串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在新生兒遺傳代謝病篩查中的應(yīng)用研究進(jìn)展

趙娜

[ 關(guān)鍵詞] 串聯(lián)質(zhì)譜；新生兒；篩查；遺傳代謝??；氨基酸；?；鈮A

[ 中圖分類號] R722.1 [ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [ 文章編號] 2095-0616（2023）08-0051-04

遺傳代謝病（inherited metabolic disorders，IMD）以常染色體遺傳為主，由于基因突變，使得其編碼的受體、酶、膜蛋白或運(yùn)載蛋白的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生變化[1-2]，從而使生物合成造成缺陷，導(dǎo)致糖、脂肪、蛋白和微量元素代謝障礙，使得必要代謝產(chǎn)物合成不足或毒副產(chǎn)物過度堆積，是一種多臟器疾病[3-5]。IMD 臨床表現(xiàn)缺乏特異性，多見代謝紊亂、心功能異常、嘔吐、神經(jīng)異常、肝功能異常、腎功能異常，一些患兒伴皮膚和毛發(fā)顏色異常、容貌異常、眼部異常、特殊尿味、昏迷、肌張力低、酸中毒或高血氨等。該病可造成患兒嚴(yán)重的生長發(fā)育障礙和智力低下，影響神經(jīng)和消化系統(tǒng)，具有致死性，給患者及其家庭帶來了極大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。在中樞系統(tǒng)發(fā)育之前或出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀之前，如果不能給予有效治療，該病難以達(dá)到理想的治療效果[6-7]。IMD 包括氨基酸代謝異常、有機(jī)酸代謝障礙、脂肪酸代謝紊亂等，同樣的IMD 病種的表型會有較大差異，不同病種也會有相似的臨床表現(xiàn)，因此診斷有難度。隨著基因診斷技術(shù)的普及，臨床醫(yī)生對IMD 的識別能力迅速提高，迄今已發(fā)現(xiàn)1000 余種IMD，雖然單一病種的發(fā)病率不高，但總體發(fā)病率較高[8-9]。據(jù)統(tǒng)計，IMD 總體患病率已高達(dá)1/3000 ～ 1/6000[10]，是出生缺陷的重要原因。其中很多病種可以通過飲食控制和調(diào)整、藥物、移植等手段達(dá)到接近正常人的生存質(zhì)量，因此早期篩查和診斷尤為重要。

1 IMD概況

IMD 按照分子量劃分，可以分為大分子病和小分子病，其中大分子病包括線粒體病，溶酶體貯積癥等，小分子病包括氨基酸代謝障礙、有機(jī)酸代謝障礙、脂肪酸代謝異常。其中，小分子病的篩查和診斷可以通過檢測血液中氨基酸、肉堿等指標(biāo)的濃度來實現(xiàn)。目前已發(fā)現(xiàn)的IMD 種類逐漸增多，單一病種發(fā)病率不高，IMD 的發(fā)病率在全國各地區(qū)也各不相同，疾病種類也不相同，據(jù)報道[11]，氨基酸代謝異常疾病發(fā)病率為1/13 800、脂肪酸代謝異常疾病發(fā)病率為1/10 400、有機(jī)酸代謝異常發(fā)病率為1/14 700。

氨基酸代謝異常，也稱氨基酸血/ 尿癥，是因為氨基酸代謝異常而造成的一組疾病，蛋白質(zhì)代謝路徑中需要關(guān)鍵酶的作用，當(dāng)基因突變導(dǎo)致這些酶的功能發(fā)生損傷時，造成氨基酸合成和分解代謝障礙，均為常染色體隱性遺傳[12]。氨基酸代謝病通常對子宮內(nèi)胎兒的生長發(fā)育不產(chǎn)生影響，早期只表現(xiàn)出輕度的精神和運(yùn)動方面的發(fā)育遲緩，一般無體征，直到幾年后才有明顯癥狀。典型疾病包括苯丙酮尿癥、高鳥氨酸血癥、高甲硫氨酸血癥、楓糖尿病、同型半胱氨酸血癥、瓜氨酸血癥、四氫生物蝶呤缺乏癥、精氨酸酶缺乏癥等，疾病篩查實驗通過對血中氨基酸例如苯丙氨酸（phenylalanine，PHE）、瓜氨酸（citrulline，CIT）、酪氨酸（tyrosine，TYR）、鳥氨酸（ornithine，ORN）、甲硫氨酸（methionine，MET）、亮氨酸（leucine，LEU）、精氨酸（arginine，ARG）濃度測定以及比值實現(xiàn)疾病篩查。其中，苯丙酮尿癥的患病率是我國新生兒篩查疾病中患病率最高的，達(dá)1/11 144[13]。該病早期無明顯體征，但隨著患兒年齡的增長，臨床癥狀逐漸明顯，患兒智商低下，且是不可逆的，可見新生兒IMD 篩查是出生缺陷預(yù)防的重要防線[14]。

有機(jī)酸代謝異常，也稱有機(jī)酸血/ 尿癥，是由于氨基酸代謝、脂肪酸氧化、糖代謝途徑中需要的某些酶的異常缺陷，導(dǎo)致在分解代謝過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有機(jī)酸在體內(nèi)增加、蓄積，從而造成神經(jīng)系統(tǒng)及其他多器官的損害，嚴(yán)重時會表現(xiàn)出代謝性酸中毒、低血糖、高血氨等癥狀。甲基丙二酸血癥是有機(jī)酸代謝病中最常見的，其次是丙酸血癥、異戊酸血癥、戊二酸血癥Ⅰ型、3- 甲基巴豆酰輔酶A 羧化酶缺乏癥、生物素酶缺乏癥等，疾病篩查實驗可通過對標(biāo)本中氨基酸和肉堿例如MET、丙酰肉堿（propionylcarnitine，C3）、C3與乙酰肉堿（acetylcarnitine，C2）比值、異戊酰肉堿（isovalerylcarnitine，C5）、3- 羥基異戊酰肉堿（3-hydroxyisoamylcarnitine，C5-OH）等指標(biāo)篩查疾病[15]。因此及時進(jìn)行新生兒IMD 篩查對保證患兒生存質(zhì)量至關(guān)重要。

脂肪酸代謝異常，是由于多種酶的缺陷導(dǎo)致脂類在體內(nèi)合成分解、消化吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)異常的一組代謝缺陷性疾病。臨床會表現(xiàn)出人體能量代謝降低，疲乏無力、驚厥、頭暈眼花、心律失常、低血糖、發(fā)作性饑餓性意識障礙、糖尿病、腦病、肝功能損害、肌病和心肌病，高脂血癥等癥狀，嚴(yán)重者會危及生命，多見于嬰幼兒，過去常把這種臨床表現(xiàn)誤診為嬰兒猝死綜合征、Reye 綜合征[16-17]。脂肪酸代謝過程中，肉堿和脂肪酸結(jié)合形成?；鈮A，并通過線粒體膜進(jìn)行氧化供能，因此在應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行篩查時，用?；鈮A濃度作為脂肪代謝的檢測指標(biāo)。常見的脂肪酸代謝異常有原發(fā)性肉堿缺乏癥、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、短鏈酰基輔酶A 脫氫酶缺乏癥、中鏈?；o酶A 脫氫酶缺乏癥、極長鏈酰基輔酶A 缺乏癥等，疾病篩查實驗通過對標(biāo)本中?；鈮A例如游離肉堿C0，短鏈?；鈮AC2、C3、C4、C5，中鏈?；鈮AC6、C8、C10，長鏈酰基肉堿C12、C14，極長鏈?；鈮AC16、C18 等指標(biāo)濃度進(jìn)行臨床判斷。因此臨床中有必要對新生兒IMD 進(jìn)行積極的篩查工作，為疾病發(fā)現(xiàn)和及時診治提供科學(xué)依據(jù)。

2 IMD篩查國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

對IMD 早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療十分重要。但常規(guī)篩查方式，由于疾病、藥物或飲食等因素對體內(nèi)生化代謝物濃度造成影響，因此篩查結(jié)果具有很大程度的不確定性。高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能夠?qū)ρ褐卸喾N氨基酸和肉堿進(jìn)行定性和定量分析，通過氨基酸、肉堿及相應(yīng)指標(biāo)的比值，快速篩查和診斷氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸代謝異常疾病。這是一種高效率、高特異性、高敏感度的快速檢測技術(shù)。1961年，美國Guthrie 醫(yī)生測定濾紙干血片中苯丙氨酸濃度采用細(xì)菌抑制法，這種簡便且方便運(yùn)送的檢測方法可以應(yīng)用于開展大規(guī)模人群篩查[18]。至今，人們通過新生兒疾病篩查的手段來發(fā)現(xiàn)并預(yù)防IMD 的危害已有近60 年歷史。新生兒疾病篩查技術(shù)從細(xì)菌抑制法發(fā)展到酶聯(lián)免疫法、時間分辨法、熒光法，但這些檢測方法篩查效率不高，一般是一次實驗過程只能檢測一種疾病。20 世紀(jì)80 年代，電噴霧和質(zhì)譜技術(shù)能夠?qū)Χ喾N氨基酸、?；鈮A和有機(jī)酸進(jìn)行快速、高效地檢測。Millington 等[19] 很快將一次實驗檢測多種疾病的質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于新生兒疾病篩查，將疾病篩查種類擴(kuò)展到多種，使新生兒疾病篩查得到了飛快發(fā)展。早在1990 年，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)率先在美國被應(yīng)用于新生兒代謝病的篩查，目前歐美、日本、韓國、新加坡以及我國臺灣等國家和地區(qū)，也將串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)普遍用于新生兒IMD篩查[20-21]。我國于1981 年開始對先天性甲狀腺功能減退及苯丙酮尿癥的新生兒進(jìn)行疾病篩查。串聯(lián)質(zhì)譜篩查在我國大陸地區(qū)開展相對較晚，21 世紀(jì)初，我國上海和浙江地區(qū)率先將串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于新生兒IMD 檢測，在多種IMD 的篩查、診斷、治療等方面積累了寶貴的經(jīng)驗[22]。經(jīng)過多年的探索和發(fā)展，中國的新生兒疾病篩查從自發(fā)開展發(fā)展到系統(tǒng)、有序地規(guī)劃組織。隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，人們對IMD 的認(rèn)識程度越來越高，疾病被發(fā)現(xiàn)的種類也逐漸增多。隨著IMD 篩查方法敏感度的提高和治療技術(shù)手段的發(fā)展，IMD 篩查的病種由苯丙酮尿癥一種增加到幾十種，近些年在一些發(fā)達(dá)地區(qū)，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)也用來篩查X- 連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥、溶酶體貯積癥等。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展為一次實驗檢測多種疾病的模式提供了高特異性、高敏感度、高選擇性的手段。對降低患兒的出生缺陷和病死率、提高出生人口素質(zhì)，有著重要意義。我國串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展速度飛快，目前在很多地區(qū)開展了新生兒疾病篩查串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)。2018 年，中國新生兒篩查專家組在全國進(jìn)行了應(yīng)用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行新生兒IMD 篩查的調(diào)查，統(tǒng)計結(jié)果顯示總患病率在1/3153[10]，中國仍然面臨形勢嚴(yán)峻的出生缺陷預(yù)防工作。高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)必定將成為新生兒疾病篩查的重要手段，對中國提高出生人口素質(zhì)，出生缺陷防治工作有著重要意義。

3 IMD篩查結(jié)果的影響因素

新生兒疾病篩查串聯(lián)質(zhì)譜項目是指利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對新生兒濾紙干血斑中的氨基酸、肉堿及相應(yīng)比值進(jìn)行定量檢測，然后臨床醫(yī)生根據(jù)檢測物的濃度水平判斷患IMD 的風(fēng)險程度。串聯(lián)質(zhì)譜疾病篩查報告單中包含79 個項目（代謝物指標(biāo)和代謝物之間的比值），代謝物濃度和比值均有對應(yīng)的參考范圍，對于高于或低于參考范圍的濃度指標(biāo)，都被系統(tǒng)判讀為可疑陽性，在報告單中分別用↑和↓標(biāo)記。陽性率是指可疑陽性的樣本數(shù)占總樣本數(shù)的百分比。通過總結(jié)發(fā)現(xiàn)，陽性率在不同地區(qū)間存在較大差異，同一地區(qū)不同指標(biāo)陽性率也存在較大差異，同一地區(qū)同一指標(biāo)在不同時間也可能存在差異。本文體現(xiàn)了新生兒IMD 篩查指標(biāo)切值建立方法專家共識的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜篩查IMD，其結(jié)果主要有以下影響因素。

3.1 未建立自身實驗室的參考范圍

每個地區(qū)的篩查實驗室在篩查一定數(shù)量的標(biāo)本后，應(yīng)對本實驗室檢測的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，建立自己的新篩參考范圍，并定期進(jìn)行校正[23]。串聯(lián)質(zhì)譜新生兒疾病篩查項目的初篩陽性率一般較高，主要原因是對某些指標(biāo)的參考范圍設(shè)置不合適，建立本實驗室參考范圍后，初篩陽性率和指標(biāo)陽性率可大幅改善。

3.2 血片質(zhì)量

C2、MET、ARG 這三個指標(biāo)一般在溫度和濕度都高的月份，陽性率會高，主要表現(xiàn)為低于參考值范圍。如果C2 偏低會導(dǎo)致比值項目C3/C2 升高，如果C3/C2 升高，又會增加甲基丙二酸血癥的初篩陽性率。通過對送檢單位的血片質(zhì)量督查，注意血片要在室內(nèi)自然晾干，避免在高溫、高濕環(huán)境下晾干，避免陽光、爐子、暖氣等物體烘干，不得接觸有機(jī)溶劑，做到無污染、無霉變，且晾干后要置于密封袋并存儲于冰箱，2℃～ 8℃冰箱保存，運(yùn)輸過程密封低溫運(yùn)輸，采集后5 個工作日內(nèi)遞送，可降低這幾類指標(biāo)的初篩陽性率。

3.3 實驗污染或儀器污染實驗污染

和儀器污染導(dǎo)致的指標(biāo)陽性率高可以通過監(jiān)測空白孔的濃度或某些指標(biāo)的陽性率發(fā)現(xiàn)問題。比如C5DC+C6OH、C6、C8 等指標(biāo)，當(dāng)這類指標(biāo)空白孔濃度水平和樣本濃度水平升高時，可能和移液吸頭質(zhì)量、移液槽質(zhì)量等有關(guān)，更換質(zhì)量有保障的移液吸頭和移液槽后該問題即可解決。儀器污染來源包括流動相污染、管路污染、進(jìn)樣口污染、離子源污染、三重四級桿內(nèi)部污染等。其中儀器長時間未清洗維護(hù)是最常見的一種情況，可能會導(dǎo)致指標(biāo)空白孔濃度和樣本濃度水平升高，該異常情況可通過清洗三重四級桿解決。

3.4 質(zhì)控異常波動

由于實驗室環(huán)境變化、前處理內(nèi)標(biāo)工作液配制、儀器開關(guān)機(jī)后未校準(zhǔn)等原因?qū)е率覂?nèi)質(zhì)控波動幅度較大時，樣本的濃度水平也會隨之波動，從而導(dǎo)致某些指標(biāo)陽性率的異常波動。在室內(nèi)質(zhì)控異常波動時，可以通過校正RRF 值來使樣本的濃度水平保持在正常水平。

3.5 攝入藥物影響

新生兒代謝水平在剛出生后可能會不穩(wěn)定，也會受某些藥物影響。來自新生兒科等臨床科室的血片，某指標(biāo)陽性率會受一些藥物影響，例如氨基酸水平升高可能和靜滴氨基酸有關(guān)；口服左卡尼丁可導(dǎo)致?；鈮A及游離肉堿C0 水平升高；頭孢類藥物可能會導(dǎo)致C5 增高[24-25]。新生兒科樣本采集時，建議將母親及新生兒的用藥情況特殊標(biāo)注。

4 小結(jié)

綜上所述，近年來隨著高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的地區(qū)開展多種新生兒IMD的篩查工作，更多的IMD 種類被發(fā)現(xiàn)。目前我國在應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查新生兒IMD 工作中，參考值范圍差異較大，實驗室需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，建立自己的新篩參考范圍，并定期進(jìn)行校正。完善新生兒IMD 篩查工作，對IMD 進(jìn)行早發(fā)現(xiàn)、早治療，對于提高出生人口素質(zhì)具有重要意義。