明供試品溶液室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取供試品粉末適量，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定，測(cè)得供試品中3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岬钠骄糠謩e為0.173 %和0.12%，RSD值分別為0.44 %和0.46 %，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn) 取同批次已知含量（3, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岷?, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岷糠謩e為0.173 %，0.12 %）的藥材70 mg，精密稱定，共6份，置10 ml量瓶中，按樣品中咖啡?？鼘幩岷?:1比例，精密加入兩種咖啡?？鼘幩釋?duì)照品，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岬钠骄訕踊厥章史謩e為96.90 %和99.89 %，RSD分別為0.83 %和2.26 %，結(jié)果見表3、表4。表明該分析方法準(zhǔn)確。

表3 3, 5-二-O-咖啡?；鼘幩峒訕踊厥赵囼?yàn)結(jié)果

表4 4, 5-二-O-咖啡?；鼘幩峒訕踊厥赵囼?yàn)結(jié)果

2.3 樹脂處理

用95 %乙醇浸泡10種大孔樹脂2～4 h，排出乙醇后，用蒸餾水反復(fù)沖洗至樹脂在試管中不顯渾濁為止，再用超純水充分淋洗樹脂至無醇味，抽濾。

2.4 大孔吸附樹脂吸附率和解吸率的計(jì)算方法

按下式計(jì)算樹脂吸附率和解吸率。

A0為原液中指標(biāo)成分的峰面積；A流為流出液中指標(biāo)成分的峰面積；A解為解吸液中指標(biāo)成分的峰面積。

2.5 樹脂的篩選

稱取10種已處理好的大孔吸附樹脂各2 g，加洋甘菊提取液30 ml，置于搖床，25 ℃、87 r/min振搖2 h，放置10 h，抽濾，測(cè)定指標(biāo)成分的峰面積。濾去提取液后的大孔樹脂水洗抽干，加70 %乙醇30 ml，25 ℃、87 r/min振搖2 h，放置2 h，進(jìn)行靜態(tài)解吸，測(cè)定解吸液指標(biāo)成分的峰面積，計(jì)算吸附率和解吸率，結(jié)果見表5。

表5 10種大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸情況

由表3可見，綜合考慮各樹脂的吸附率和解吸率，選擇AB-8進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.6 上樣濃度的考察

將AB-8樹脂按2.3項(xiàng)下方法處理，裝入樹脂床體積（BV）為50 ml的樹脂柱，分別加入生藥濃度為0.20，0.16，0.12 g/ml的上樣液10 BV，吸附流速為2 BV/h, 收集每1 BV（50 ml）流出液，離心，過濾，進(jìn)行超高效液相色譜（UPLC）測(cè)定，計(jì)算吸附率，確定上樣濃度。結(jié)果見表6。

表6 上樣濃度考察結(jié)果

由表6可見， 隨著上樣濃度的降低，吸附量在持續(xù)增加。上樣濃度為0.16，0.12 g/ml時(shí)，10倍上樣體積時(shí)還未達(dá)到吸附飽和。上樣液濃度為0.2 g/ml時(shí)，與其他上樣濃度（0.16，0.12 g/ml）相比，上樣時(shí)間短，且上樣液總體積較小，考慮到實(shí)際生產(chǎn)需要，選擇上樣濃度為0.20 g/ml。

2.7 上樣量的考察

根據(jù)上樣濃度考察結(jié)果，選擇吸附量為90 %以上的上樣體積作為最終上樣量。即，對(duì)于生藥濃度為0.20 g/ml的提取液，最佳上樣量為7 BV（見表6）。

2.8 吸附速率的考察

量取洋甘菊提取液（0.20 g/ml）400 ml，經(jīng)50 ml（徑高比為1:6）AB-8型大孔吸附樹脂柱吸附，流速分別設(shè)計(jì)為 1，2，3 BV/h ，收集流出液，測(cè)定指標(biāo)成分的峰面積，計(jì)算吸附率。結(jié)果見表7。

表7 洋甘菊提取液吸附速率的考察結(jié)果

由表7可見，當(dāng)吸附速率成倍增加時(shí)，3, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岷?, 5-二-O-咖啡?；鼘幩岬奈搅糠炊陆怠．?dāng)吸附速率為 3 BV/h時(shí)，吸附量顯著減少?？紤]到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需要，選擇吸附速率為2 BV/h。

2.9 水沖洗用量的考察

將吸附飽和的樹脂柱按5 BV/h流速，用純凈水洗脫樹脂未吸附的溶液，收集流出液，測(cè)定目標(biāo)成分的峰面積。結(jié)果表明，結(jié)合生產(chǎn)需要，用水量為1 BV最合適，見表8。

表8 水洗量的考察結(jié)果

2.10 洗脫溶劑的考察

分別量取洋甘菊提取液（生藥濃度為0.2 g/ml）350 ml，以2 BV/h吸附速率，經(jīng)50 ml（徑高比1:6）AB-8樹脂柱吸附，再以5 BV/h流速，用1 BV水洗后，分別用 50 %，70 %，95 %乙醇溶液洗脫目標(biāo)化合物, 收集洗脫液4 BV，測(cè)定指標(biāo)成分的峰面積，計(jì)算解吸率，結(jié)果見表9。

表9 洗脫溶劑的考察結(jié)果

由表9可見，幾種溶劑對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫效果無明顯差別。需進(jìn)一步綜合考察洗脫劑和用量。

2.11 洗脫溶劑和用量的考察

取洋甘菊提取液（生藥濃度為0.2 g/ml）350 ml，以2 BV/h吸附速度，經(jīng)50 ml（徑高比1:6）AB-8樹脂柱吸附，再以 5 BV/h流速，用1 BV水洗后，依次用50 %乙醇3 BV、70 %乙醇3 BV、95 %乙醇3 BV洗脫目標(biāo)化合物，測(cè)定峰面積，計(jì)算解吸率。結(jié)果見表10。

表10 洗脫溶劑的考察結(jié)果

由表10可見，用3 BV 50 %乙醇洗脫之后，1 BV 70 %乙醇基本上可把目標(biāo)化合物洗脫出來。

3 討論

本文以3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡?；鼘幩醿煞N特征成分為洋甘菊活性部位含量測(cè)定指標(biāo)，對(duì)10種不同型號(hào)和功能的大孔吸附樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸功能評(píng)價(jià)，選出適合洋甘菊活性部位富集功能的樹脂型號(hào)AB-8。進(jìn)一步對(duì)洋甘菊提取物純化效率的影響因素（上樣量、上樣濃度、吸附速率、洗脫溶劑和用量等）進(jìn)行考察。最終確定洋甘菊活性部位制備工藝：采用AB-8型大孔吸附樹脂，藥液濃度0.20 g/ml（相當(dāng)于原生藥），樹脂柱徑高比1:6，吸附速率2 BV/h，在此條件下，上柱量達(dá)到7 BV；吸附好的樹脂先以5 BV/h流速的1 BV水洗凈，再依次用3 BV 50 %乙醇和1 BV 70 %乙醇洗脫，合并洗脫液，濃縮，干燥。

咖啡?；愌苌锓N類繁多，具有抗炎、抗氧化、抗菌等廣泛的生物活性，同時(shí)具有低毒、抗耐藥、易制備等優(yōu)點(diǎn)[10]。因此選擇二咖啡酸奎寧酸化合物為提取工藝考察指標(biāo)。

前期研究證明洋甘菊活性成分主要集中在中等偏大極性部位，同時(shí)考慮到大工業(yè)生產(chǎn)的需要，考慮直接使用50 %乙醇進(jìn)行洗脫。50 %乙醇主要洗脫成分為酚酸類物質(zhì)[11-13]。但活性部位的目標(biāo)成分不止酚酸類物質(zhì)，還有生物活性較好的黃酮類物質(zhì)。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類物質(zhì)一般需用70 %乙醇才能將其從大孔樹脂上洗脫下來，最終確定采用3 BV 50 %乙醇洗脫后用1 BV 70 %乙醇繼續(xù)洗脫，得目標(biāo)活性部位[14-15]。該純化工藝具有吸附量大、吸附速度快、易于解吸附、成分損失少、樹脂使用周期長等優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。