王夏茵，岳寶森，張煒華，田歡，楊帥，王巧玲，李愛婷，職媛，趙鋒（西安市中醫(yī)醫(yī)院，西安 710000）

天麻，又名赤箭，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-2]，為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖[3]，是藥食兩用、名貴中藥材[4]。隨著人工栽培技術(shù)的發(fā)展，天麻在我國多個(gè)省份均有分布，但不同產(chǎn)地之間氣候條件、品種基原及加工方式的不同導(dǎo)致其存在質(zhì)量差異。為了保證天麻藥材成分及療效的穩(wěn)定性，對(duì)不同產(chǎn)地天麻的質(zhì)量進(jìn)行控制顯得尤為重要。

目前，指紋圖譜被廣泛用于天麻的質(zhì)量控制[5-7]，化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)可對(duì)指紋圖譜信息進(jìn)行數(shù)字化識(shí)別與處理，進(jìn)一步評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量[8-9]。研究者前期通過2020年版《中國藥典》中指紋圖譜方法，對(duì)來自7個(gè)主要產(chǎn)地的21批天麻樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該方法下湖南、湖北天麻色譜峰分離度較差。湖南地區(qū)是我國天麻主要產(chǎn)區(qū)之一[10-11]，研究者查閱資料發(fā)現(xiàn)湖南天麻少見報(bào)道。本研究通過HPLC建立不同產(chǎn)地天麻指紋圖譜，測(cè)定天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量，并結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)對(duì)包括湖南、湖北天麻在內(nèi)的7個(gè)主要產(chǎn)地21批天麻樣品進(jìn)行分析，為天麻質(zhì)量控制及綜合評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TDZ5-BP臺(tái)式高速離心機(jī)（陜西德祥實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；ZA305AS電子天平（十萬分之一天平，上海贊維衡器有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（配置Lab Solutions色譜工作站，日本島津公司）；CQ-150A-DST超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)儀器廠）。

1.2 試藥

對(duì)照品天麻素（批號(hào)：110807-202010，含量：95.5%）、對(duì)羥基苯甲醇（批號(hào)：111970-201702，含量：99.4%）（中國食品藥品檢定研究院）；對(duì)照品巴利森苷A（批號(hào)：03F-RTY-12-0，含量：98.65%）、巴利森苷B（批號(hào)：19J-PGH-22-1，含量：99.49%）、巴利森苷C（批號(hào)：19J-GTR-19-2，含量：97%）、巴利森苷E（批號(hào)：19J-FTR-20-1，含量：97%）（Panphy Chemicals Corporation）；乙腈為色譜純（Grace Chemical Technology Co.，Ltd.）；21批天麻藥材經(jīng)西安市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科岳寶森主任鑒定，為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖，藥材來源具體信息見表1。

表1 天麻藥材來源信息Tab 1 Source information of Gastrodia elata Bl.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsustain C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～15 min，2%～5%A；15～25 min，5%～12%A；25～45 min，12%～18%A；45～60 min，18%～25%A；60～62 min，25%～95%A）；流速1 mL·min－1；進(jìn)樣量3 μL；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

2.2 不同產(chǎn)地天麻指紋圖譜的建立

2.2.1 供試品溶液制備 精密稱定天麻藥材粉末（過3號(hào)篩）約1 g，置于具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，放涼后，50%甲醇補(bǔ)足減失重量，離心，上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，加50%甲醇配制成含巴利森苷C 0.88 mg·mL－1、天麻素 1.98 mg·mL－1、巴利森苷A 1.80 mg·mL－1、對(duì)羥基苯甲醇 1.70 mg·mL－1、巴利森苷E 1.76 mg·mL－1、巴利森苷B 2.04 mg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取S9號(hào)供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以天麻素為參照峰，其余5個(gè)共有特征峰（8、11、13、14、16號(hào)峰）相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.11%～0.26%，相對(duì)峰面積RSD值為0.74%～2.8%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S9號(hào)供試品溶液，分別于0、1、2、6、12、24 h進(jìn)樣，以天麻素為參照峰，其余5個(gè)共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.13%～0.33%，相對(duì)峰面積RSD值為0.29%～3.2%，表明24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備S9號(hào)供試品溶液6份，進(jìn)樣分析，以天麻素為參照峰，其余5個(gè)共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為0.19%～0.30%，相對(duì)峰面積RSD值為0.76%～3.5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 指紋圖譜建立及分析 取21批天麻樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）進(jìn)行分析，以S9為參照，設(shè)時(shí)間窗寬度0.5 min，采用中位數(shù)法計(jì)算，生成對(duì)照指紋圖譜，選定16個(gè)共有峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配后得到21批天麻樣品指紋圖譜疊加圖，見圖1[12-14]。相似度評(píng)價(jià)作為中藥指紋圖譜的重要評(píng)價(jià)手段，可反映多個(gè)樣本間化學(xué)成分差異及離散程度[15-16]，通過相似度分析，得出21批樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度為0.758～0.995，見表2，說明不同批次天麻存在一定差異[14]。

圖1 不同產(chǎn)地天麻指紋圖譜疊加圖Fig 1 Fingerprint chromatograms of Gastrodia elata Bl. from different regions

表2 不同產(chǎn)地天麻相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity of Gastrodia elata Bl. from different regions

通過對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)其中6個(gè)特征峰，分別為7號(hào)峰（天麻素）、8號(hào)峰（對(duì)羥基苯甲醇）、11號(hào)峰（巴利森苷E）、13號(hào)峰（巴利森苷B）、14號(hào)峰（巴利森苷C）、16號(hào)峰（巴利森苷A），見圖2。

圖2 混合對(duì)照品（A）與天麻樣品（B）的色譜圖Fig 2 Chromatogram of mixed reference substances（A）and Gastrodia elata Bl.（B）

2.3 不同產(chǎn)地天麻中天麻素及對(duì)羥基苯甲醇的含量測(cè)定

2.3.1 供試品溶液制備 同“2.2.1”項(xiàng)下方法操作。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱定天麻素12 mg、對(duì)羥基苯甲醇6 mg置于10 mL量瓶中，加入50%甲醇充分溶解定容，得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加50%甲醇配制成含天麻素24、72、120、240、360、720 μg·mL－1，對(duì)羥基苯甲醇6、24、48、60、120、240 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察 取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立回歸方程，結(jié)果天麻素的回歸方程為Y＝5.639×103X－2.151×104（r＝0.9990），對(duì)羥基苯甲醇的回歸方程為Y＝1.300×104X－3.492×104（r＝0.9989）。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取S9號(hào)供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積RSD值分別為0.63%和3.1%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S9號(hào)供試品溶液，分別于0、1、2、6、12、24 h進(jìn)樣，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積RSD值分別為1.0%和3.5%，表明24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備S9號(hào)供試品溶液6份，進(jìn)樣分析，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積RSD值分別為2.0%和4.3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定S9號(hào)樣品約1 g，分別按已知含量的80%、100%、120%加入天麻素4.5、5.5、7.0 mg，對(duì)羥基苯甲醇儲(chǔ)備液0.8、1.0、1.2 mL，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各3份，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果天麻素和對(duì)羥基苯甲醇加樣回收率分別在103.81%～104.59%和100.84%～104.42%，RSD值分別在0.96%～3.9%和1.0%～4.0%，表明此方法準(zhǔn)確可行。

2.3.8 含量測(cè)定 取S1～S21號(hào)樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各2份，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地天麻的含量測(cè)定(n＝2，%)Tab 3 Content of Gastrodia elata Bl. from different regions (n＝2，%)

2.4 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.4.1 聚類分析（CA） 將21批天麻指紋圖譜中共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 25.0分析軟件進(jìn)行CA分析[17]。當(dāng)分類距離為15時(shí)，可將21批天麻樣品歸為兩類，其中湖南、湖北天麻（S16～S21）歸為一類，其他產(chǎn)地天麻（S1～S15）歸為一類，結(jié)果見圖3。

圖3 不同產(chǎn)地天麻CA結(jié)果Fig 3 Cluster analysis of Gastrodia elata Bl. from different regions

2.4.2 主成分分析（PCA） 將21批天麻指紋圖譜中共有峰峰面積導(dǎo)入軟件SIMCA14.1中，建立PCA模型，累計(jì)貢獻(xiàn)率R2X＝0.593，表明模型可較好解釋原始變量，得分見圖4[17]。結(jié)果顯示21批天麻樣品基本分為兩類，與CA結(jié)果一致。

圖4 不同產(chǎn)地天麻PCA得分圖Fig 4 PCA score plot of Gastrodia elata Bl. from different regions

2.4.3 偏最小二乘法分析（OPLS-DA） 將21批天麻指紋圖譜中共有峰峰面積導(dǎo)入軟件SIMCA14.1中，建立OPLS-DA模型[18]，模型解釋率參數(shù)R2X＝0.534，R2Y＝0.924，模型預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2＝0.826，表明模型解釋與預(yù)測(cè)能力良好，OPLS-DA模型結(jié)果與CA、PCA結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了分析結(jié)果的可靠性，見圖5。提取16個(gè)共有峰變量重要性投影（VIP）值并進(jìn)行排序，見圖6，結(jié)果顯示峰6、16（PA）、13（PB）、14（PC）、11（PE）、1、7（天麻素）、12的VIP值均＞1，表示這8個(gè)成分可作為評(píng)價(jià)湖南、湖北天麻與其他產(chǎn)地天麻的差異性標(biāo)記成分[19]。

圖5 不同產(chǎn)地天麻OPLS-DA得分圖Fig 5 OPLS-DA score plot of Gastrodia elata Bl. from different regions

圖6 不同產(chǎn)地天麻差異標(biāo)志物VIP圖Fig 6 VIP diagram of Gastrodia elata Bl. from different regions

3 討論

3.1 方法學(xué)的優(yōu)化

對(duì)提取溶劑（50%甲醇、50%乙醇、60%甲醇、60%乙醇）、提取時(shí)間（15、30、45 min）、檢測(cè)波長(zhǎng)（220、254、270 nm）及流動(dòng)相（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸）進(jìn)行考察，以分離度、共有峰面積、峰形及提取效率為考察指標(biāo)，最終確定本文提取條件（以50%甲醇為溶劑，超聲提取30 min）及色譜條件（波長(zhǎng)220 nm下，以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相）。

3.2 指紋圖譜的建立與分析

前期試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，湖南、湖北地區(qū)天麻6號(hào)峰面積較大，使用藥典方法無法有效分離6號(hào)峰和7號(hào)峰（天麻素）。本研究建立了天麻HPLC指紋圖譜，對(duì)包括湖南、湖北在內(nèi)的7個(gè)主要產(chǎn)地21批天麻樣品分離度良好，標(biāo)定16個(gè)共有指紋峰，并指認(rèn)了其中6個(gè)成分。通過相似度分析，21批天麻樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度為0.758～0.995，其中云南、貴州、陜西、安徽、四川產(chǎn)天麻與對(duì)照指紋圖譜相似度較高（0.947～0.995），湖南、湖北產(chǎn)天麻與對(duì)照指紋圖譜相似度較低（0.758～0.917）。

3.3 含量測(cè)定的分析

2020年版《中國藥典》以天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的總量對(duì)天麻進(jìn)行含量測(cè)定，本研究中21批樣品中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇總量為0.21%～0.80%，其中云南、貴州地區(qū)天麻不同批次間穩(wěn)定性好、總含量高，分別為0.58%、0.62%，湖南、湖北地區(qū)總含量較其他產(chǎn)地偏低，分別為0.24%、0.33%。

3.4 化學(xué)模式識(shí)別分析

通過CA、PCA可將21批天麻分為湖南、湖北天麻與其他產(chǎn)地天麻兩類。通過OPLS-DA篩選出8個(gè)差異標(biāo)記物，包含天麻素（6號(hào)峰）、巴利森苷類成分（16號(hào)峰巴利森苷A、13號(hào)峰巴利森苷B、14號(hào)峰巴利森苷C、11號(hào)峰巴利森苷E）及3個(gè)未知成分（6、1、12號(hào)峰）。天麻素和巴利森苷類成分是天麻的主要活性成分，受地域環(huán)境、種植技術(shù)等多因素影響，2020年版《中國藥典》新增天麻素和巴利森苷類成分建立指紋圖譜對(duì)天麻進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究發(fā)現(xiàn)，天麻素和巴利森苷類成分可用于區(qū)分湖南、湖北天麻與其他產(chǎn)地天麻的差異，是天麻重要質(zhì)控成分。查閱文獻(xiàn)，關(guān)于湖南、湖北天麻與其他產(chǎn)地天麻的綜合評(píng)價(jià)少見報(bào)道，包永睿等[20]通過CA將10個(gè)不同產(chǎn)地天麻分為三類，區(qū)別于貴州、安徽等地，湖北、四川天麻歸為一類；林昕等[5]將12個(gè)不同產(chǎn)地天麻分為三類，區(qū)別于陜西、貴州等地，湖北、西藏和遼寧歸為一類，與本研究結(jié)果一致?？紤]到本研究納入單個(gè)產(chǎn)地樣本量較少，僅3個(gè)批次，故通過本研究可認(rèn)為湖南、湖北天麻與其他產(chǎn)地天麻可能存在一定差異，但后期仍需要大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。