零唯　楊丹　譚勇　黃鼎　林敬禎　明如宏

摘要 采用正交設計優(yōu)化胡椒屬藥用植物SCoT-PCR反應體系，并運用SCoT分子標記對7種胡椒屬藥用植物31份樣品進行遺傳多樣性研究。結果表明，胡椒屬藥用植物SCoT-PCR最佳反應體系：總體積20 μL，其中10×Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.20 mmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，引物0.4 μmol/L，模板DNA 100 ng，Taq聚合酶2.5 U。擴增總條帶數(shù)為68條，其中多態(tài)性條帶為64條，多態(tài)性比率為94.12%。31份胡椒屬藥用植物個體間聚類分析結果顯示，31份胡椒屬樣品劃分為2個類群，6個亞群。SCoT可適用于胡椒屬藥用植物遺傳多樣性研究。

關鍵詞胡椒屬；SCoT；正交優(yōu)化；遺傳多樣性

中圖分類號Q949.732.3文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0182-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.042開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Diversity Analysis of Piper Medicinal Plants Based on SCoT Markers

LING Wei YANG Dan TAN Yong et al（1.Institute of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530000;2.Guangxi Key Laboratory of Zhuang and Yao Ethnic Medicine，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530200）

AbstractThe SCoT-PCR reaction system of medicinal plants of Piper was optimized by orthogonal design，and the genetic diversity of 31 samples of 7 species of medicinal plants of Piper was studied by SCoT molecular markers.The results showed that the best SCoT-PCR reaction system of Piper was as follows： the total volume was 20 μL，of which 10 × buffer 2.0 μL，dNTPs 0.20 mmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，primer 0.4 μmmol/L，template DNA 100 ng，Taq polymerase 2.5 U.The total number of amplified bands was 68，of which 64 were polymorphic，with a polymorphism rate of 94.12%.The clustering results showed that 31 samples of Piper were divided into 2 groups and 6 subgroups.SCoT can be used to study the genetic diversity of medicinal plants of Piper.

Key wordsPiper;SCoT;Orthogonal optimization;Genetic diversity

胡椒屬（Piper）為胡椒科（Piperaceae）最大的屬之一，在全球約有2 000 多種，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］，我國有60多種，其中30多種入藥，主要產(chǎn)地為云南、廣東、廣西、海南等省區(qū)［2］。胡椒屬藥用植物具有重要的藥用價值，在民間多用作止痛、活血和抗風濕性疾病藥物［3］，現(xiàn)代研究表明其具有抗菌、抗抑郁、抗血栓等藥理作用［4-6］。除藥用外，胡椒屬藥用植物還作為調(diào)味品用于食品烹飪以及芳香性精油用于香水工業(yè)中［7-8］。由于胡椒屬藥用植物野生種類分布范圍狹小、資源稀少［9］，為有效保護和利用胡椒屬藥用植物資源，有必要對胡椒屬藥用植物遺傳多樣性進行研究。

起始密碼子多態(tài)性（start condon targeted polymorphism，SCoT）是Collard等［10］根據(jù)植物基因組ATG翻譯起始位點側翼序列的保守性而開發(fā)的一種目的基因分子標記，其具有操作簡單、引物通用性強、遺傳信息豐富、多態(tài)性好等優(yōu)點，目前已成功應用于梔子［11］、地黃［12］、秦艽［13］等藥用植物的遺傳多樣性研究。因此，該試驗運用SCoT標記技術對31份胡椒屬藥用植物樣品進行遺傳多樣性分析，挖掘胡椒屬藥用植物遺傳信息，為胡椒屬藥用植物的種質(zhì)選育和資源保護提供理論參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料該試驗采集31份胡椒屬藥用植物新鮮嫩葉為供試材料，采集樣品經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥用植物教研室戴忠華副教授鑒定，其中29份材料采自廣西各地，2份材料采自海南，樣品信息見表1。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取及質(zhì)量測定。參照天根多糖多酚提取植物基因組DNA試劑盒提取步驟對胡椒屬藥用植物DNA進行提取，將符合要求的DNA溶液稀釋至50 ng/μL，放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2單因素考察。參照尚小紅等［14］的研究，設定SCoT-PCR初始擴增反應體系：總體積20 μL，10×Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.25 mmol/L，Mg 1.5 mmol/L，引物 0.8 μmol/L，模板DNA 50 ng，Taq聚合酶1 U，剩余部分用ddHO補齊，其中DNA模板為假蔞J10，引物為SCoT 21；擴增程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。對SCoT反應體系中的dNTPs濃度、Mg濃度、引物濃度、模板DNA用量以及Taq聚合酶量進行單因素考察，每個因素設置6個梯度水平，見表2。

1.2.3正交優(yōu)化試驗。根據(jù)單因素試驗結果，設計L16（45）正交表優(yōu)化SCoT-PCR反應體系，每處理2次重復（表3）。正交試驗的反應體系以及反應程序與單因素試驗相同。

1.2.4引物篩選以及退火溫度的優(yōu)化。采用優(yōu)化后的反應體系對61條SCoT引物進行篩選，引物選用 Collard等［10］開發(fā)設計SCoT的引物。選用PCR儀的退火溫度梯度模式，設置溫度區(qū)間為引物TM值±5 ℃，對引物進行退火溫度優(yōu)化。

1.2.5SCoT-PCR擴增與數(shù)據(jù)處理。利用篩選出的引物對31份胡椒屬藥用植物進行擴增。對擴增結果進行條帶統(tǒng)計，建立0/1矩陣。利用POPGENE 3.2軟件進行分析獲得遺傳相似系數(shù)，采用NTSYS 2.10軟件對胡椒屬7個品種31份樣品進行聚類分析。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1dNTPs濃度對SCoT-PCR擴增效果的影響。如圖1所示，6條泳道均能擴增出條帶。dNTPs濃度在0.15～0.30 mmol/L，條帶清晰可辨，亮度適中；當濃度在0.35～0.40 mmol/L，條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，清晰度下降。因此選定0.15～0.30 mmol/L 為正交優(yōu)化試驗梯度水平。

2.1.2Mg濃度對SCoT-PCR擴增效果的影響。從圖2可以看出，Mg濃度在1.5～2.5 mmol/L時，條帶較為清晰，分離度較好；當Mg濃度為3.5 mmol/L時，雖擴增條帶數(shù)量多、亮度適中，但與1.5、2.0 mmol/L相比，無明顯優(yōu)勢。為了節(jié)約成本，因此選擇1.5～3.0 mmol/L為正交優(yōu)化試驗梯度水平。

2.1.3引物濃度對SCoT-PCR擴增效果的影響。從圖3可以看出，當引物濃度在0.3～0.6 μmol/L時，隨著濃度的增加，擴增條帶亮度、清晰度隨之增強；當濃度超過0.7 μmol/L時，部分條帶出現(xiàn)黏連情況，無法區(qū)分。因此選用0.3～0.6 μmol/L為正交優(yōu)化試驗梯度水平。

2.1.4模板DNA用量對SCoT-PCR擴增效果的影響。從圖4可以看出，模板DNA用量為25和150 ng時，條帶彌散、模糊；用量為50～125 ng，擴增譜帶相似，譜帶清晰且數(shù)量較多。綜合考慮，選擇50～125 ng為正交優(yōu)化試驗梯度水平。

2.1.5Taq聚合酶用量對SCoT-PCR擴增效果的影響。從圖5可以看出，當Taq聚合酶用量為0.5和3.0 U時，部分條帶存在模糊現(xiàn)象；當用量為1.0～2.5 U時，擴增條帶較為清晰，條帶帶型差異性較小。因此選擇1.0～2.5 U為正交優(yōu)化試驗梯度水平。

2.2SCoT正交試驗正交電泳結果（圖6）表明在16個組合2次重復中，所有的組合均能擴增出條帶，大小在250～2 000 bp。從圖6可以看出，16個組合對擴增結果的影響存在一定的差異。組合1和14都存在只擴增出2條條帶的情況；組合2、3、7、8、9、11、12、13、14、15、16條帶模糊；組合5、6擴增結果較好，條帶清晰，分離度、亮度適中。其中組合5的2次擴增結果較為穩(wěn)定，因此選擇組合5為SCoT-PCR最佳反應組合，SCoT-PCR最佳反應體系為10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.20 mmol/L、Mg 1.5 mmol/L、引物0.4 μmol/L、模板DNA 100 ng、Taq聚合酶2.5 U，用無菌水補足20 μL。

2.3引物篩選以及最佳退火溫度的確定依據(jù)正交優(yōu)化得到的最佳反應體系，對61條SCoT引物進行篩選試驗。對各引物擴增結果進行評價，其中有9條引物能夠擴增出清晰且多態(tài)性較好的條帶，引物信息及其最佳退火溫度見表4。

2.4SCoT擴增結果及多態(tài)性分析對31份胡椒屬藥用植物總DNA進行擴增，部分擴增圖如圖7所示。擴增結果如表5所示，9條引物擴增出68條條帶；引物SCoT 24、SCoT 45、SCoT 49擴增條帶數(shù)量最多，SCoT 61和SCoT 63最少；多態(tài)性條帶為64條，多態(tài)性比率為94.12%。

2.5遺傳相似性分析及聚類分析利用NTSYS 2.10軟件算出31份胡椒屬藥用植物的遺傳相似系數(shù)在0.37～0.91。其中親緣關系最近的2份植物分別為采自廣西中醫(yī)藥大學仙葫校區(qū)的假蔞J1與廣西民族大學相思湖校區(qū)的假蔞J2，遺傳相似系數(shù)為0.91；而親緣關系最遠的2份植物分別為廣西南寧市賓陽縣思隴鎮(zhèn)水村的風藤F2和廣西桂平市蒙圩鎮(zhèn)新陽村龍?zhí)渡降募偈VJ12，遺傳相似系數(shù)為0.37。

聚類分析結果（圖8）顯示，當遺傳相似系數(shù)0.54為閾值時，可將31份胡椒屬植物分為2個大類，其中假蔞、蓽茇、大葉蒟、苧葉蒟、胡椒聚為一類，蓽茇、風藤、山蒟聚為一類；遺傳相似系數(shù)為0.63時，大葉蒟單獨聚為一類；胡椒和苧葉蒟在遺傳相似系數(shù)為0.68時，可分為2個亞類。

3討論與結論

SCoT標記是Collard等［10］開發(fā)的一種新型基因分子標記技術，具有操作簡單、重復性好、遺傳信息豐富、多態(tài)性好等優(yōu)點，可以作為其他分子標記技術的有效補充［15］。SCoT分子標記技術已經(jīng)應用于許多藥用植物種屬的遺傳多樣性分析中。程虎印等［16］采用 SCoT 分子標記技術對陜西產(chǎn)重樓屬 6 個類群 48 份樣品進行遺傳多樣性分析，結果顯示重樓屬植物在物種水平上具有較高的遺傳多樣性。馬利奮等［17］采用SCoT分子標記對 17 個枸杞品種進行遺傳多樣性分析，聚類分析結果顯示可將17個枸杞品種分為3個群類。陳大霞等［18］采用 SCoT 分子標記分析 4 種黃連屬藥用植物的遺傳多樣性，揭示出黃連屬藥用植物具有豐富的遺傳多樣性，種間存在高度的遺傳分化。

SCoT聚類分析顯示山蒟和風藤為一類，說明這2個品種遺傳差異性小、親緣關系接近。這與蔡誠誠等［19］基于ITS序列分析的研究結果相似，該研究發(fā)現(xiàn)風藤與山蒟的同源性高達97.65%，在形態(tài)和化學成分組成上也具有較高的相似度。由于在進行植物的遺傳多樣性分析時，所用材料的品種數(shù)量、樣品數(shù)量和采集區(qū)域等因素均會對試驗結果產(chǎn)生影響。該試驗僅研究了31份胡椒屬藥用植物，在后續(xù)工作中應當進一步豐富材料來源和數(shù)量，從多個層面深入挖掘廣西胡椒屬藥用植物的遺傳信息，為胡椒屬藥用植物種質(zhì)資源保護與品種選育提供參考。

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