劉芳 歐德淵 萬文華
摘要:高致病性豬藍(lán)耳病發(fā)病率高,傳播速度快,一旦發(fā)病會給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅。撲爾敏作為 H1受體拮抗劑,抗組胺作用持久,具有明顯的中樞抑制作用,西咪替丁是一種可選擇性 H2受體拮抗劑。為了研究這兩種組胺受體拮抗劑對高致病性藍(lán)耳病肺炎中 IL-1和 TNF-a 含量的影響,本研究建立了仔豬實(shí)驗(yàn)?zāi)P?,測定了不同組別豬只 IL-1和 TNF-a 的含量,結(jié)果表明,陽性組、撲爾敏組和西咪替丁組 HP-PRRS 患豬主要炎性因子 IL-1、TNF-α極顯著高于陰性組,但陽性組、撲爾敏組、西咪替丁組差異不顯著,表明組胺 H1R拮抗劑撲爾敏和組胺 H2R拮抗劑西咪替丁對 HP-PRRS 患豬肺臟主要炎性因子 IL-1、TNF-α無影響,撲爾敏緩解 HP-PRRS 仔豬肺炎與肺臟中 IL-1、 TNF-α無明顯的關(guān)聯(lián)。
關(guān)鍵詞:高致病性藍(lán)耳病;撲爾敏;西咪替丁;IL-1;TNF-α
以藍(lán)耳病病毒基因組非結(jié)構(gòu)蛋白?Nsp2編碼區(qū)缺少30個氨基酸為特征的豬高致病性藍(lán)耳?。℉ighly pathogenic por? cine reproductive and respiratory syndrome ,HP -PRRS ),傳播速度快,死亡率高,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
藍(lán)耳病病毒感染豬只后,能刺激產(chǎn)生輔助性、殺傷性 T 細(xì)胞,還可刺激釋放多種單核細(xì)胞因子,如 IL-1、IL -6、 IL -8、TNF -a、IFN-β、IFN-γ等等。其中, 白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1, IL -1) 由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成、分泌產(chǎn)生,與相應(yīng)高親和力受體結(jié)合后,可直接作用于體溫調(diào)節(jié)中樞,使豬只發(fā)熱,促進(jìn)巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞的招募與活化,使血管擴(kuò)張,進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng),當(dāng)肺臟損傷或受病原微生物侵襲后,肺泡巨噬細(xì)胞能通過分泌細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等作用,HP -PRRS 自然感染豬血清中的IL-1含量顯著高于正常對照組[1]。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor , TNF )是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀況時(shí)均可刺激 TNF-a 表達(dá)增加。TNF-α是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子,在炎癥局部組織和血清中表達(dá)水平上升,具有刺激巨噬細(xì)胞,趨化嗜中性粒細(xì)胞等作用[2]。受藍(lán)耳病病毒感染的患豬外周血中的 TNF-a 表達(dá)水平顯著升高[3],由此可見,HP -PRRS 肺臟 IL-1、TNF-a 的含量能作為判斷患豬肺炎發(fā)生的主要依據(jù)之一。
一、材料
(一) 主要試劑
高致病性藍(lán)耳病病毒為貴州分離株 GZKB 株,由貴州省動物疫病研究室惠贈。豬 IL-1和 TNF-α ELISA 檢測試劑盒,購至大連寶生物公司。
(二) 主要儀器
全自動酶標(biāo)儀( ELX808), BioTek Instruments ,Inc。
二、方法
(一) 模型建立
從貴州省貴陽市某養(yǎng)殖戶購買了沒有注射藍(lán)耳病疫苗的30日齡三元雜交公豬,共計(jì)20頭,篩選的體重范圍為8.9~11kg ,隨機(jī)平均分為四個組,每個組5頭,即陰性對照組、陽性對照組、撲爾敏組、西咪替丁組等4個組。其中陽性組、撲爾敏組、西咪替丁組仔豬同一時(shí)間肌肉注射 PRRSV (106TCID50)2mL/頭,撲爾敏組、西咪替丁組于注射病毒前1d 開始,每日相同時(shí)間段分別肌肉注射撲爾敏1.5mL/頭、西咪替丁1.5mL/頭,陰性組為每日同一時(shí)間段肌肉注射生理鹽水2mL/頭。
(二) 肺樣采集與處理
人工感染藍(lán)耳病病毒第10d , 陰性組體況正常, 陽性組、撲爾敏組、西咪替丁組仔豬有明顯的臨床癥狀,采取頸靜脈放血的方法處死20頭實(shí)驗(yàn)仔豬,取新鮮肺樣立即放于液氮中冷凍固定。稱取固定重量的肺樣,用蒸餾水按相同稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋,研磨后離心取上清液測定肺臟 IL-1和TNF-α。
(三)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
按 ELISA 試劑盒說明書操作,建立肺臟 IL-1和 TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線,具體步驟如下。
第一, 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋。 IL -1的稀釋濃度依次為:25pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、400 pg/mL; TNF-α稀釋濃度依次為:7.5ng/L 、15 ng/L 、30 ng/L、60 ng/L 、120 ng/L 。第二,加樣。首先設(shè)空白對照孔(空白孔中不加樣品、酶標(biāo)試劑,其他步驟相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔。加標(biāo)準(zhǔn)品樣50μL 于酶標(biāo)包被板上,加樣時(shí)需將樣品加于酶標(biāo)板孔的底部,且加樣時(shí)盡量不觸及孔壁,放于微量振蕩器上輕輕混勻。第三,溫育。采用封板膜封板,并置于37℃下溫育30min 。第四,配液。使用蒸餾水30倍稀釋試劑盒中的30倍濃縮洗滌液,備用。第五,洗滌。輕輕揭去封板膜棄液體,甩干,將洗滌液加滿每孔,靜置30s,棄液體、拍干,重復(fù)5次。第六,加酶。除空白孔外,其余每孔加入50μL 酶標(biāo)試劑。第七,溫育、洗滌。操作分別同第三、第五。第八,顯色。每孔先加50μL 顯色劑A,再加50μL 顯色劑 B,于微量振蕩器上輕輕震蕩混勻, 置于37℃下避光顯色15min。第九,終止。每孔加50μL終止液,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。第十,測定。使用酶標(biāo)儀將空白孔調(diào)零作對照,測量各孔450nm波長下的吸光度( OD值)。需在加終止液終止反應(yīng)后的15min 內(nèi)測定 OD值。
(四)肺臟樣品檢測
標(biāo)準(zhǔn)曲線建立成功后,按 ELISA 試劑盒說明書操作,檢測各組仔豬肺臟 IL -1和 TNF-α含量,具體步驟為:首先設(shè)空白對照孔(空白孔中不加樣品、酶標(biāo)試劑,其 他步驟相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。準(zhǔn)確加50μL 標(biāo)準(zhǔn)品樣于酶標(biāo)包被板上,先加40μL 樣品稀釋液于待測樣品孔中,然后加10μL 待測樣品(樣品的稀釋度是5倍)。加樣品于酶標(biāo)板孔底,注意盡量不碰觸孔壁,置于微量振蕩器上輕輕震蕩混勻。余下步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線建立步驟的第三至第十。
(五)結(jié)果判定與數(shù)據(jù)分析
計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與對應(yīng)OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程,將樣品的 OD值代入方程式中,可獲得被測樣品的濃度,乘以樣品的稀釋倍數(shù)后為被測樣品的實(shí)際濃度,最后統(tǒng)計(jì)各組仔豬肺臟IL-1和TNF-α的含量,并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
三、結(jié)果
(一) IL-1和 TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線
采用酶聯(lián)免疫分析方法,按豬 IL-1和 TNF-αELISA試劑盒說明書操作要求,倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品,用 ELISA法測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品 A450后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1、圖2),得出 IL-1倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)濃度與 A450的關(guān)系公式為 y=0.0085x-0.0771,相關(guān)系數(shù)為0.9921,TNF-α倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)濃度與 A450的關(guān)系公式為 y=0.0043x-0.0645,相關(guān)系數(shù)為0.9949,相關(guān)系數(shù)均接近1,公式較可靠。
(二) 各組仔豬肺臟 IL-1含量
結(jié)果如表1所示,人工感染病毒組仔豬肺臟 IL-1極顯著高于陰性組( P<0.01),陽性組、撲爾敏組和西咪替丁組之間差異不顯著,三組中,撲爾敏組 IL-1含量最低。
(三)各組仔豬肺臟 TNF-α含量
結(jié)果如表2所示,人工感染病毒組仔豬肺臟 TNF-α極顯著高于陰性組( P<0.01),陽性組、撲爾敏組和西咪替丁組之間差異不顯著,這與仔豬肺臟 IL-1含量變化相似,三組中,撲爾敏組 TNF-α含量最高,西咪替丁組 TNF-α含量最低。
四、討論與小結(jié)
(一) 肺炎與 IL-1和 TNF-α表達(dá)的關(guān)系
在細(xì)胞因子研究中,致炎因子主要包括 IL-l及 TNF-α等,在疾病感染早期含量較高,對疾病的發(fā)展程度有指示作用。本研究中,使用組胺受體拮抗劑后測定 IL-1和 TNF-α含量,有助于探索組胺受體拮抗劑對 HP- PRRS 患豬肺臟炎癥的影響,對防治藍(lán)耳病具有一定意義。
(二) 兩種組胺受體拮抗劑對 HP-PRRS患豬肺臟 IL-1的影響
IL-1是免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的基本要素和致熱原[4],本實(shí)驗(yàn)中人工感染病毒組仔豬 IL-1異常升高,陽性組、撲爾敏組和西咪替丁組分別增高了2.1倍、1.8倍、2.0倍,極顯著高于陰性組,且陽性組、撲爾敏組、西咪替丁組仔豬均發(fā)生肺炎病變,說明在 HP- PRRS早期,IL-1介導(dǎo)了肺部炎癥的病理過程,但撲爾敏組、西咪替丁組的 IL-1較陽性組差異不顯著,且實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合開展的仔豬肺臟病理學(xué)評分,撲爾敏組評分最低,說明撲爾敏緩解 HP-PRRS仔豬肺炎與肺臟中 IL-1的分泌和作用無明顯的關(guān)聯(lián)。
(三)兩種組胺受體拮抗劑對 HP- PRRS 患豬肺臟 TNF-a 的影響
本實(shí)驗(yàn)中人工感染病毒組肺臟 TNF-α含量極顯著高于陰性組,與報(bào)道的肺氣虛性肺氣腫模型組肺組織 TNF-a較陰性組極顯著增高相似[5],可能是藍(lán)耳病病毒通過刺激肺泡巨噬細(xì)胞釋放 TNF- a,使肺組織中 TNF-a 的 mRNA表達(dá)水平升高,但正常情況下血液中含 TNF-a 的水平較低,說明 TNF-α介導(dǎo)了 HP- PRRS仔豬肺炎的病變。但也有資料表明 PRRSV感染初期引起 TNF-a轉(zhuǎn)錄輕微上調(diào),到感染后期轉(zhuǎn)錄又受到輕微抑制[6]; 體外單獨(dú)感染 PRRSV 后 PAM TNF-a轉(zhuǎn)錄下調(diào),這些可能與病毒毒株或檢測組織的不同有關(guān)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn),過量的炎性因子的表達(dá)與HP-PRRS患豬的肺炎有密切關(guān)系,但實(shí)驗(yàn)中撲爾敏組、西咪替丁組 TNF-α含量較陽性組差異不顯著,表明組胺 H1R拮抗劑撲爾敏和組胺 H2R拮抗劑西咪替丁對炎性因子 TNF-α的釋放無影響,且撲爾敏組仔豬肺臟病理學(xué)評分最低,說明撲爾敏緩解 HP- PRRS仔豬肺炎與肺臟中 TNF-α無明顯的關(guān)聯(lián)。
(四)小結(jié)
陽性組、撲爾敏組、西敏替丁組 HP-PRRS患豬主要炎性因子 IL-1、TNF-α極顯著高于陰性組,但陽性組、撲爾敏組、西敏替丁組三組之間差異均不顯著,表明組胺 H1R拮抗劑撲爾敏和組胺 H2R拮抗劑西咪替丁對 HP-PRRS患豬肺臟主要炎性因子 IL -1、TNF-α無影響,撲爾敏緩解HP -PRRS 仔豬肺炎與肺臟中 IL -1、TNF-α無明顯的關(guān)聯(lián)。
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作者簡介:劉芳(1985-),女,貴州清鎮(zhèn)人,碩士,獸醫(yī)師,研究方向:基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)。
(責(zé)任編輯馮會利)