安徽省5株新型鵝星狀病毒的分離鑒定與遺傳進(jìn)化分析

賈北平, 呂 炫, 楊 慶, 王一楠, 李皖蕭, 解新迪, 朱英奇, 王 蓓, 殷冬冬,張?jiān)苿P, 王 晴, 王桂軍,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,安徽 合肥 230036; 2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,安徽 合肥 230001; 3.合肥華盟生物技術(shù)有限公司,安徽 合肥 231131)

近年來(lái),在我國(guó)安徽、山東、河南和福建等省均爆發(fā)了雛鵝痛風(fēng)病。該病的病原為新型鵝星狀病毒(GAstV)[1-2],以內(nèi)臟、關(guān)節(jié)中的尿酸鹽沉積為主要表現(xiàn)特征[3-4],會(huì)導(dǎo)致雛鵝生長(zhǎng)遲緩、癱瘓,甚至死亡,嚴(yán)重影響?zhàn)B鵝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

GAstV屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬,是一種二十面體的無(wú)囊膜的單股正鏈RNA病毒[5-6]。禽星狀病毒的基因組全長(zhǎng)一般在6.9～7.9 kb[7-8],主要由5′非編碼區(qū)(5′UTR)、3個(gè)開放閱讀框(ORF)(分別為ORF1a、ORF1b和ORF2)、3′非編碼區(qū)(3′UTR)和1個(gè)多聚A尾組成[9-10]。其中,ORF2編碼衣殼蛋白(capsid),是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,也是主要毒力蛋白[11-12]。GAstV的體外分離培養(yǎng)比較困難,目前主要在原代鵝胚腎細(xì)胞(GEK)[13]、雞肝癌細(xì)胞(LMH)[14-15]和9～11日齡的鵝胚[16-17]中進(jìn)行分離和培養(yǎng)。

由GAstV引起的雛鵝痛風(fēng)病主要侵害3周齡以內(nèi)的雛鵝[18],患病雛鵝生長(zhǎng)緩慢、癱瘓,甚至死亡[19-20]。對(duì)發(fā)病雛鵝解剖可見,肝、腎、心臟等器官,及腿關(guān)節(jié)有明顯的尿酸鹽沉積[21]。本研究對(duì)2018—2021年采集的患病雛鵝的病料進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定,通過(guò)分離培養(yǎng)獲得多株GAstV毒株,開展全基因組測(cè)序,分析其ORF1a、ORF1b、ORF2基因與其他毒株的同源性,及與以往年份毒株氨基酸變異位點(diǎn)的差異,同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析各毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系,旨在為鵝星狀病毒的深入研究奠定基礎(chǔ),同時(shí)也可為安徽省鵝星狀病毒的診斷與防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

2018—2021年于安徽省內(nèi)多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集疑似GAstV感染病料,保存于-80 ℃冰箱。健康鵝胚購(gòu)自南京竹順生物技術(shù)有限公司。

RNAeasyTM動(dòng)物RNA抽提試劑盒、BeyoRTTMII cDNA第一鏈合成試劑盒,購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;2×TaqPlus Master Mix Ⅱ購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;pMD19-T載體、大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH-5α,購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;StarPrep快速DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 病例背景

2018年5月—2021年10月,安徽省多個(gè)鵝場(chǎng)先后爆發(fā)有雛鵝痛風(fēng)癥狀的傳染病,死亡雛鵝剖檢可見明顯的尿酸鹽沉積等病理變化。本研究采集到多份病例(表1),發(fā)病鵝的品種包括朗德鵝、泰州白鵝、皖西白鵝,系10～40日齡的雛鵝,在臨床上表現(xiàn)出采食量下降或廢絕、排白色稀便、癱瘓等癥狀,死亡率在5.0%～77.8%。剖檢病變情況如下:病料1,腎腫大發(fā)白,肝表面有白色尿酸鹽沉積,膽囊呈綠色;病料2,腎出血腫大、有尿酸鹽沉積,肝表面出血,膽汁發(fā)黃有顆粒物;病料3,輸尿管尿酸鹽沉積,腦膜出血;病料4,腎發(fā)白,輸尿管尿酸鹽沉積,心、肝表面白色尿酸鹽沉積,腦出血;病料5,腎腫大,花斑腎,輸尿管有尿酸鹽沉積,肝表面可見尿酸鹽沉積。

表1 雛鵝病例的基本情況Table 1 Basic information of gosling cases

1.3 病料的采集與處理

剖檢雛鵝后,采集尿酸鹽沉積明顯的雛鵝心、腎、肝組織,分別取各組織的2/3保存于-80 ℃冰箱,用于后續(xù)檢測(cè);另外1/3室溫保存于4%多聚甲醛溶液中,用于組織病理學(xué)觀察。

從-80 ℃冰箱取出凍存的病料組織,用充分消毒的剪刀取等量雛鵝的心、肝、腎組織共1 g于研缽中,加入5 mL無(wú)菌PBS緩沖液充分研磨。收集病料研磨液,加入青霉素與鏈霉素,-80 ℃冷凍20 min后,室溫解凍,反復(fù)凍融3次后,將研磨液在4 ℃、12 000×g條件下離心10 min,吸取上清,經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾后保存于-80 ℃冰箱,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)

取上述處理好的病毒液,用RNAeasyTM動(dòng)物RNA抽提試劑盒提取RNA,用BeyoRTTMII cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,將得到的cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱備用。針對(duì)GAstV設(shè)計(jì)、合成PCR檢測(cè)引物[引物序列(5′→3′)分別為AGAAGGTGCGGAAGAGTGGTATGA、GCGAAGAGTGCGTAAGAGGTTGT],用上述制備的cDNA作為模板,對(duì)病料進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)(退火溫度55 ℃,目的片斷大小為300 bp)。同時(shí),用針對(duì)鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、禽流感(AIV)、禽腺病毒(FAdV)、鴨乙型肝炎病毒(DHBV)、鴨呼腸孤病毒(DRV)和鵝細(xì)小病毒(GPV)等設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)病料進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),判定病料中是否存在其他常見的外源性病毒。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

1.5 GAstV的分離鑒定

取健康鵝胚在孵化箱內(nèi)孵化至9日齡,通過(guò)絨毛尿囊膜途徑分別接種各組陽(yáng)性樣品的病毒液(每組接種3枚,每枚胚的接種劑量為200 μL),并設(shè)立使用PBS緩沖液的陰性對(duì)照組。接種完成后,將鵝胚放入孵化箱中繼續(xù)生長(zhǎng),每12 h照胚檢查一次,觀察并記錄鵝胚的存活情況。棄去接種后24 h之內(nèi)死亡的鵝胚。將1～7 d死亡的鵝胚及時(shí)取出。病毒接種7 d后收取其余鵝胚,放入4 ℃冰箱處死。

確定調(diào)度系統(tǒng)出現(xiàn)異常后，對(duì)操作人員進(jìn)行告警。報(bào)警處理分兩種方式，一種是事故報(bào)警，另一種是預(yù)告報(bào)警。前者包括非操作引起的斷路器跳閘和保護(hù)裝置動(dòng)作信號(hào)。后者包括狀態(tài)異常信息、模擬量越限/復(fù)限、計(jì)算機(jī)站控系統(tǒng)部件以及間隔層單元的狀態(tài)異常等。

于無(wú)菌條件下打開鵝胚,收集尿囊液與胚體,觀察病變。取胚體肝,研磨,離心,收取上清液,反復(fù)凍融。將上清液與尿囊液過(guò)濾除菌后繼續(xù)接種于下一代鵝胚中,按此方法傳3～5代。

將上述處理好的尿囊液與胚體研磨上清液一起提取RNA并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),檢測(cè)引物同1.4節(jié)。

1.6 GAstV的全基因組測(cè)序

根據(jù)GenBank收錄的GAstV全基因組序列(來(lái)源于SD01株,GenBank登錄號(hào):MF772821),設(shè)計(jì)7對(duì)引物(表2),包含病毒的全基因組且相互重疊。引物委托南京擎科生物科技有限公司合成。

表2 GAstV全基因測(cè)序引物的基本信息Table 2 Basic information of primers for genome sequencing of GAstV

取上述分離到的GAstV各毒株的F3代病毒液進(jìn)行RNA提取與反轉(zhuǎn)錄,其中,反轉(zhuǎn)錄引物使用各段測(cè)序引物的下游引物。利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)各毒株的全基因組序列分段擴(kuò)增,取PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后連接T載體,委托南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.7 GAstV的遺傳進(jìn)化分析

利用MegAlign軟件對(duì)本研究分離到的毒株與其他人分離得到的毒株的ORF1a、ORF1b、ORF2基因進(jìn)行核苷酸同源性分析。用到的其他毒株具體包括:JSHA(分離于2016年),GenBank登錄號(hào)為MK125058;SD01(分離于2017年),GenBank登錄號(hào)為MF772821;GD(分離于2017年),GenBank登錄號(hào)為MK125058;SDPY(分離于2017年),GenBank登錄號(hào)為MH052598;GXZ(分離于2018年),GenBank登錄號(hào)為MH807626;GTF-04(分離于2018年),GenBank登錄號(hào)為MN068023;GTF-07(分離于2018年),GenBank登錄號(hào)為MN068024;AHAU1(分離于2018年),GenBank登錄號(hào)為MN428641;AHAU4(分離于2018年),GenBank登錄號(hào)為MN428644;XX(分離于2018年),GenBank登錄號(hào)為MN337323;SDXT(分離于2019年),GenBank登錄號(hào)為MN399857;HBXG(分離于2019年),GenBank登錄號(hào)為MN894548;HNKF-1(分離于2020年),GenBank登錄號(hào)為MW592377;HNSQ-6(分離于2020年),GenBank登錄號(hào)為MW592378;HR2105/1(分離于2021年),GenBank登錄號(hào)為OM066892;ZM(分離于2021年),GenBank登錄號(hào)為MZ648231。

利用MEGA 7軟件,基于本研究分離到的毒株與其他毒株的ORF2基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。同時(shí),利用MEGA 7軟件,選取不同種屬的星狀病毒(包括哺乳動(dòng)物星狀病毒和禽星狀病毒),根據(jù)其全基因組構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析GAstV與其他星狀病毒的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病雛鵝的臨床觀察與剖檢

A～C,病例1的臨床觀察和剖檢變化;D～F,病例2的剖檢變化;G～I(xiàn),病例3的臨床觀察和剖檢變化。A-C, Clinical observation and autopsy changes of case No. 1; D-F, Changes in autopsy of case No. 2; G-I, Clinical observation and autopsy changes of case No. 3.圖1 臨床發(fā)病雛鵝的臨床觀察與解剖變化Fig.1 Clinical observation and anatomical changes of diseased goslings

2.2 臨床病料的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,5例病例均系GAstV陽(yáng)性,擴(kuò)增片段的大小符合預(yù)期(圖2),并且無(wú)外源性病毒感染,可確診為GAstV感染。

M,DL2000 DNA分子量標(biāo)記;1,陰性對(duì)照;2～6依次對(duì)應(yīng)于病例1～病例5。M, DL 2000 DNA marker; 1, Negative control; 2-6, Case 1-5, correspondingly.圖2 臨床病例的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 RT-PCR results of clinical cases

2.3 GAstV的分離鑒定

采集GAstV陽(yáng)性雛鵝的腎和肝,研磨過(guò)濾除菌后接種于9～11日齡健康鵝胚中,盲傳3代,分離得到5株新型鵝星狀病毒,分別命名為AHAU2018株、DY-19株、ZY02株、HR2105/2株、HR2110/1株。結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組鵝胚未出現(xiàn)病變或死亡,未檢測(cè)到GAstV。各毒株各代次的鵝胚病變基本一致,胚體均表現(xiàn)出全身出血的病變,且隨著代次增加,胚體腹腔可見白色尿酸鹽沉積病變,部分毒株高代次時(shí)鵝胚出現(xiàn)絨毛尿囊膜上蓄積白色尿酸鹽的變化。前期低代次的毒株感染鵝胚并未導(dǎo)致鵝胚死亡,但隨著代次增加,逐漸有鵝胚死亡,死亡率在20%～30%,死亡時(shí)間集中在60～120 h。其中,HR2105/2株可見胚體嚴(yán)重出血(圖3),ZY02株可見胚體出血,解剖可見腹腔有白色尿酸鹽沉積。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,各組F3代尿囊液均系GAstV陽(yáng)性(圖4)。綜上,分離得到的各毒株均可在鵝胚上穩(wěn)定增殖傳代,并能引起鵝胚胚體廣泛性出血、胚體腹腔有白色尿酸鹽沉積等穩(wěn)定病變,可致鵝胚死亡。

圖3 HR2105/2株(A～C)和ZY02株(D～F)GAstV接種鵝胚的病變圖Fig.3 Pathological changes of goose embryos inoculated with HR2105/2 strain (A-C) and ZY02 strain (D-F) of GAstV

M,DL2000 DNA分子量標(biāo)記;1,陰性對(duì)照;2,陽(yáng)性對(duì)照;3,AHAU2018株;4,DY-19株;5,ZY02株;6,HR2105/2株;7,HR2110/1株。M, DL2000 DNA Marker;1, Negative control; 2, Positive control; 3, AHAU2018 strain; 4, DY-19 strain; 5, ZY02 strain; 6, HR2105/2 strain; 7, HR2110/1 strain.圖4 F3代鵝胚尿囊液的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 RT-PCR detection results of allantoic fluid from F3 generation goose embryos

2.4 GAstV毒株的全基因組測(cè)序結(jié)果

全基因組測(cè)序結(jié)果表明,本研究分離的5株毒株的全長(zhǎng)均為7 175 nt,包括10 nt的5′UTR和236 nt的3′UTR,以及3個(gè)ORF(分別編碼ORF1a、ORF1b和ORF2蛋白)(圖5)。ORF1a長(zhǎng)3 255 nt,ORF1b長(zhǎng)1 551 nt,兩者編碼鵝星狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白,包含跨膜域、絲氨酸蛋白酶、卷曲螺旋、病毒基因組連接蛋白、核定位信號(hào)和RNA依賴性RNA聚合酶;ORF2長(zhǎng)2 115 nt,編碼病毒衣殼蛋白。

圖5 GAstV分離株的基因組結(jié)構(gòu)Fig.5 Genome structure of GAstV strain

將AHAU2018、DY-19、ZY02、HR2105/2、HR2110/2株GAstV的全長(zhǎng)序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)分別為ON205965、MT701902、OM066895、OM066893、OM066894。

2.5 GAstV毒株的遺傳進(jìn)化分析

對(duì)分離毒株核苷酸的同源性進(jìn)行分析(表3),結(jié)果顯示,AHAU2018株(分離于2018年)與分離于2018年前后的毒株的同源性高于與2019年以后分離毒株的同源性;而HR2105/2、HR2110/1、ZY02株(均分離于2021年)與2021年前后分離株的同源性高于與2016—2019年分離毒株的同源性。上述結(jié)果表明,GAstV在我國(guó)已發(fā)生變異。

表3 分離毒株ORF1a、ORF1b和ORF2基因的同源性Table 3 Homology analysis of ORF1a, ORF1b and ORF2 genes of GAstV strains

為了探究不同年份GAstV分離毒株之間的差異,本研究選取ORF2基因作為研究對(duì)象,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)。結(jié)果顯示,2019年以前分離的毒株(包括AHAU2018)處于同一個(gè)進(jìn)化亞分支,而2019年以后分離的毒株處于另一個(gè)進(jìn)化亞分支。

將分離到的5株GAstV與已發(fā)表的哺乳動(dòng)物星狀病毒和禽星狀病毒進(jìn)行全基因組的核苷酸比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)。結(jié)果顯示,5株分離毒株均屬于目前流行的導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的GAstV,其中,AHAU2018株與其他4株分離毒株,以及本實(shí)驗(yàn)室2021年分離得到的ZM株(GenBank登錄號(hào):MZ648231)和HR2105/1株(GenBank登錄號(hào):OM066892)處于同一進(jìn)化分支的不同進(jìn)化亞分支上,與上文結(jié)果一致。所分離的這5株毒株均不屬于TAstV-1、DAstV-2進(jìn)化分支,與以往分離得到的鵝星狀病毒FLX株和AHDY株處于同一進(jìn)化分支的不同進(jìn)化亞分支,與哺乳動(dòng)物星狀病毒處于不同的進(jìn)化分支。

圖7 基于星狀病毒全基因組的遺傳進(jìn)化分析Fig.7 Genetic evolution analysis based on whole genome of astrovirus

3 討論

近幾年,GAstV感染引起的雛鵝痛風(fēng)病已經(jīng)成為制約安徽養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的問(wèn)題之一[22]。該病以雛鵝關(guān)節(jié)、內(nèi)臟等產(chǎn)生尿酸鹽沉積為典型特征[23-24],可致雛鵝生長(zhǎng)遲緩、癱瘓,甚至死亡。本研究于2018—2021年在安徽省內(nèi)主要養(yǎng)鵝地區(qū)采集疑似感染GAstV的病料,并對(duì)其進(jìn)行鑒定、病毒培養(yǎng)、基因組測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析,以期為深入了解安徽省乃至我國(guó)GAstV的流行情況和病原特征提供參考。結(jié)果顯示,共分離到5株新的鵝星狀病毒毒株,經(jīng)鑒定,均系GAstV,分別將其命名為AHAU2018株、DY-19株、ZY02株、HR2105/2株、HR2110/1株。

因缺少合適的細(xì)胞系,星狀病毒的體外培養(yǎng)存在一定困難。有研究表明,鵝星狀病毒可在LMH細(xì)胞中增殖,但不引起LMH細(xì)胞出現(xiàn)病變。Wei等[25]利用LMH細(xì)胞成功地從發(fā)病雛鵝的肝和腎中分離得到GAstV。Wei等[26]還利用LMH細(xì)胞成功分離到鴨源的GAstV。孫永林[27]研究發(fā)現(xiàn),GAstV可以通過(guò)制備的雞胚肝細(xì)胞進(jìn)行分離,且可以產(chǎn)生細(xì)胞病變。張玉杰等[28]研究發(fā)現(xiàn),GAstV-2 SCCD株可以在鵝胚上穩(wěn)定增殖,但是GAstV-1 SDPD株不能在鵝胚和SPF雞胚上穩(wěn)定增殖。本研究分離的不同年份的毒株均可以通過(guò)絨毛尿囊膜接種的方式在鵝胚上穩(wěn)定增殖,并可引起鵝胚胚體出血、腹腔尿酸鹽沉積等病變,但關(guān)于其在LMH細(xì)胞上的增殖特性還有待進(jìn)一步研究。

星狀病毒作為單鏈RNA病毒,易發(fā)生不同毒株之間的同源重組。目前,在禽類和哺乳動(dòng)物類星狀病毒中均發(fā)現(xiàn)了變異毒株。Niu等[29]從制備的原代鵝胚腎細(xì)胞中分離得到一株新型鵝星狀病毒SDPY株,發(fā)現(xiàn)其ORF1a、ORF1b和ORF2基因與已發(fā)表的禽星狀病毒株的相似性很低,最高不超過(guò)69%。Fei等[30]研究表明,GAstV中的Ⅱ-c型目前已經(jīng)成為山東省的優(yōu)勢(shì)基因型,同時(shí)發(fā)現(xiàn)了GAstV存在自然重組的證據(jù)。徐夢(mèng)璐等[31]研究發(fā)現(xiàn),GAstV的JSSQ株與GD AHAU2株和AHAU4株發(fā)生了重組。盧秀嫻等[32]從山東省患病雛鵝中分離出1株鵝星狀病毒,與章麗嬌等[33]于2018年在安徽得到的分離株AHQJ18的親緣關(guān)系較近。Wei等[26]研究發(fā)現(xiàn),安徽地區(qū)分離毒株與分離自山東地區(qū)的SDPY株的親緣關(guān)系較近,江蘇地區(qū)分離毒株的重組位點(diǎn)可能來(lái)自安徽和山東分離株,同時(shí)存在安徽不同毒株間的重組。星狀病毒ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白是星狀病毒分型的主要依據(jù)。本研究通過(guò)分析GAstV不同分離株ORF2基因核苷酸和其編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn),2019年前后分離的GAstV處于不同的進(jìn)化亞分支上,表明GAstV在我國(guó)已發(fā)生變異,但其優(yōu)勢(shì)基因型是否發(fā)生變化還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究分離的AHAU2018、DY-19、ZY02、HR2105/2、HR2110/1株均屬于目前在我國(guó)流行的導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的GAstV,但AHAU2018株與作者團(tuán)隊(duì)于2019年后獲得的其他分離株處于不同的進(jìn)化亞分支上。