羅海玲 夏順超 盧琴 李海銀

摘 要：?草地貪夜蛾是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，其遷飛性強(qiáng)、寄主廣、繁殖力高，給我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p失。從分子水平探究草地貪夜蛾生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、抗藥性形成的內(nèi)在分子機(jī)理，能為蟲(chóng)害的防治、防控提供重要參考。 β-Actin作為一種高度保守的看家蛋白常在分子生物學(xué)中用作內(nèi)參去定量目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，因而獲得高質(zhì)量的β-Actin抗體是從事相關(guān)分子研究的基本前提。因此，本研究克隆了草地貪夜蛾β-Actin基因部分編碼序列，長(zhǎng)度為579 bp。利用原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)獲得了約37 kD的β-Actin重組蛋白，將純化后的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備得到β-Actin多克隆抗體血清。經(jīng)ELISA檢測(cè)，獲得的抗血清效價(jià)達(dá)1∶ 256000。利用制備的β-Actin抗血清進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，結(jié)果顯示在42 kD處出現(xiàn)強(qiáng)且單一的蛋白條帶， 說(shuō)明制備的β-Actin抗血清能有效識(shí)別草地貪夜蛾β-Actin蛋白。綜上，本研究制備的β-Actin多克隆抗體效價(jià)高、特異性較強(qiáng)，能為草地貪夜蛾后續(xù)相關(guān)分子研究提供基本條件。

關(guān)鍵詞：草地貪夜蛾；β-Actin；原核表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號(hào)：Q965

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008－0457（2023）02－0081－05

國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.02.012

草地貪夜蛾 ?Spodoptera frugiperda ，屬鱗翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae，是一種重要的雜食性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，其幼蟲(chóng)可危害玉米、水稻、高粱等禾本科作物［1］。草地貪夜蛾原產(chǎn)于美洲大陸［2］，2018年底從緬甸入侵我國(guó)云南地區(qū)，隨后在貴州各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾［3］，并逐漸向我國(guó)其他地區(qū)擴(kuò)散［4］。草地貪夜蛾具有遷飛擴(kuò)散性、寄主廣泛性、高繁殖性、暴食為害性等特點(diǎn)，嚴(yán)重?fù)p害了我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)［5-6］。目前，草地貪夜蛾的防治主要使用化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治、生物防治等，其中化學(xué)防治方法見(jiàn)效快，使用方法也比較簡(jiǎn)單方便［7］，但隨著化學(xué)藥劑的大量使用和草地貪夜蛾的快速演進(jìn)，草地貪夜蛾的抗藥性也逐漸增強(qiáng)，急需開(kāi)發(fā)更新型的綠色殺蟲(chóng)藥物用以防治。伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從分子水平探究草地貪夜蛾生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、抗藥性形成的內(nèi)在分子機(jī)制，以此為理論基礎(chǔ)挖掘防治草地貪夜蛾的潛在分子靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)新型綠色農(nóng)藥，能為草地貪夜蛾的防治提供新思路［8-9］。

在分子生物學(xué)技術(shù)中，蛋白質(zhì)印跡（Western blot）是蛋白層面研究的一種基礎(chǔ)且重要的技術(shù)，具有高敏感性和特異性的特點(diǎn)，可以從混合蛋白質(zhì)中利用抗體檢測(cè)出目的蛋白，并能進(jìn)行定性或定量分析［10］。然而，該技術(shù)需要一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的蛋白作為參考，以減少試驗(yàn)誤差， 使結(jié)果更為信服。Actin，即肌動(dòng)蛋白，幾乎存在于所有真核細(xì)胞中，是許多真核細(xì)胞中含量最為豐富的蛋白質(zhì)［11］，作為細(xì)胞骨架的重要組分，參與細(xì)胞分裂、運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)等重要的生理活動(dòng)［12-14］。根據(jù)Actin蛋白等電點(diǎn)的不同可以將其分為α、β、γ三種，其中β-Actin由于其高表達(dá)量和高穩(wěn)定性，常被用作內(nèi)參來(lái)比較不同來(lái)源目的蛋白的表達(dá)差異［15］。而在試驗(yàn)中檢測(cè)β-Actin蛋白則需要抗體的特異性識(shí)別，因此一個(gè)高效、穩(wěn)定的β-Actin抗體在蛋白分子研究中不可或缺。

本研究對(duì)草地貪夜蛾β-Actin基因部分編碼序列進(jìn)行克隆，通過(guò)體外重組表達(dá)、純化得到草地貪夜蛾β-Actin重組蛋白，免疫新西蘭大白兔獲得草地貪夜蛾β-Actin多克隆抗體血清，并對(duì)抗體進(jìn)行了效價(jià)檢測(cè)，Western blot結(jié)果顯示制備的抗體能特異性識(shí)別草地貪夜蛾β-Actin蛋白。 本研究制備的抗體能為草地貪夜蛾后續(xù)相關(guān)分子生物學(xué)研究提供必要條件。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料及主要試劑儀器

1.1.1 ?供試材料

試驗(yàn)中使用的草地貪夜蛾采自貴州省黔西南望謨縣（N 25°10′28.53″，E 106°05′40.64″），并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)8代，飼養(yǎng)條件：溫度：25 ℃，濕度：75%，光照：2000 lux，L∶ D=14∶ 10。

1.1.2 ?主要試劑

總RNA提取試劑盒（碧云天）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （Thermo）；T4DNA連接酶（Thermo）、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ（Takara）、Taq DNA聚合酶（Takara）； DNA膠回收試劑盒（上海生工）、質(zhì)粒提取試劑盒（上海生工）；His-tag蛋白純化試劑盒（碧云天）。

1.1.3 ?主要儀器

低溫超速離心機(jī)（Sigma）、PCR儀（Bio-Rad）、垂直蛋白電泳儀（Bio-Rad）、超聲破碎儀（新芝）、超低溫冰箱（捷盛）、酶標(biāo)儀（Thermo）、超微量分光光度計(jì)（Thermo）。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?總RNA提取及cDNA合成

取草地貪夜蛾3齡幼蟲(chóng)整蟲(chóng)液氮研磨，使用RNA抽提試劑盒提取草地貪夜蛾的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證草地貪夜蛾總RNA的完整性，經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度。取1 μg總RNA作為模板，Oligo d（T）18為引物，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 ?PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物回收純化

參照NCBI網(wǎng)站中草地貪夜蛾的β-Actin基因序列（登錄號(hào)：HQ008727.1）設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物（表1），以草地貪夜蛾cDNA為模板，利用原核表達(dá)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序：98 ℃變性2 min； 98 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，并利用試劑盒切膠回收純化PCR產(chǎn)物。

1.2.3 ?原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將純化后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒pET-32a用內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ分別進(jìn)行雙酶切，純化雙酶切產(chǎn)物。在T4 DNA連接酶作用下將純化后的基因片段連入pET-32a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)14～16 h。PCR鑒定陽(yáng)性菌落，并測(cè)序驗(yàn)證序列正確性。挑選測(cè)序正確的陽(yáng)性菌擴(kuò)大培養(yǎng)，并抽提重組質(zhì)粒。

1.2.4 ?重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落入5 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600值0.6～0.8），加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h，同時(shí)設(shè)置不加IPTG誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照。用SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。 將生長(zhǎng)旺盛的種子菌接種到500 mL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，根據(jù)小規(guī)模表達(dá)的條件，加IPTG誘導(dǎo)6 h。收集大規(guī)模表達(dá)的菌液，利用裂解液和超聲破碎細(xì)胞，參照碧云天His-tag蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化。測(cè)定純化后蛋白濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純度。-20 ℃保存純化后蛋白。

1.2.5 ?抗體的制備及效價(jià)檢測(cè)

采用皮下免疫法，將純化后的β-Actin重組蛋白免疫新西蘭大白兔獲得抗體血清，該部分由武漢金開(kāi)瑞生物公司完成。

將獲得的抗體血清進(jìn)行ELISA抗體效價(jià)檢測(cè)。用包被液稀釋抗原到2 μg/mL，以100 μL/孔加入96孔酶標(biāo)反應(yīng)板中，4 ℃過(guò)夜包被；洗滌液洗滌4次，加入封閉液，37 ℃溫育2 h；洗滌液洗滌4次，用PBS按1∶ 2000，1∶ 4000，1∶ 8000，1∶ 16000等比例稀釋血清，免疫前血清同比稀釋做為陰性對(duì)照，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h；洗滌液洗滌4次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育40 min；洗滌5次后拍干，加新鮮配制的底物溶液100 μL/孔，37 ℃遮光放置10～20 min；加50 μL/孔終止液，拍照并用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450。將抗體血清OD450/免疫前血清OD450的比值≥2.1的最高稀釋度作為該抗血清的效價(jià)。

1.2.6 ?Western blot

提取草地貪夜蛾六齡幼蟲(chóng)總蛋白，Brandford法測(cè)定蛋白濃度，并制備蛋白樣品。以3 μg、5 μg、8 μg總蛋白為濃度梯度進(jìn)行SDS-PAGE電泳；濕轉(zhuǎn)法在100 V，1 h條件下將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；封閉液37 ℃孵育1 h；一抗（1∶ 3000）37 ℃孵育1 h；TBST洗4次，加入二抗（1∶ 10000）37 ℃孵育1.5 h；洗膜4次，ECL顯影曝光，掃描光密度信號(hào)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)草地貪夜蛾基因組推定的β-Actin蛋白序列（登錄號(hào)：AEK82131.1），選擇184～376位氨基酸序列作為免疫原（圖1），根據(jù)免疫原對(duì)應(yīng)的編碼序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在500～750 bp之間出現(xiàn)一條與理論長(zhǎng)度（579 bp）大小一致的陽(yáng)性條帶（圖2-a）。將所得的目的片段雙酶切連入pET-32a表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖2-b），測(cè)序鑒定。

2.2 ?重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將構(gòu)建正確的pET-32a-β-Actin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性菌株用終濃度為0.2 mM IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)后在37 kD處有一條明顯增強(qiáng)蛋白條帶，與預(yù)期重組蛋白（含載體自帶硫氧還原蛋白和His標(biāo)簽）大小一致（圖3），說(shuō)明目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。 將小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)成功的菌液進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)，收集誘導(dǎo)后的菌液，利用His-tag蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化，SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示經(jīng)高濃度咪唑洗脫的重組蛋白純度較高（圖4），符合免疫要求，將洗脫的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備抗體。

2.3 ?ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)

將采集獲得的抗體血清進(jìn)行ELISA抗體效價(jià)檢測(cè)。結(jié)果表明，隨著血清稀釋倍數(shù)的增加，OD450依次降低，β-Actin抗血清以1∶ 256000稀釋后OD450值是陰性對(duì)照免疫前血清OD450的2.65倍（＞2.1），由此判定制備的β-Actin抗血清效價(jià)為1∶ 256000（圖5）。

2.4 ?Western blot檢測(cè)草地貪夜蛾β-Actin蛋白

從草地貪夜蛾幼蟲(chóng)中提取總蛋白進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，結(jié)果顯示在42 kD左右檢測(cè)到一條明顯的特異性蛋白條帶，大小與預(yù)測(cè)的草地貪夜蛾β-Actin蛋白大小一致（圖6），表明制備的多克隆抗體可以特異性識(shí)別草地貪夜蛾β-Actin蛋白。

3 ?結(jié)論與討論

近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，分子生物學(xué)高速發(fā)展，從微觀分子水平探尋生物體的發(fā)生機(jī)制已成為當(dāng)前研究的主體［16］，其中蛋白表達(dá)分析在發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控分子機(jī)制方面發(fā)揮著重要的作用［17］。比較生命體不同細(xì)胞或組織的蛋白表達(dá)差異是研究其生物學(xué)現(xiàn)象和功能的重要基礎(chǔ)，要準(zhǔn)確判斷蛋白表達(dá)的水平，就需要一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參，使定性定量分析達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化［18］。β-Actin是生物進(jìn)化過(guò)程中最保守的蛋白之一，在蛋白水平具有95%的一級(jí)結(jié)構(gòu)保守性［19］。此外，β-Actin蛋白幾乎在所有真核細(xì)胞中穩(wěn)定高量表達(dá)，因此常被用作內(nèi)參來(lái)標(biāo)定其他蛋白的表達(dá)情況。在昆蟲(chóng)的分子生物學(xué)相關(guān)研究中，β-Actin是最常用的內(nèi)參之一［20-22］，但β-Actin蛋白的檢測(cè)需要相應(yīng)特異性抗體，目前市面上大多 數(shù)商品化的抗體主要針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞及組織，在昆蟲(chóng)（如草地貪夜蛾）體內(nèi)特異性不強(qiáng)，且商品化內(nèi)參抗體價(jià)格也較為昂貴［23］，因而制備草地貪夜蛾β-Actin多克隆抗體是檢測(cè)其他蛋白表達(dá)情況的前提條件。

本研究選用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行β-Actin重組蛋白表達(dá)，該表達(dá)系統(tǒng)具有條件需求簡(jiǎn)單、使用安全、試驗(yàn)周期短、重組蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)［24-25］。本研究使用的表達(dá)載體質(zhì)粒為pET-32a（+），該質(zhì)粒自帶硫氧還原蛋白，與目的蛋白融合表達(dá)可增加重組蛋白的水溶性，有利于提高蛋白表達(dá)量。此外，pET-32a（+）攜帶了6×His標(biāo)簽，在不影響目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能前提下，可與Ni+穩(wěn)定螯合，為純化目的蛋白提供了有利的條件。鑒于以上優(yōu)勢(shì)，本研究成功誘導(dǎo)表達(dá)并純化了草地貪夜蛾β-Actin重組蛋白，并以此為抗原免疫新西蘭大白兔，制備得到了β-Actin多克隆抗體。

抗體可分為多克隆抗體和單克隆抗體。相較于單克隆抗體，多克隆抗體的制備程序簡(jiǎn)單，效價(jià)更高，但與其他非靶標(biāo)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)也較高［26］。本研究制備的β-Actin多克隆抗體經(jīng)ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到1∶ 256000，而Western blot結(jié)果證明制備的β-Actin多克隆抗體能有效識(shí)別草地貪夜蛾β-Actin蛋白，且未見(jiàn)有其他明顯雜交條帶，說(shuō)明制備的多克隆抗體特異性強(qiáng)，與其他蛋白并不發(fā)生強(qiáng)的交叉反應(yīng)。因此，本研究制備的草地貪夜蛾β-Actin多克隆抗體不僅可以作為內(nèi)參在Western blot中來(lái)標(biāo)定其他蛋白的表達(dá)情況，還能應(yīng)用于對(duì)抗體要求較高的免疫組化、免疫熒光、免疫共沉淀等多種研究。

綜上所述，本研究通過(guò)重組表達(dá)草地貪夜蛾β-Actin蛋白，并免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體血清，經(jīng)效價(jià)測(cè)定和Western blot檢測(cè)證明制備的β-Actin抗體效價(jià)高、特異性好，可用于后續(xù)試驗(yàn)，能為草地貪夜蛾的深入研究提供良好基礎(chǔ)。

（責(zé)任編輯：段麗麗）

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Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of the β-Actin in Spodoptera frugiperda

Luo Hailing，Xia Shunchao，Lu Qin，Li Haiyin*

（Institute of Entomology，Guizhou University/The Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Region of Guizhou，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：

Spodoptera frugiperda is an important agricultural pest.This pest has wide range of hosts，high reproduction，and strong immigration，which cause serious losses to the agricultural economy in China.The exploring of molecular mechanism of the growth，development，reproduction，and drug resistance of S.frugiperda，which could provide important information for the control of S.frugiperda.β-Actin，a highly conservative housekeeper protein，is often used as an internal reference to quantify the target protein expression frequently.Therefore，a high-quality β-Actin antibody is a prerequisite for protein research.In this study，we cloned the partial coding sequences of the β-Actin gene （579 bp） from S.frugiperda.A prokaryotic expression system was used to induce the β-Actin recombinant protein of about 37 kD.And then purified β-Actin recombinant proteins were used to immunize New Zealand white rabbit for preparing the antiserum β-Actin.ELISA analysis showed that the titer of the β-Actin antiserum was 1∶ 256000.Western blot showed that the β-Actin antibody could specifically recognize β-Actin protein （the band was about 42 kD）.In conclusion，the β-Actin polyclonal antibody with high potency and specificity was generated successfully in this study，which will provide the basic conditions for further molecular research in S.frugiperda.

Keywords：

Spodoptera frugiperda; β-Actin; prokaryotic expression; polyclonal antibody