入侵植物腫柄菊不同組織提取液對千金子的化感作用

王占娣　趙靜　陳紹娟　徐榮　史云東　賈琳　李艷萍

關(guān)鍵詞：腫柄菊；千金子；化感作用；抗氧化酶

中圖分類號(hào)：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

外來入侵植物嚴(yán)重破壞了入侵地生態(tài)和生物多樣性，給全球生態(tài)系統(tǒng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，化感作用是入侵植物成為優(yōu)勢群落的主要因素之一[1]，對自身或其他植物生長發(fā)育產(chǎn)生一定的影響?；形镔|(zhì)為植物釋放到土壤和環(huán)境中的次生代謝產(chǎn)物，能夠?qū)ζ渌参锂a(chǎn)生毒害作用，抑制周圍植物種子的萌發(fā)和幼苗的生長[2]。如龍絳雪等[3]報(bào)道入侵植物鬼針草（Bidenspilosa）和腫柄菊（Tithonia diversifolia）水提液抑制小白菜種子的萌發(fā)。楊云海等[4]報(bào)道紫莖澤蘭（Ageratina adenophora）提取液明顯抑制小麥和綠豆的生長。許多研究者還發(fā)現(xiàn)，入侵植物釋放的化感物質(zhì)除了對農(nóng)作物有抑制作用外，對雜草的生長也有抑制作用。如蔣智林等[5]報(bào)道入侵植物紫莖澤蘭（Ageratina adenophora）、小飛蓬（ Conyza canadensis ）、飛機(jī)草（ Chromolaenaodoratum）和腫柄菊對狗牙根（Cynodon dactylon）具有明顯抑制作用。陳金慧等[6]報(bào)道入侵植物五爪金龍能明顯抑制三葉草種子的萌發(fā)。由此可知，入侵植物釋放的化感物質(zhì)可用于雜草的防治?；形镔|(zhì)具有環(huán)境友好，低毒高效、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，利用化感物質(zhì)防治雜草危害已成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)雜草綠色防治和生態(tài)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[7]。

腫柄菊是一種世界性入侵雜草，為菊科多年生灌木類植物，其根系發(fā)達(dá)，繁殖力強(qiáng)，能在各類土壤上生長。腫柄菊原產(chǎn)墨西哥及中美洲地區(qū)，是一種觀賞植物，后被亞洲、非洲、北美、澳洲等70 多個(gè)國家和地區(qū)廣泛引種。20 世紀(jì)初，腫柄菊被引入我國后迅速在云南、廣東、福建、海南、香港、臺(tái)灣等地大量分布和擴(kuò)散?，F(xiàn)已覆蓋云南省12 個(gè)市（州），71 個(gè)縣（區(qū)），擴(kuò)散面積達(dá)184.212 km2，占云南土地面積的47%[8]。2019年腫柄菊被列為云南省Ⅰ級惡性入侵雜草。2021年陳劍等[9]報(bào)道，腫柄菊在云南還存在較大的入侵風(fēng)險(xiǎn)。CHUKWUKA 等[10]報(bào)道因腫柄菊繁殖速度快、生長迅速、植株高度等原因，迫使尼日利亞部分農(nóng)民放棄耕地?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，腫柄菊具有較強(qiáng)的化感作用，其釋放的化感物質(zhì)對其他植物產(chǎn)生毒害作用，抑制多種植物種子的萌發(fā)和幼苗的生長。到目前為止，發(fā)現(xiàn)腫柄菊對田間10 余種雜草具有較強(qiáng)的化感作用[5， 11-12]，如田學(xué)軍等[13]報(bào)道腫柄菊葉片的蒸餾水提取液能抑制鬼針草種子的萌發(fā)和幼苗的生長，SUZUKI 等[14]報(bào)道腫柄菊的甲醇提取液抑制多花黑麥草（Lolium multiflorumLam.）、Phleum pretense （L.）和Echinochloacrusgalli （L.）雜草的生長，而未見有文獻(xiàn)報(bào)道腫柄菊對千金子的化感作用。

千金子[Leptochloa chinensis （L） Nees]為一年生禾本科雜草，是世界性水田中常見的惡性雜草，可導(dǎo)致水稻產(chǎn)量降低37.8%～39.22%[15-16]。目前千金子的防治以農(nóng)藥防治為主，由于化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，造成千金子對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了很強(qiáng)的抗藥性[17]，而且許多化學(xué)農(nóng)藥嚴(yán)重污染水體、大氣、土壤等，并通過食物鏈進(jìn)入人體危害人類健康。因此尋找千金子的生態(tài)綠色防治技術(shù)越來越受到社會(huì)各界的重視。

本研究以腫柄菊為供體植物，以千金子為受體植物，采用不同極性溶劑提取腫柄菊，研究腫柄菊提取液對千金子種子萌發(fā)和生長的影響，并采用GC-MS 鑒定腫柄菊提取液中化學(xué)成分，為千金子的綠色防治奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為腫柄菊化感物質(zhì)在雜草防治方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

腫柄菊和千金子采集于玉溪師范學(xué)院校園內(nèi)（23°19′N；101°16′E），海拔約為1800 m，年平均氣溫為17.4～23.8℃，年平均降水量為670～2412 mm，屬中亞熱帶濕潤冷冬高原季風(fēng)氣候。選取顆粒飽滿的千金子種子，將其放在蒸餾水中浸泡，收集沉降在水底的種子，用0.2%高錳酸鉀溶液浸泡10 min 消毒，之后用蒸餾水沖洗5 次，備用。

1.2 方法

1.2.1 腫柄菊提取液的制備 采集到的腫柄菊根、莖、葉自然晾干，粉碎過20 目篩，分別準(zhǔn)確稱取15 g，利用索氏提取器，根據(jù)溶劑極性由小到大依次加入100 mL 石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水，加熱提取，提取溫度分別為：80℃（石油醚）、85℃（乙酸乙酯）、85℃（無水乙醇）、100℃（蒸餾水）。待索氏提取器側(cè)管內(nèi)溶液色澤變淡，收集各溶劑提取液。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，干燥，得到干膏。

稱取1 g 干膏，加入0.5 mL 吐溫-80（蒸餾水提取液制備的干膏除外）混合均勻，加入蒸餾水分別稀釋10 倍和100 倍，備用。

1.2.2 腫柄菊提取液的鑒定 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）鑒定腫柄菊提取液中化學(xué)成分。檢測條件為GC：進(jìn)樣量1.0 μL；分流比20∶1；進(jìn)樣溫度250℃；程序升溫：初始溫度40℃，保持2 min；以5℃/min 升溫至260℃，保持10 min。MS：傳輸線溫度250℃；離子源溫度250℃；掃描線：Tic（全掃描）；柱子：Ei 比–5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；離子源70 eV；掃描時(shí)間和GC 時(shí)間一致，掃描范圍33～550 m/z。

1.2.3 千金子發(fā)芽及生長效應(yīng)實(shí)驗(yàn) 采用培養(yǎng)皿濾紙培養(yǎng)法[6]。將滅菌的千金子種子放于已滅菌且鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，分別加入10 mL 稀釋10 倍和100 倍的提取液，以加入等量的吐溫–80水溶液的培養(yǎng)皿為對照。每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50 粒種子。在25℃，光照條件為L∶D=12 h∶12 h 下培養(yǎng)，每天定時(shí)補(bǔ)充等量的提取液，直至對照組不再萌發(fā)，測定其發(fā)芽率。發(fā)芽后7 d 測定各處理組幼苗株高、根長和地上部分鮮重。

1.2.4 酶活性實(shí)驗(yàn) 酶粗提液的制備： 參照DHINDSA[17]的方法，稱取0.5 g 培養(yǎng)15 d 幼苗根上部位，加入3 mL 磷酸緩沖液（pH 7.0）和少許石英砂，冰浴中研磨勻漿，于4℃，3000 r/min，離心10 min，取上清液，備用。

SOD 酶活性測定：采用核黃素-NBT 法測定[17]，試管中加入1.5 mL 50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH7.8 ）、13.0 mL 14.5 mmol/L 蛋氨酸、0.1 mL2.25 mmol/L NBT、0.1 mL 3 μmol/L EDTA-Na2、0.1 mL 22.6 mmol/L 核黃素和50 μL 酶粗提液，光照下反應(yīng)20 min，560 nm 處測定吸光度。

CAT 活性的測定：采用紫外吸收法測定[18]，試管中加入50 μL 酶粗提液、2.9 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8），25℃水浴中預(yù)熱5 min 后加入50 μL H₂O₂啟動(dòng)反應(yīng)，240 nm處測定吸光度。CAT 活性計(jì)算公式如下：

式中，ΔA₂₄₀為240 nm 波長處的吸光度；ε為H₂O₂在240 nm 處的毫摩爾吸光系數(shù)，即42l mmoL/cm；T 為酶促反應(yīng)時(shí)間，即3 min；V_t為反應(yīng)液的總體積，即3 mL；V₁為酶液的總體積，即5 mL；V₂為測定時(shí)所用酶液的體積，即0.05 mL；ω 為雜草的鮮重，g。

POD 活性測定：采用愈創(chuàng)木酚法[18]。吸取備用液（100 mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液、5 mL 愈創(chuàng)木酚和1 mL 30%H₂O₂）3 mL 于試管中，加入酶提取液0.02 mL，迅速搖勻后倒入1 cm 的比色皿中，以未加酶提取液的備用液作為空白對照，470 nm 波長處，測定3 min 內(nèi)吸光度變化值，取線性變化部分，計(jì)算1 min 吸光度變化值（ΔA₄₇₀）。

POD 酶活性計(jì)算公式為：POD 酶活性[μg/（g·min）]=ΔA₄₇₀×Ｖ１V1/（ωV2）式中，ΔA₄₇₀為1 min 吸光度變化值；V₁為酶提取液總量，mL；V₂為測定時(shí)酶液用量，mL；ω 為樣品鮮重，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，利用SAS9.4 軟件單因素方程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 腫柄菊提取液對千金子種子萌發(fā)的影響

腫柄菊根、莖和葉的乙酸乙酯和無水乙醇提取液均能明顯抑制千金子種子萌發(fā)。3 個(gè)部位提取液對千金子發(fā)芽率的抑制效果依次為葉>莖>根，其中腫柄菊的無水乙醇提取液抑制效果最為明顯。腫柄菊葉的無水乙醇提取物稀釋倍數(shù)為10倍時(shí)，其處理的千金子發(fā)芽率為0（圖1）。

2.2 腫柄菊提取液對千金子生長的影響

2.2.1 對千金子鮮重的影響 腫柄菊提取液對千金子鮮重具有明顯的抑制作用，其抑制強(qiáng)度由大到小依次為：腫柄菊無水乙醇提取液>腫柄菊石油醚提取液≈腫柄菊乙酸乙酯提取液>腫柄菊蒸餾水提取液。隨著給藥濃度稀釋倍數(shù)的增加，腫柄菊不同溶劑提取液對千金子鮮重的抑制作用降低。提取液稀釋10 倍時(shí)，腫柄菊根、莖和葉的石油醚、乙酸乙酯和無水乙醇提取液處理的千金子鮮重明顯低于CK 處理組，其中，腫柄菊葉的不同溶劑提取物對千金子鮮重的抑制作用最為明顯（圖2）。

2.2.2 對千金子株高和根長的影響 提取液稀釋10 倍時(shí)，腫柄菊根、莖、葉的乙酸乙酯和無水乙醇提取液均能明顯抑制千金子的根長和株高的生長（圖3，圖4）。腫柄菊不同組織的蒸餾水提取液對千金子根長和株高作用效果存在差異。其中，腫柄菊根的蒸餾水提取液促進(jìn)千金子株高和根長的生長，莖的蒸餾水提取液抑制千金子株高和根長的生長，葉的蒸餾水提取液對千金子株高和根長的影響與CK 差異不顯著。提取液稀釋100 倍時(shí)，根的蒸餾水提取液促進(jìn)千金子株高和根長的生長，根的石油醚提取液和乙酸乙酯提取液抑制千金子株高的生長，而對根長作用不明顯；莖的蒸餾水提取液、乙酸乙酯提取液和無水乙醇提取液明顯抑制千金子根長和株高的生長，莖的石油醚提取液對千金子根長和株高作用不明顯；葉的乙酸乙酯提取液明顯抑制千金子株高的生長，葉的石油醚提取液和無水乙醇提取液明顯抑制千金子根長的生長。

2.3 腫柄菊提取液對千金子酶活性的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，腫柄菊根、莖和葉的乙酸乙酯和無水乙醇提取液對千金子發(fā)芽率和生長效應(yīng)影響較明顯，因此，進(jìn)一步測定腫柄菊根、莖和葉的乙酸乙酯提取液和無水乙醇提取液對千金子CAT、POD 和SOD 酶的作用。結(jié)果顯示：腫柄菊不同組織提取液對3 種酶的作用存在明顯差異，其中，腫柄菊根、莖和葉的乙酸乙酯提取液，葉和根的無水乙醇提取液能明顯抑制千金子SOD 酶活性，而莖的無水乙醇提取液促進(jìn)SOD酶活性（圖5A）。腫柄菊莖的無水乙醇提取液能明顯抑制千金子CAT 酶的活性，根的乙酸乙酯提取液促進(jìn)千金子CAT 酶的活性，其他處理液對千金子CAT 酶活性的作用與CK 差異不顯著（圖5B）。腫柄菊莖的無水乙醇提取液和葉的乙酸乙酯提取液明顯促進(jìn)POD 酶的活性，而根的乙酸乙酯提取液能明顯抑制POD 酶活性（圖5C）。

2.4 腫柄菊提取液的化合物鑒定

結(jié)合發(fā)芽實(shí)驗(yàn)、生長效應(yīng)實(shí)驗(yàn)和酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用GC-MS 鑒定腫柄菊莖和葉的無水乙醇提取液和乙酸乙酯提取液的化學(xué)成分。結(jié)果顯示，腫柄菊莖的乙酸乙酯提取液中含有萜類（1、2）、內(nèi)酯類（3）和酚類（4），其中，α-蒎烯含量最高，為4.828%。腫柄菊莖的無水乙醇提取液中包括8種化合物，分別為酚類（1、7）、酮類（2）、酰胺類（3）、酯類（4、8）、烴類（5、6）。其中，酚類成分中的2，5-二乙?；?6-羥基苯并呋喃含量最高，為10.79%。腫柄菊葉的乙酸乙酯提取液中含有8 種化學(xué)成分，主要為萜類（1、3、8）、酯類（2、4、5、6、7），其含量最高的為萜類成分，即植醇，其含量為14.68%。腫柄菊葉的無水乙醇提取液中含有酯類（3、5、6、7）、烴類（1、2）、萜類（4、8）、酚類（9）、萘醌類（10），其中，萜類成分含量較高。在萜類成分中，二十碳炔含量最高，其值為20.614%，其次為植醇，其含量為7.994%（表1）。

3 討論

化感作用是外來入侵植物成為優(yōu)勢群落的主要因素之一[6]。植物的葉、果實(shí)、莖和根是植物釋放化感物質(zhì)的主要部位，其通過淋溶、凋零物、揮發(fā)和根系分泌物等方式釋放化感物質(zhì)[19]。這些化感物質(zhì)通過作用于植物種子和幼苗，影響周圍植物物種的分布[20]。如蔣智林等[21]報(bào)道紫莖澤蘭、小飛蓬、飛機(jī)草和腫柄菊等4 種植物葉的水提液能明顯抑制狗牙根種子萌發(fā)。梁曉華等[22]報(bào)道，腫柄菊的根、莖和葉水提液能明顯抑制玉米、水稻、油菜、豌豆、綠豆的發(fā)芽及生長。王麗等[11]報(bào)道腫柄菊莖葉水提液能明顯抑制水田稗草種子萌發(fā)和幼苗生長。本研究發(fā)現(xiàn)，腫柄菊根、莖和葉的無水乙醇提取液和乙酸乙酯提取液對千金子種子的萌發(fā)和幼苗生長具有明顯的抑制作用。這與MIRANDA 等[23]報(bào)道的腫柄菊不同組織對禾本科雜草稗草（Echinochloa crusgalli L.）和臂形草[Urochloa decumbens （Stapf） R.D. Webster]的研究結(jié)果相同。

植物在遭受外界干旱、水淹、冷凍和農(nóng)藥脅迫等逆境時(shí)，其體內(nèi)積累過量的過氧化氫（H₂O₂）、超氧陰離子（O^2–）和羥自由基（-OH）等活性氧成分（ROS），ROS 積累過多會(huì)對植物產(chǎn)生嚴(yán)重傷害，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化，加速植物的衰老，甚至死亡[24-25]。通過酶促系統(tǒng)清除，可延緩植物衰老[26]。超氧化歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）是植物抗氧化系統(tǒng)中的主要酶，這3 種酶通過協(xié)同作用維持植物體內(nèi)的自由基含量，使其保持穩(wěn)態(tài)水平，防止由于自由基引起的植物生理生化上的改變。其中，SOD 是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，其將O^2-歧化H₂O₂和O₂，可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞[27]。CAT 將剩余H₂O₂催化為H₂O 和O₂[26]。POD 是酚類化合物的重要氧化酶，在有酚類化合物聚合成木質(zhì)素的過程中具有重要作用，使細(xì)胞壁增厚，提高組織的抗脅迫能力[28]。如左應(yīng)萍等[29]報(bào)道蛇床子微乳劑、氟吡菌酰胺懸浮劑和腈菌唑乳油可以提高煙草SOD 和CAT 酶活性，防治煙草白粉病。張瑜瑜等[30]報(bào)道，外源水楊酸處理采摘后的藍(lán)莓能提高SOD 和POD 酶活性，減緩自由基的含量，增加藍(lán)莓保質(zhì)期。本研究表明，腫柄菊的根、葉的無水乙醇和乙酸乙酯提取液能降低SOD 酶活性，莖的乙酸乙酯提取液和無水乙醇提取液降低SOD酶和CAT 酶活性，根的乙酸乙酯提取液能降低POD 酶活性。因此，千金子細(xì)胞清除腫柄菊根、莖和葉提取液所產(chǎn)生的自由基的能力降低，導(dǎo)致幼苗生長受到抑制，是腫柄菊提取液對千金子產(chǎn)生防治效果的重要因素。

植物次生代謝物質(zhì)是植物發(fā)揮化感作用的主要成分，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，具有化感作用的物質(zhì)有10 多萬種，包括萜類、酚類、糖和糖苷類、生物堿和非蛋白質(zhì)氨基酸類等14 種，其中酚類、萜類和低分子的有機(jī)酸是最為常見的化感物質(zhì)[2]。2015 年，MIRANDA 等[23]報(bào)道腫柄菊根、莖、葉的乙酸乙酯提取液中的倍半萜內(nèi)酯類成分1β-methoxydiversifolin， tagitinin A 和tagitinin C 是腫柄菊抑制稗草和臂形草生長的活性成分。本研究采用GC-MS 分析腫柄菊莖、葉的乙酸乙酯和無水乙醇提取液中化合物發(fā)現(xiàn)，腫柄菊提取液中含有萜類、酚類、酰胺類、酯類及烴類。其中，萜類和酚類成分含量較高。萜類成分主要為α-蒎烯和植醇，酚類成分主要為2，5-二乙?；?6-羥基苯并呋喃和維生素E。陳金慧等[6]報(bào)道α-蒎烯是五爪金龍對三葉鬼針草產(chǎn)生化感作用的活性成分之一。AL-ROWAILY 等[31]報(bào)道來自沙特阿拉伯和印度的鹿角菊（Calotropis procera）釋放的揮發(fā)油能抑制鬼針草（Bidens ilosa）的生長，其揮發(fā)油均以萜類成分為主，在這些萜類中均含有植醇。李春英等[32]報(bào)道茼麻揮發(fā)油中的萜類成分對小麥、玉米和大豆的萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用，其中植醇在茼麻萜類中含量最高。由此推知，植醇可能對植物生長具有一定的化感作用。維生素E是植物自我修復(fù)的主要成分，其能清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的自由基，對植物具有保護(hù)作用[33]。由此推測，腫柄菊中的萜類成分（α-蒎烯和植醇）和酚類成分（2，5-二乙?；?6-羥基苯并呋喃）是腫柄菊對千金子產(chǎn)生化感作用的活性成分，對此還需進(jìn)一步驗(yàn)證。