龍眼UBP 家族全基因組鑒定及其在外源脅迫下的表達分析

童寧，張春渝，許小瓊，陳曉慧，申序，賴鐘雄

（福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002）

泛素（ubiquitin）是一種普遍存在于真核生物中的由76 個氨基酸組成的多肽［1］。通過一系列酶將泛素分子與目標(biāo)蛋白的特異性相結(jié)合，并引導(dǎo)其對蛋白酶體進行降解的過程稱為泛素化。泛素化是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾方式，也是一種細胞內(nèi)信號［2］，在細胞分裂、自噬、消亡、DNA 修復(fù)、蛋白質(zhì)降解等生物學(xué)過程中具有重要調(diào)控作用。通過蛋白酶特異地從與泛素分子結(jié)合的蛋白質(zhì)底物中切割泛素分子的過程稱為去泛素化，這些蛋白酶即為去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）。迄今為止，人類基因組中已被識別的去泛素化酶有100 余種，根據(jù)其氨基酸序列與保守結(jié)構(gòu)域的不同，可分成6個家族：泛素特異蛋白酶（ubiquitin-specific protease，UBP，在哺乳動物中被稱為USP）、泛素羧基末端水解酶（UCH）、卵巢腫瘤蛋白酶（OTU）、Machado-Joseph結(jié)構(gòu)域蛋白酶（MJD）、MINDY 蛋白酶（MINDY）和JAMM 結(jié)構(gòu)域蛋白酶（JAMM）。其中前五大家族屬于半胱氨酸蛋白酶，最后一個屬于鋅金屬蛋白酶［3］。UBP家族成員數(shù)量最多，超過50個，且結(jié)構(gòu)多樣化［4］。

UBP 家族成員具有2 個相似的催化殘基三聯(lián)體，每個三聯(lián)體包含2 個短且高度保守的半胱氨酸盒和組氨酸盒，是催化位點的關(guān)鍵部分（半胱氨酸盒中的Cys，組氨酸盒中的His 和Asp/Asn）［5］。半胱氨酸盒與組氨酸盒的區(qū)域被稱為泛素羧基末端水解酶（UCH）結(jié)構(gòu)域，其在空間和結(jié)構(gòu)上比較保守［6］，但不同成員UCH 結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列不同，其氨基酸種類、數(shù)量的差異均較大［7］。目前對UBP基因的分析主要集中在單個基因的生物功能。如發(fā)現(xiàn)擬南芥中AtUBP1 和AtUBP2 基因可能與體內(nèi)異常氨基酸代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)［8］，AtUBP12 參與了生物鐘反饋調(diào)節(jié)，且可調(diào)控開花時間［9］；哺乳動物中USP1 參與了胃癌的早期階段轉(zhuǎn)化［10］，USP24 與細胞凋亡、細胞周期和DNA 的損傷修復(fù)有關(guān)［11］；USP13 在小鼠單核巨噬細胞破骨分化中起重要作用［12］。已對UBP 家族進行全基因組鑒定的有擬南芥（27 個成員）［6］、毛竹（48 個成員）［13］、水稻（21 個成員）［14］等，尚未見對龍眼進行全基因組鑒定的報道。

龍眼（Dimocarpus longan Lour.），熱帶亞熱帶常綠經(jīng)濟型果樹，因其假種皮富含多種磷質(zhì)、氨基酸、維生素、類黃酮等［15］，具有降血糖、補血健腦等作用［16］。外界環(huán)境以及自身的遺傳特性和基因的表達調(diào)控對龍眼胚胎發(fā)育具有重要影響，而龍眼的胚胎發(fā)育與樹體的生長發(fā)育和果實的品質(zhì)產(chǎn)量相關(guān)。目前已知UBP 廣泛存在于真核生物，能通過去泛素化作用調(diào)節(jié)生物的多種代謝過程，且已發(fā)現(xiàn)該家族部分成員參與胚胎生長發(fā)育，甚至?xí)?dǎo)致胚胎死亡，但關(guān)于龍眼DlUBP 基因在胚胎發(fā)育中的作用尚未見報道。因此，對DlUBP 基因進行分析有助于進一步了解DlUBP 家族在龍眼胚胎發(fā)育中的作用。通過對DlUBP 家族全基因組的鑒定，分析其基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、啟動子順式作用元件、進化關(guān)系，并分析龍眼體胚中DlUBP 基因在不同時間梯度的脫落酸處理和干旱脅迫處理下的表達情況，以期為UBP 基因家族在龍眼體胚或其他植物生長發(fā)育調(diào)控的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 數(shù)據(jù)來源

第3 代龍眼基因組數(shù)據(jù)庫，龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，擬南芥（Arabidopsis thaliana）UBP 家族的基因序列和氨基酸序列下載于Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），甜橙（Citrus sinensis）、水稻（Oryza sativa）UBP 家族的基因序列和氨基酸序列下載于phytozome 數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.html）。

1.1.2 實驗材料

龍眼體胚發(fā)生過程中的胚性愈傷組織（embryonic callu，EC）來源于福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所。參照賴鐘雄［17］的培養(yǎng)方法，以EC 為起始材料獲得不完全胚性緊實結(jié)構(gòu)（incomplete compact pro-embrogenic cultures，ICpEC）和球形胚（globular embryos，GE）。選擇培養(yǎng)20 d 的生長發(fā)育良好的龍眼胚性愈傷組織，分別接種于100 μmol·L-1脫落酸（abscisic acid，ABA）、10%聚乙二醇（PEG 6000）的MS 液體培養(yǎng)基中，于25 ℃、110 r·min-1黑暗條件下?lián)u床培養(yǎng)0，4，8，12 h，收樣，液氮速凍后-80 ℃封存于冰箱，用于后續(xù)qPCR 定量分析。

參照Tripue（Transgen，China）試劑盒說明書提取龍眼在EC、ICpEC、GE 3 個階段以及經(jīng)ABA 和PEG6000 處理的RNA，再參照PrimerScript RT Reagent Kit（TaKaRa）試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成qPCR 所需的cDNA。

1.2 方 法

1.2.1 DlUBP 基因的鑒定

DlUBP 基因在染色體上的定位：利用NCBI BLAST 在線網(wǎng)站，將龍眼基因組數(shù)據(jù)庫與模式植物擬南芥AtUBP 的氨基酸序列進行同源比對，對DlUBP 家族成員進行篩選，獲得18條DlUBP 候選序列。結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（conserved domains database，CDD）和SMART 對蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析，確定龍眼UBP 基因組中存在18 條DlUBP 序列。參考擬南芥的命名方式，命名DlUBP基因。最后根據(jù)龍眼基因組注釋信息和DlUBP基因的ID，用TBtools軟件在染色體上繪制DlUBP基因的位置分布。

DlUBP 基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)分析：基于龍眼genome 文件，用TBtools 分析18 個DlUBP 基因的結(jié)構(gòu)；從ExPASy 中查詢18 個DlUBP 基因的蛋白質(zhì)等電點、分子質(zhì)量和氨基酸數(shù)等，并列表分析；通過MEME 在線軟件分析DlUBP 的保守基序，并下載XML 格式的分析結(jié)果，用TBtools 軟件進行可視化繪圖分析。根據(jù)DlUBP 基因的氨基酸序列，用TBtools 軟件中的Batch SMART 進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測以及可視化分析。

UBP 家族進化樹的構(gòu)建：先采用MEGA5.05 軟件中的鄰近法（neighbor-joining method）單獨對DlUBP 家族進行進化分析，然后采用相同的方法構(gòu)建龍眼、擬南芥、水稻、甜橙4 個物種的UBP 家族氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，自展系數(shù)法（Boot strap）設(shè)置1 000 次重復(fù)檢驗。保存nwk 格式的進化樹文件，使用iTOL 在線網(wǎng)站（https：//itol.embl.de）對進化樹進行上色編輯。

DlUBP 基因啟動子分析：利用DlUBP 基因組序列和基因結(jié)構(gòu)注釋信息文件，經(jīng)TBtools 軟件提取獲得18 條CDS 上游堿基對為2 000 bp 的DlUBP 序列，采用PlantCARE 在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對DlUBP基因啟動子特征以及順式作用元件的功能進行預(yù)測分析，再用Excel 軟件分類整理獲得的數(shù)據(jù)，最后用TBtools軟件對順式作用元件進行可視化繪圖。

1.2.2 DlUBP 基因在龍眼不同體胚發(fā)生階段的表達分析

從龍眼基因組數(shù)據(jù)庫中提取18 個DlUBP 基因在龍眼體胚發(fā)生過程中EC、ICpEC、GE 3 個階段的特異表達每千個堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片（fragments per kilobases per million mapped fragments，F(xiàn)PKM），提交至TBtools 軟件進行熱圖繪制，并分析DlUBP 基因在不同體胚發(fā)生階段的特異性表達情況。

1.2.3 DlUBP 基因表達量的qPCR 分析

為了解DlUBP 基因在脫落酸處理和干旱脅迫處理下的表達情況，將DlUBP2、DlUBP8-1、DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP17、DlUBP19、DlUBP22-2 和DlUBP23 等8 個基因的CDS 序列通過 Primer premier 6 設(shè)計正向引物和反向引物，再通過引物檢測網(wǎng)站Beacon Designer Free Edition（http：//www.premierbiosoft.com）識別得到的引物，選出符合要求的基因，并收集其引物，見表1。20 μL qPCR 體系包括10 μL HieffqPCR SYBRGreen Master Mix（Yeasen，Shanghai，China）染料，7.4 μL dd H2O，0.8 μL 正向引物和0.8 μL 反向引物，1 μL cDNA 模板。以elF-4a 為內(nèi)參基因，用Roche LightCycler 480 實時熒光定量PCR 儀（Roche Applied Science，Switzerland）檢測DlUBP 基因在不同時間梯度的脫落酸處理和干旱脅迫處理下的表達量，采用2-ΔΔCT方法計算DlUBP 基因的相對表達量，用Excel 軟件整理分析，并繪制柱形圖。

表1 實時熒光定量 PCR 引物Table 1 Real-time fluorescent quantitative PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 DlUBP 全基因組鑒定與蛋白特性分析

通過與擬南芥基因組進行比對，利用CDD 和SMART 檢測蛋白的結(jié)構(gòu)域，共獲得18 個DlUBP 基因。通過對龍眼與擬南芥、水稻和甜橙的UBP 家族成員的系統(tǒng)進化分析，參照擬南芥家族成員的命名方法，將DlUBP 家族成員分別命名為DlUBP2、DlUBP4、DlUBP5、DlUBP8-1、DlUBP8-2、DlUBP9、DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP12-3、DlUBP16、DlUBP17、DlUBP19、DlUBP21、DlUBP22-1、DlUBP22-2、DlUBP23、DlUBP25、DlUBP26。

通過分析DlUBP 全基因組的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)UBP 家族氨基酸數(shù)為369～1 117 個，相差較大，除 DlUBP2、DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP16 外，其余基因的氨基酸數(shù)在1 000 個以下；分子質(zhì)量為42.11～130.80 ku；等電點為5.14～9.32，見表2。

表2 DlUBP 全基因組蛋白質(zhì)特性Table 2 Characteristics of DlUBP gene family protein

2.2 DlUBP 基因染色體定位分析

根據(jù)染色體定位分析結(jié)果（圖1），18 個DlUBP基因不均勻地分布在10 條染色體上。龍眼基因組已組裝的染色體共有15 條，其中第2，3，8，10，11 號染色體上不存在DlUBP 基因。定位在第1 號染色體上的DlUBP 基因最多，有4 個，定位在第5，6，13，15 號染色體上的DlUBP 基因各有1 個，其余5 條染色體上分別有2 個DlUBP 基因。第12 號染色體上的2 個DlUBP 基因的物理位置較接近，但超過了100 kb，HUANG 等［18］指出，染色體上物理位置不超過100 kb 的2 個及以上的同源基因為串聯(lián)重復(fù)基因，因此各DlUBP 基因不存在串聯(lián)重復(fù)的情況。

圖1 DlUBP 基因在染色體上的定位Fig.1 Location of DlUBP gene on chromosome

2.3 DlUBP 基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)分析

18 個DlUBP 基因的內(nèi)含子數(shù)、外顯子數(shù)及其位置如圖2 所示，可知，DlUBP 基因內(nèi)含子數(shù)為2～31個，其中DlUBP12-1 基因的內(nèi)含子數(shù)最多，有31 個，其次是DlUBP12-2，有30個，DlUBP2和DlUBP22-2基因的內(nèi)含子數(shù)最少，均為2個，大部分DlUBP基因的內(nèi)含子數(shù)在20 以內(nèi)。此外，DlUBP 基因的長度存在較大差異，DlUBP8-2 基因最長，DlUBP22-2 基因最短，這可能由內(nèi)含子數(shù)差異較大引起，也可能導(dǎo)致各DlUBP基因之間的功能有所區(qū)別。

使用MEME 在線軟件，搜索到25 個motif（圖2）。從圖2 中可以看出，motif 1、motif 2、motif 3、motif 5、motif 8 出現(xiàn)的頻率較高，出現(xiàn)在18 個DlUBP 基因中，說明這5 個motif 在DlUBP 家族中較保守，其中motif 2 在DlUBP8-1 基因中出現(xiàn)了2次。其次是motif 4 和motif 6，出現(xiàn)在17 個基因中，特別是motif 6 在DlUBP9 基因中連續(xù)出現(xiàn)了2 次。motif 12 和motif 18 出現(xiàn)在大多數(shù)基因中。此外，在同一個小分支上，保守基序的種類和排列基本一致，這可能與其功能的保守性有關(guān)。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，18 個DlUBP 基因均含有一個UCH 結(jié)構(gòu)域，這體現(xiàn)了UCH 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的保守性。除共有的UCH 結(jié)構(gòu)域，部分DlUBP 基因存在特異的保守區(qū)，如DlUBP2 和DlUBP22-2 均有一個ZnF-UBP 鋅指結(jié)構(gòu)，DlUBP12-1、DlUBP12-2 和DlUBP12-3 均有1 個 MATH 結(jié)構(gòu)域，DlUBP16、DlUBP17 和DlUBP19 均有1 個zf-MYND 鋅指結(jié)構(gòu)，DlUBP5、DlUBP9 和DlUBP26 均有1 個DUSP 結(jié)構(gòu)域。此外，同屬于一個亞家族的成員在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的種類和分布上比較相似，表明龍眼UBP 基因各亞家族擁有的生物學(xué)功能不同。

圖3 DlUBP 家族成員的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 DlUBP family protein conserved domain analysis

2.4 植物UBP 家族成員的系統(tǒng)進化樹分析

基于龍眼、擬南芥、水稻、甜橙的氨基酸序列，用MEGA5.05 軟件構(gòu)建了4 個物種的68 條氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，如圖4 所示。參考擬南芥中AtUBP 基因的分類方式［8］，采用SAMRT 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，根據(jù)基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異，將DlUBP 基因分為10 組：G1 的成員為DlUBP2，G2的成員為 DlUBP4，G3 的成員為 DlUBP5、DlUBP8-1、DlUBP8-2、DlUBP9，G5 的成員為DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP12-3，G7 的成員為DlUBP16、DlUBP17、DlUBP19，G8 的成員為DlUBP21，G9 的成員為DlUBP22-1、DlUBP22-2，G10 的成員為 DlUBP23，G12 的成員為DlUBP25，G13 的成員為DlUBP26。其中，G2 成員中包含1 個ZnF-UBP 鋅指結(jié)構(gòu)，G5 成員中包含1 個MATH 結(jié)構(gòu)域，G7 成員中包含1 個zf-MYND鋅指結(jié)構(gòu)，G3 部分成員中以及G13 成員中包含1個DUSP 結(jié)構(gòu)域。

2.5 DlUBP 基因啟動子分析

使用PlantCARE 在線網(wǎng)站對DlUBP 基因啟動子序列中可能存在的順式作用元件進行預(yù)測分析，結(jié)果如圖5 所示?？芍?，18 個DlUBP 基因的啟動子序列均含CAAT-box 和TATA-box，且CAATbox 的數(shù)量比TATA-box 的多，說明DlUBP 基因都能夠正常轉(zhuǎn)錄。18 個DlUBP 基因均含有較多的光響應(yīng)元件，大部分DlUBP 基因具有厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件，響應(yīng)脫落酸和茉莉酸甲酯激素應(yīng)答；50%以上的基因具有干旱脅迫下MYB 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點和防御與應(yīng)激響應(yīng)元件；44%左右的基因具有低溫響應(yīng)元件、光脅迫下MYB 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點和MYBHv1 結(jié)合位點；33%左右的基因響應(yīng)生長素、水楊酸和赤霉素應(yīng)答；少數(shù)基因具有胚乳表達、缺氧特異性誘導(dǎo)響應(yīng)元件和參與類黃酮生物合成基因調(diào)控的MYB 結(jié)合位點，參與晝夜控制和玉米醇溶蛋白的代謝調(diào)控；與種子特異調(diào)控有關(guān)的響應(yīng)元件只存在于DlUBP5 基因中。由此可知，DlUBP 基因具有較多光響應(yīng)、激素響應(yīng)元件以及與植物生長發(fā)育有關(guān)的其他順勢作用元件，而且不同的基因具有的順式作用元件的種類及數(shù)量不同，表明DlUBP 基因可能在胚胎發(fā)育、種子生長、植株生長發(fā)育和抗逆等過程中有重要作用，且不同的DlUBP 基因所起的作用不同。

圖5 DlUBP 基因啟動子順式作用元件Fig.5 Promoter cis-acting elements of DlUBP gene

2.6 DlUBP 基因在龍眼體胚發(fā)育過程中的表達分析

利用龍眼基因組數(shù)據(jù)庫中DlUBP 基因在龍眼體胚發(fā)生過程中EC、ICpEC、GE 3 個階段的特異表達FPKM 值繪制聚類分析熱圖（圖6），發(fā)現(xiàn)DlUBP基因在體胚發(fā)生階段的表達模式共有6 種：（1）在EC 和GE 階段表達下調(diào)，在ICpEC 階段上調(diào)（DlUBP2、DlUBP5、DlUBP8-1、DlUBP8-2、DlUBP9、DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP17、DlUBP26）；（2）在ICpEC 和GE 階段上調(diào)，在EC 階段下調(diào)（DlUBP22-2、DlUBP19、DlUBP23）；（3）在EC 和ICpEC 階段上調(diào)，在GE 階段下調(diào)（DlUBP12-3、DlUBP21、DlUBP25）；（4）在EC 階段上調(diào)，在ICpEC 和GE 階段下調(diào)（DlUBP22-1）；（5）在EC 和GE 階段上調(diào)，在ICpEC 階段下調(diào)（DlUBP4）；（6）在EC 和 ICpEC 階段下調(diào)，在 GE 階段上調(diào)（DlUBP16）。整體來看，多數(shù)DlUBP 基因的表達在EC 階段和GE 階段下調(diào)，在ICpEC 階段上調(diào)，推測DlUBP 基因可能有助于龍眼胚性愈傷組織的分化。

圖6 DlUBP 基因在龍眼體胚發(fā)生各階段的特異表達Fig.6 The specific expression of different stages of somatic embryogenesis in the DlUBP gene

2.7 DlUBP 基因在脫落酸和干旱脅迫處理下的表達量分析

DlUBP 基因啟動子中含有較多的脫落酸順式作用元件，為探究DlUBP 基因在脫落酸處理下的表達情況，篩選含脫落酸響應(yīng)元件的6 個基因：DlUBP2、DlUBP8-1、DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP17、DlUBP19，采用qPCR 方法分析它們在不同時間梯度（0，4，8，12 h）脫落酸處理下的表達量，如圖7 所示?？芍珼lUBP2、DlUBP12-1、DlUBP17基因在脫落酸處理下表達量先升高后降低，處理4 h時表達量達最高；DlUBP8-1 基因在脫落酸處理下的表達量明顯降低，均低于0 h 對照組；DlUBP19 基因的表達量隨脫落酸處理時間的增加逐漸升高，在處理12 h 時表達量急劇升高；DlUBP12-2 基因的表達量在脫落酸處理4 h 時無明顯變化，在處理8 h 達到最高，然后顯著下降，在處理12 h 時最低，且低于0 h 對照組。綜上所述，脫落酸能影響DlUBP 基因的表達，且多數(shù)DlUBP 基因的表達量在處理4 h 時較高，在處理12 h 時最低，猜測脫落酸處理時間較長會抑制多數(shù)DlUBP 基因的表達。

圖7 6 個DlUBP 基因家族成員在不同脫落酸處理時間下的表達情況Fig.7 Expression of six DlUBP gene family members under different abscisic acid treatment times

為探索DlUBP 基因在干旱脅迫處理下的表達水平，從18 個DlUBP 基因中隨機挑取含干旱脅迫響應(yīng)元件的6 個基因：DlUBP2、DlUBP8-1、DlUBP12-2、DlUBP17、DlUBP22-2、DlUBP23，用qPCR 方法分析它們在10%聚乙二醇（PEG6000）滲透調(diào)節(jié)劑模擬的不同時間梯度（0，4，8，12 h）干旱脅迫處理下的表達量，結(jié)果如圖8 所示?？芍?，隨著處理時間的增加，DlUBP2、DlUBP22-2、DlUBP23 基因的表達量先降低后升高；DlUBP12-2 基因的表達量先降低再升高再降低，在處理8 h 時表達量最高。4 個基因的表達量均在處理4 h 時達最低水平，低于0 h 對照組，推測干旱脅迫對這4 個基因的表達產(chǎn)生影響，且在處理4 h 時抑制其表達，在處理8 和12 h時促進其表達（DlUBP23 的表達在處理8 h 時被抑制）。此外，在干旱脅迫處理下DlUBP17 的表達量均高于0 h 對照組，但在處理8 h 后即使增加處理時間，表達量的升高幅度也非常小，推測干旱脅迫對DlUBP17 的表達有促進作用，且表達量可能在處理8 h 后逐漸趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，干旱脅迫處理影響DlUBP 基因的表達，且處理時間不同，對表達量的影響亦不同。

圖8 6 個DlUBP 基因家族成員在不同干旱脅迫處理時間下的表達情況Fig.8 Expression of six DlUBP gene family members under different drought stress treatment times

3 討論

3.1 DlUBP 基因的功能可能具有多樣性

去泛素化酶廣泛存在于真核生物體內(nèi)，它們在細胞內(nèi)分工明確，同時相互協(xié)調(diào)，共同維護細胞內(nèi)泛素化水平的穩(wěn)定［19］。目前對于去泛素化酶功能的研究尚不夠深入，已知的生理功能主要有激素調(diào)控與應(yīng)激反應(yīng)［20］、腫瘤與癌癥的發(fā)生［21］等，在植物體內(nèi)主要調(diào)控植物的形態(tài)發(fā)生、免疫應(yīng)激和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和程序性細胞死亡等，在動物體內(nèi)參與癌癥與腫瘤［22］的發(fā)生、神經(jīng)和生殖細胞分化、DNA 損傷修復(fù)等［23］。泛素特異蛋白酶是去泛素化酶的一種，其生物學(xué)功能與去泛素化酶相似，可調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和對環(huán)境響應(yīng)，并介導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。參照擬南芥的基因分類鑒定方法，對龍眼、擬南芥、甜橙、水稻4 個物種進行進化樹分析，將基因分為14類。龍眼中有18 個DlUBP 基因，擬南芥中有27 個AtUBP 基因，由于龍眼與擬南芥的親緣關(guān)系較近，猜測其生物學(xué)功能也可能較相似［24］。DOELLING等［25］的研究指出，缺乏AtUBP14 基因會阻止擬南芥胚胎的發(fā)育甚至導(dǎo)致胚胎死亡，AtUBP13 基因在調(diào)節(jié)根分生組織發(fā)育中起關(guān)鍵作用［26］。此外，AtUBP2 可能參與了體內(nèi)異常氨基酸的代謝，AtUBP12 能調(diào)節(jié)開花時間，AtUBP26 在種子發(fā)育過程和花期中起重要調(diào)控作用等。龍眼中也有相同的UBP 基因，且其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相似程度較高，如DlUBP2 和AtUBP2 都有1 個ZnF-UBP 鋅指結(jié)構(gòu)，DlUBP12 和AtUBP12 都有1 個MATH 結(jié)構(gòu)域，DlUBP26 和AtUBP26 都有1 個DUSP 結(jié)構(gòu)域，因此推測龍眼中的UBP 基因有類似的功能。LEE等［27］通過分析小鼠胚胎階段的Northern 印跡發(fā)現(xiàn)，USP22 在多數(shù)發(fā)育的小鼠胚胎中普遍表達，且在各種成人組織和胚胎早期均有廣泛表達，于是猜測其與胚胎發(fā)生有關(guān)。不僅如此，分析發(fā)現(xiàn)，DlUBP基因啟動子含有20 余種順式作用元件，包括光響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、缺氧特異性誘導(dǎo)元件、干旱脅迫響應(yīng)元件、多種激素響應(yīng)元件等，且不同的DlUBP 基因所含的順式元件的種類和數(shù)量不同。DlUBP12-1 和DlUBP12-3 基因含有參與類黃酮生物合成基因調(diào)控的MYB 結(jié)合位點，表明DlUBP 基因可能參與龍眼體胚發(fā)生過程中花青素、黃酮類化合物等次生代謝產(chǎn)物的合成［28］；DlUBP5 基因含有細胞周期調(diào)控元件，猜測DlUBP基因可能與龍眼體胚細胞周期的調(diào)控有關(guān)?？傊?，18 個DlUBP 基因在功能上既有特異性也有互補性，共同維護龍眼正常生長發(fā)育并提高其抵御逆境脅迫的能力。

3.2 DlUBP 基因可能參與脫落酸的調(diào)控并對干旱脅迫有應(yīng)激反應(yīng)

組織特異性和應(yīng)激反應(yīng)基因表達情況主要取決于啟動子中的順式元件，順式元件與多種應(yīng)激反應(yīng)基因密切相關(guān)。分析發(fā)現(xiàn)，DlUBP 基因啟動子含有多種植物激素的響應(yīng)元件，如脫落酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件等，這表明龍眼中的DlUBP 基因可能在多種激素脅迫響應(yīng)中起作用。MOON 等［13］指出，毛竹中含有與脫落酸對應(yīng)的順式元件，同時證明了有些PeUBP 基因具有較高的脫落酸敏感性，推測PeUBP 基因在植物發(fā)育和脫落酸脅迫響應(yīng)中發(fā)揮了作用。在本研究中，隨著脫落酸處理時間的增加，6 個DlUBP 基因中的5 個表達量呈下降趨勢，有些甚至低于0 h 對照組，僅DlUBP19 的表達量逐漸上升，由此推測DlUBP 基因可能參與脫落酸的調(diào)控，且基因表達情況與處理時間有很大關(guān)系。

在脅迫條件下，脫落酸快速產(chǎn)生，調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉，影響脅迫響應(yīng)基因的表達。JINFENG 等［29］指出，AtUBP24 是擬南芥中脫落酸信號傳導(dǎo)和鹽脅迫耐受性的負調(diào)控因子，若缺少AtUBP24 基因，可能導(dǎo)致擬南芥在脫落酸誘導(dǎo)的氣孔調(diào)節(jié)中對干旱脅迫的敏感性增加。不僅如此，文獻［30-31］指出，在干旱脅迫下，MYB 受脫落酸依賴，可通過調(diào)節(jié)脅迫增加植物的耐旱性［30］。對龍眼DlUBP 基因啟動子的分析發(fā)現(xiàn)，50%以上的DlUBP 家族成員啟動子含有在干旱脅迫下MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，且其中一半成員具有1 個以上該結(jié)合位點，初步猜測DlUBP 基因可能對干旱脅迫有響應(yīng)。通過分析干旱脅迫處理不同時間梯度下6 個DlUBP 基因的表達量發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫處理不同時間后，6 個DlUBP基因的表達量均呈上升或下降趨勢，大部分基因的表達量在干旱脅迫處理4 h 后呈上升趨勢，因此推測DlUBP 家族對干旱脅迫有應(yīng)激反應(yīng)，且適當(dāng)時間的干旱脅迫處理有利于基因表達。

4 結(jié)論

對龍眼泛素特異蛋白酶（UBP）進行全基因組鑒定，對體胚早期不同階段以及在外源脅迫下的表達進行了分析。在龍眼中共鑒定出18 個DlUBP 基因，分析了DlUBP 基因的結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、染色體定位、啟動子順式元件、在不同時間梯度的脫落酸處理和干旱脅迫處理下的表達情況。結(jié)果表明，DlUBP 基因可能參與龍眼體細胞胚胎發(fā)育、脫落酸和干旱脅迫響應(yīng)過程，可為后續(xù)對龍眼UBP 家族單基因的功能驗證以及外源脅迫的響應(yīng)機理研究提供參考。