金達(dá)康 謝仕源 梁瑤 王柳萍 楊斌*

糖尿病患者的并發(fā)癥有糖尿病腎病、糖尿病周圍神經(jīng)病和糖尿病大血管病變等，而最嚴(yán)重的主要是糖尿病足［1-2］。在發(fā)生足部潰瘍的糖尿病患者中有超過(guò)50%會(huì)出現(xiàn)感染，而合并感染后的截肢率是未合并感染者的50-150 倍［3］。因此，對(duì)糖尿病足合并感染傷口的研究至關(guān)重要，而動(dòng)物模型的構(gòu)建是疾病研究的重要方法。Goto-Kakizaki（GK）大鼠屬于非胰島素依賴非肥胖自發(fā)Ⅱ糖尿病大鼠模型［4］。但對(duì)GK 大鼠在建立糖尿病足合并感染模型方面的研究鮮有報(bào)道。故本研究擬采用GK 大鼠和Wistar 大鼠為研究對(duì)象，建立糖尿病感染創(chuàng)面模型，觀察糖尿病大鼠感染創(chuàng)面的生物學(xué)特性，為GK 大鼠應(yīng)用于糖尿病足合并感染的治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SPF 級(jí)GK 大鼠12 只，20-22周齡，從常州文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010）購(gòu)進(jìn)，雄性SPF 級(jí)Wistar 大鼠12 只，20-22 周齡，從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006）購(gòu)進(jìn)。購(gòu)回的動(dòng)物飼養(yǎng)在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK桂2020-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，符合動(dòng)物倫理要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料PCT 和hs-CRP 試劑盒購(gòu)自上?？婆d商貿(mào)有限公司；金黃色葡萄球菌購(gòu)自廣西省微生物菌種保藏中心；高脂高糖飼料購(gòu)自南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)；α-SMA 和CD31 抗體購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糖尿病大鼠感染創(chuàng)面模型的建立 動(dòng)物的準(zhǔn)備：高脂高糖飼料飼養(yǎng)GK 大鼠和Wistar 大鼠14 天后，隨機(jī)選取非空腹時(shí)血糖大于或等于11.1 mmol/L 的10 只GK 大鼠備用，同時(shí)取10 只Wistar 大鼠備用。菌種的準(zhǔn)備：將金黃色葡萄球菌混懸液濃度調(diào)整至1-2×106CFU/mL，置于冰箱中待用。全皮層創(chuàng)面的制作及接種細(xì)菌：麻醉大鼠后退去背部毛發(fā)并消毒，切除大鼠背部邊長(zhǎng)為2 cm 的正方形皮膚，放置標(biāo)尺拍照。將40 μl 金黃色葡萄球菌懸液滴加于創(chuàng)面，覆蓋四層無(wú)菌紗布（邊長(zhǎng)為2 cm 的正方形）后，貼上3M 透明敷料，外層以繃帶環(huán)繞動(dòng)物身體包扎并用膠帶固定。

1.3.2 動(dòng)物分組及創(chuàng)面護(hù)理 動(dòng)物分組：造模后，隨機(jī)選取在D0 天創(chuàng)面金黃色葡萄球培養(yǎng)菌落數(shù)均大于1×105CFU 的GK 大鼠和Wistar 大鼠各8 只，GK 大鼠設(shè)為模型組，Wistar 大鼠設(shè)為正常組。創(chuàng)面護(hù)理：以動(dòng)物開(kāi)創(chuàng)時(shí)為第-1 天（D-1），創(chuàng)面感染細(xì)菌第一天后為第0 天（D0），護(hù)理第21 天（D21）為試驗(yàn)終點(diǎn)，在時(shí)間點(diǎn)D1、D2、D3、D5、D7、D11、D14、D17、D21 進(jìn)行敷料更換護(hù)理。在D1、D3、D7、D14 和D21 時(shí)：將創(chuàng)面取下的敷料放入100 ml的D/E 中和肉湯用于細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)；并在創(chuàng)面放置標(biāo)尺拍照。之后覆蓋10 層無(wú)菌紗布（邊長(zhǎng)為2 cm 的正方形）后同上包扎固定。在D2、D5、D11、D17 時(shí)，除不進(jìn)行創(chuàng)面敷料取菌培養(yǎng)外，其它同法操作。

1.3.3 敷料上細(xì)菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù) 震蕩裝有敷料及肉湯的PE 塑料瓶（250 rpm/min）后，吸取1 ml 肉湯，按照平板法進(jìn)行培養(yǎng)并記錄菌落數(shù)目，計(jì)算敷料上的細(xì)菌，公式為：，其中B 為敷料細(xì)菌總數(shù)，CFU；C 為適宜梯度下平板的菌落平均數(shù)，CFU；D為稀釋梯度。

1.3.4 創(chuàng)面愈合率的計(jì)算 使用ImageJ 軟件測(cè)量出每只鼠在D1、D3、D5、D7、D11、D14、D17、D21 時(shí)的創(chuàng)面面積，計(jì)算出創(chuàng)面愈合率，公式為：X=(YZ)/Y×100%，其中，X 為創(chuàng)面愈合率，%；Y 為D1 創(chuàng)面面積，mm2；Z 為各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積，mm2。

1.3.5 試驗(yàn)終點(diǎn) 在D22 天，麻醉大鼠，采集血液樣本3000 r/min 離心10 min，取血清備用；大鼠安樂(lè)死后，剪取創(chuàng)面愈合處長(zhǎng)為2 cm 的正方形皮膚，用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。

1.3.6 試劑盒測(cè)定 參照酶聯(lián)免疫分析（ELISA）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定大鼠血清中降鈣素原（PCT）和超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）的水平。

1.3.7 HE 染色觀察愈合創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)的改變皮膚組織蠟塊的制備，切片脫蠟至水，進(jìn)行常規(guī)HE 染色。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件（21.0 版本）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以（x±s）表示，用單因素方差方法（ANOVA）進(jìn)行分析，P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠感染創(chuàng)面的愈合情況見(jiàn)圖1 和2。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠感染創(chuàng)面的愈合率

圖2 大鼠感染創(chuàng)面不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合情況

2.2 大鼠感染創(chuàng)面的紗布敷料菌落數(shù)情況見(jiàn)圖3。

圖3 大鼠感染創(chuàng)面不同時(shí)間點(diǎn)的紗布敷料菌落數(shù)

2.3 大鼠血清中PCT 和hs-CRP 水平見(jiàn)圖4。

圖4 大鼠血清中PCT、hs-CRP 水平比較

2.4 愈合創(chuàng)面病理組織學(xué)檢查見(jiàn)圖5。

圖5 大鼠皮膚的HE 染色（比例尺=100 μm，100×）

3 討 論

糖尿病足潰瘍是糖尿病發(fā)展到中晚期的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，而出現(xiàn)嚴(yán)重感染后，將可能會(huì)導(dǎo)致截肢的不良后果［1-2］。創(chuàng)面愈合率是評(píng)價(jià)皮膚創(chuàng)面愈合的一個(gè)直觀的指標(biāo)［5］。在本課題中，相比于正常組，GK 大鼠感染創(chuàng)面在D3、D7、D11、D14、D17不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率均顯著減小。這提示與正常大鼠相比，GK 大鼠的創(chuàng)面較難愈合。

此外，感染是糖尿病足患者創(chuàng)面潰瘍愈合難、導(dǎo)致截肢甚至死亡的最直接原因，控制創(chuàng)面感染對(duì)于糖尿病足的治療至關(guān)重要［3］。為了觀察GK大鼠創(chuàng)面的病原菌生長(zhǎng)情況，本課題對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)面敷料的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，在D7時(shí)間點(diǎn)，模型組的敷料菌落數(shù)顯著增加。提示GK大鼠感染創(chuàng)面的抗菌能力較低。

PCT 是一種細(xì)菌感染的敏感診斷指標(biāo)，當(dāng)感染細(xì)菌后，PCT 的濃度會(huì)迅速升高［6］。hs-CRP 在自身免疫疾病和持續(xù)性炎癥中明顯升高，是一種反映機(jī)體炎性狀態(tài)的敏感指標(biāo)［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于正常組，模型組PCT 和hs-CRP 顯著增加，提示GK 大鼠感染創(chuàng)面存在炎癥反應(yīng)。

傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括凝血、炎癥、肉芽組織形成、上皮形成、膠原合成和組織重塑［8］。為了進(jìn)一步了解創(chuàng)面部位組織的再生情況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)創(chuàng)面組織進(jìn)行HE 染色，以觀察皮膚層的形態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于正常組，模型組的新生表皮明顯變薄，表皮向下凸出（表皮脊或表皮網(wǎng)）和相應(yīng)的真皮層向上突起結(jié)構(gòu)缺失，提示組織功能的恢復(fù)較差。

綜上所述，GK 糖尿病大鼠感染創(chuàng)面模型具有一定的生物學(xué)特性，其特性包括創(chuàng)面愈合延緩，創(chuàng)面細(xì)菌生長(zhǎng)增加，血液PCT 和hs-CRP 含量增加。本實(shí)驗(yàn)觀察了GK 大鼠感染創(chuàng)面的部分生物學(xué)特點(diǎn)，以期為GK 大鼠應(yīng)用于糖尿病足合并感染的治療研究提供一些基本資料。