THIP 對(duì)MK-801 介導(dǎo)小鼠腦脫髓鞘損傷的保護(hù)作用

李金霞， 王 聃， 韓 勇， 尚 彤， 劉 娟， 馬全瑞

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，銀川 750004）

精神分裂癥（schizophrenia，SCZ）是一種患病率高、遺傳率高、社會(huì)危害性高的精神性障礙，其中出現(xiàn)認(rèn)知損害的患者占80%，認(rèn)知癥狀是SCZ的核心癥狀之一[1-3]。研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，SCZ 患者大腦出現(xiàn)脫髓鞘改變后，增強(qiáng)髓鞘的形成可以改善認(rèn)知損傷，髓鞘損傷或發(fā)育不良與SCZ 認(rèn)知障礙密切相關(guān)。因此，保護(hù)損傷髓鞘或促進(jìn)髓鞘修復(fù)是改善SCZ 認(rèn)知障礙的潛在途徑。在體內(nèi)，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs），OLs 繼續(xù)分化成熟后圍繞神經(jīng)元軸突形成髓鞘。髓鞘形成和OLs 分化成熟是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的過程[7]，提高OLs 分化成熟是促進(jìn)髓鞘形成或修復(fù)的關(guān)鍵步驟[8]。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）A受體（γ-aminobutyric acid sub-type A receptors，GABAAR）能夠介導(dǎo)GABA 的多種生理性作用[9]。神經(jīng)元釋放的GABA 遞質(zhì)可通過GABAAR 調(diào)控OLs 分化及髓鞘形成過程[10]。阻斷GABAAR 能夠通過抑制OLs 分化導(dǎo)致髓鞘損傷[11]。然而，干預(yù)GABAAR 是否可通過調(diào)控OLs 分化進(jìn)而影響地卓西平馬來酸鹽（dizocilpine maleate，MK-801）腦損傷模型髓鞘的修復(fù)，目前尚不清楚。加波沙朵（gaboxadol，THIP）是GABAAR 特異性激動(dòng)劑，本研究以腹腔注射MK-801 介導(dǎo)的腦損傷模型小鼠為研究對(duì)象，利用行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法觀察THIP 對(duì)MK-801 腦損傷模型小鼠學(xué)習(xí)記憶、髓鞘損傷和OPCs 分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取36 只6～8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠，體質(zhì)量18～20 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（寧）2020-0001］。所有動(dòng)物自由飲水進(jìn)食，光照/黑暗周期為12 h，鼠房環(huán)境溫度為（22±1）℃。

1.1.2 主要試劑與材料 MK-801、THIP 均購自美國Sigma 公司，小鼠抗CC-1 抗體（MABC200）購自德國默克Calbiochem 公司，重組Anti-Olig2抗體（ab109186）購自Abcam（上海）貿(mào)易有限公司，兔抗GPR17 抗體（10136）購自美國Cayman Chemical 公司，小鼠抗β-Actin 抗體（TA-09）購自北京中杉金橋公司，山羊抗小鼠IgG H&L（ab150116）購自Abcam（上海）貿(mào)易有限公司；山羊抗兔IgG H&L（ab150077）購自Abcam（上海）貿(mào)易有 限公司；HRP Goat Anti-Rabbit IgG、HRP Goat Anti-Mouse IgG（A21020），購自武漢Abbkine公司；動(dòng)物行為學(xué)記錄分析系統(tǒng)購自西班牙Panlab 公司，H7650 型透射式電子顯微鏡購自日本日立公司。

1.1.3 MK-801 介導(dǎo)小鼠腦損傷模型的制備與分組 將36 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Blank 組）、MK-801 損傷 組（MK-801 組）、THIP 干預(yù)組（MK-801+THIP 組），每組12 只。MK-801 組小鼠連續(xù)14 d 腹腔注射MK-801［1.0 mg·（kg·d）-1］，Blank 組給予相同體積的生理鹽水處理，MK-801+THIP 組在制備模型的第8 天開始添加THIP［5.0 mg·（kg·d）-1］。

1.2 方法

1.2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 選擇安靜且密閉的環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將小鼠提前1 h 放入房間以適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)前6 d 為訓(xùn)練階段，每只小鼠每天訓(xùn)練4次，頭朝池壁按東、南、西、北方位分別將小鼠放入水池中，記錄小鼠找到平臺(tái)前的潛伏游泳時(shí)間與潛伏游泳距離，潛伏游泳時(shí)間越長、潛伏游泳距離越長，則反映小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷越嚴(yán)重，若超過1 min 小鼠未找到平臺(tái)，則將小鼠放到平臺(tái)上觀察周圍環(huán)境15 s，并將潛伏游泳時(shí)間設(shè)為1 min。實(shí)驗(yàn)第7 天為測(cè)試階段，在測(cè)試階段，將平臺(tái)撤出，將小鼠放進(jìn)水迷宮中1 min，記錄其跨越平臺(tái)次數(shù)，跨越平臺(tái)次數(shù)越少，則反映小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷越嚴(yán)重。

1.2.2 透射電子顯微鏡 使用2%戊二醛溶液將腦組織在4 ℃固定2 h，更換二鉀胂酸鈉緩沖液（0.1 mol·L-1）洗2 次，梯度乙醇脫水后環(huán)氧丙烷滲透2 次；不完全包埋液與環(huán)氧丙烷滲透各1 h，不完全包埋液滲透過夜；完全包埋液35 ℃溫箱浸泡6 h 后轉(zhuǎn)移至包埋板，42 ℃溫箱過夜后于60 ℃溫箱干燥48 h。完成組織包埋后修復(fù)、切片定位，在各組小鼠胼胝體相近區(qū)域隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行拍照，觀察髓鞘超微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 Western blot 蛋白印跡技術(shù) 用全蛋白提取試劑盒提取腦皮層蛋白，蛋白質(zhì)定量（BCA）法檢測(cè)蛋白濃度并統(tǒng)一定量后變性。150 V 恒壓條件下10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白（上樣量為30 μg/孔）；0.2 A 恒流條件下將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上（4 ℃）；5%脫脂牛奶封閉2 h；一抗（兔抗GPR17，1∶2 000；兔抗β-actin，1∶2 000）4 ℃孵育過夜；二抗（山羊抗兔，1∶10 000）室溫孵育1 h；添加ECL 混合發(fā)光液后上機(jī)曝光。用Image J 軟件分別測(cè)量并計(jì)算對(duì)應(yīng)的目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值，采用正常對(duì)照組灰度值比值均一化處理各組灰度值比值，每個(gè)樣本至少重復(fù)3 次。

1.2.4 免疫熒光染色 將石蠟切片60 ℃加熱2 h，依次入二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；0.01 mmol·L-1檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)15 min；山羊血清封閉30 min；加入一抗（小鼠抗CC-1，1∶200；兔抗Olig2，1∶200），4 ℃冰箱孵育過夜；加入熒光二抗（山羊抗兔，1∶400；山羊抗小鼠，1∶400）避光孵育1 h 后用含DAPI 封片劑于避光環(huán)境下封片。每組樣本的腦皮層相近區(qū)域選取6 個(gè)20 倍物鏡視野觀察并拍照、計(jì)數(shù)。比較各組胼胝體相近區(qū)域6 個(gè)20 倍物鏡視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8 軟件作圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組間兩兩比較采用Bonferroni 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THIP 可改善MK-801 損傷小鼠下降的學(xué)習(xí)記憶功能

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Blank 組相比，MK-801 組小鼠潛伏游泳時(shí)間延長、潛伏游泳距離延長、跨越平臺(tái)次數(shù)減少（P均＜0.05）；與MK-801 組相比，MK-801+THIP 組小鼠潛伏游泳時(shí)間縮短、潛伏游泳距離縮短、跨越平臺(tái)次數(shù)增多（P均＜0.05），見圖1。

圖1 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)THIP 對(duì)MK-801 損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

2.2 THIP 改善MK-801 損傷小鼠腦髓鞘超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡觀察胼胝體附近髓鞘超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，Blank 組內(nèi)髓鞘板層結(jié)構(gòu)致密完整，無局灶性溶解和水腫等病理變化；與Blank 組相比，MK-801 組小鼠腦髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂變形，板層結(jié)構(gòu)分離，出現(xiàn)局灶性溶解；在MK-801+THIP 組中，髓鞘局灶性溶解的情況明顯改善，板層清晰，結(jié)構(gòu)致密，形態(tài)完整，見圖2。

圖2 電鏡觀察THIP 對(duì)MK-801 損傷小鼠腦髓鞘超微結(jié)構(gòu)的影響（bar=1 000 nm）

2.3 THIP 增加MK-801 損傷小鼠腦內(nèi)成熟OLs的數(shù)量

各組小鼠胼胝體附近區(qū)域的熒光結(jié)果顯示，與Blank 組相比，MK-801 組小鼠CC-1+/Olig2+細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05）；與MK-801 組相比，MK-801+THIP 組小鼠CC-1+/Olig2+細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.05），見圖3。

圖3 免疫熒光檢測(cè)THIP 對(duì)MK-801 損傷小鼠腦內(nèi)成熟OLs 細(xì)胞數(shù)目的影響

2.4 THIP 降低MK-801 損傷小鼠腦內(nèi)GPR17蛋白表達(dá)量

GPR17 是OPCs 分化的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，GPR17表達(dá)越高意味著OPCs 分化為OLs 的能力越弱，相反，GPR17 表達(dá)越低意味著OPCs 分化為OLs的能力越強(qiáng)。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Blank組相比，MK-801 組小鼠GPR17 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.01）；與MK-801 組相比，MK-801+THIP 組小鼠GPR17 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.01），見圖4。

3 討論

N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體拮抗劑MK-801 介導(dǎo)腦損傷的動(dòng)物模型是目前精神疾病研究領(lǐng)域普遍認(rèn)可的SCZ 動(dòng)物模型，用于SCZ 發(fā)病機(jī)制和干預(yù)措施的研究[12]。在本研究中，水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，MK-801介導(dǎo)的腦損傷模型小鼠較正常小鼠潛伏游泳時(shí)間延長，潛伏游泳距離增加，跨越平臺(tái)次數(shù)減少，提示MK-801 組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損，與前期研究[13-14]結(jié)果一致。經(jīng)腹腔注射THIP 干預(yù)后，MK-801 損傷小鼠潛伏游泳時(shí)間和潛伏游泳距離縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)增加，提示THIP 可有效改善MK-801 腦損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。THIP 是一種有效且具有特異性的GABAAR 激動(dòng)劑，可以直接激活含有δ 亞基的突觸外GABAAR[15]，產(chǎn)生抑制性突觸后電流[16]。經(jīng)腹腔注射BIC 抑制GABAAR作用可加重腦損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶受損程度，也從反面證明激活GABAAR 對(duì)MK-801 介導(dǎo)的腦損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力具有改善作用[17]。

脫髓鞘和髓鞘再生障礙是SCZ 的重要發(fā)病機(jī)制之一，也是認(rèn)知障礙發(fā)生的重要原因，研究顯示，Cuprizone 誘導(dǎo)脫髓鞘的動(dòng)物模型可出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶力下降[18-19]，藥物促進(jìn)此模型腦內(nèi)髓鞘修復(fù)或減少髓鞘破壞可明顯改善學(xué)習(xí)記憶下降等認(rèn)知障礙行為[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)THIP干預(yù)可逆轉(zhuǎn)MK-801 損傷小鼠腦內(nèi)髓鞘板層結(jié)構(gòu)的破壞，由此可見，髓鞘保護(hù)很可能是THIP 改善SCZ 模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制之一。同時(shí)也有學(xué)者[21]認(rèn)為，GABAAR 通過調(diào)控海馬神經(jīng)可塑性變化來改善認(rèn)知損傷。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中成熟OLs 包裹神經(jīng)元軸突形成一個(gè)多層的、致密的同心圓結(jié)構(gòu)即髓鞘。成熟OLs 數(shù)量增多是髓鞘形成或修復(fù)必不可少的條件。CC-1 存在于成熟OLs 的細(xì)胞體中，與Olig2 雙標(biāo)后可以標(biāo)記成熟的OLs[22]。本研究采用免疫熒光檢測(cè)CC-1 與Olig2 雙標(biāo)的陽性細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示腦損傷模型小鼠腦內(nèi)OLs（CC-1+/Olig2+）數(shù)量較正常小鼠減少。研究[23-24]顯示，MK-801 與OPCs 的分化密切相關(guān)，MK-801可通過能量代謝過程影響OLs 存活，也可通過mTOR 信號(hào)通路阻斷OPCs 分化和髓鞘形成。也有學(xué)者[25]使用RNA 干擾技術(shù)特異性敲低OPCs上NMDAR 的GluN1 亞基表達(dá)來抑制OPCs 的分化，導(dǎo)致成熟OLs 減少。THIP 干預(yù)可增加腦損傷模型小鼠腦內(nèi)成熟OLs 數(shù)量，說明THIP 可能通過促進(jìn)OLs 分化成熟或減少成熟OLs 的丟失來保護(hù)髓鞘損傷。GPR17 是一種G 蛋白偶聯(lián)膜受體，在OPCs 向OLs 分化過程中，GPR17 高表達(dá)可抑制晚期OPCs 進(jìn)一步分化成熟，進(jìn)而導(dǎo)致髓鞘形成障礙，OPCs 分化晚期GPR17 的缺失是使OLs 完成最終成熟的必要條件[26]。本研究結(jié)果顯示，腦損傷模型小鼠腦內(nèi)GPR17 表達(dá)量較對(duì)照組小鼠增加，提示MK-801 介導(dǎo)的腦損傷模型小鼠OPCs 分化受抑制，導(dǎo)致最終成熟的OLs（CC-1+/Olig2+）數(shù)量減少，與相關(guān)報(bào)道[27]相符。THIP 干預(yù)可逆轉(zhuǎn)MK-801 誘導(dǎo)小鼠腦內(nèi)GPR17 的表達(dá)上調(diào)，意味著THIP 可通過促進(jìn)OPCs 向OLs 分化，影響最終成熟的OLs 數(shù)量，有益于髓鞘的修復(fù)。但截至目前，我們依然不清楚THIP 是否通過對(duì)抗MK-801 誘導(dǎo)的OLs 損傷/死亡，繼而減少髓鞘的破壞，是否存在這種可能性，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)THIP 干預(yù)腦損傷模型小鼠可通過增強(qiáng)OPCs 分化作用促進(jìn)髓鞘修復(fù)，由此改善腦損傷模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，從而為THIP 改善腦損傷認(rèn)知障礙提供新機(jī)制。