唐當柱 徐婭玲 楊瓊英 楊艷 孟慶婷

摘要：目的 考察仙鶴草正丁醇提取部位抗炎的活性部位，并探討其作用機制和物質(zhì)基礎(chǔ)。方法 采用花生四烯酸、角叉菜膠復制大鼠足趾腫脹模型，蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠足部組織中COX-1、COX-2、5-LO的含量，探討仙鶴草正丁醇提取部位的抗炎作用；采用大孔樹脂對仙鶴草正丁醇提取部位進行分離，采用二甲苯致小鼠耳腫脹實驗對仙鶴草正丁醇提取部位的不同洗脫部位（水洗脫部位、30%乙醇洗脫部位、60%乙醇洗脫部位、90%乙醇洗脫部位）進行抗炎有效部位篩選；采用花生四烯酸、角叉菜膠復制小鼠足趾腫脹模型，ELISA法檢測小鼠血液IL-1β、PGE2、LTB4、TNF-a、IL-10的含量，對仙鶴草正丁醇提取部位的90%乙醇洗脫部位進行抗炎機制研究并進行化學成分分離。結(jié)果 仙鶴草正丁醇提取部位能夠減少AA、角叉菜膠誘導的大鼠足趾腫脹度，降低AA、角叉菜膠誘導的大鼠足趾組織中COX-1、COX-2、5-LO的表達；仙鶴草90%乙醇洗脫部位能抑制小鼠耳腫脹度以及足趾腫脹度，降低IL-1β、TNF-a、PGE2的表達，升高IL-10的表達，但對LTB4的表達未見明顯抑制作用；分離得到8個化合物，鑒定了5個化合物的結(jié)構(gòu)，分別為：科羅索酸、槲皮素、蘆丁、胡蘿卜苷、β-谷甾醇。結(jié)論 （1）仙鶴草正丁醇提取部位可通過抑制COX和5-LO兩條途徑發(fā)揮抗炎作用。（2）仙鶴草正丁醇提取部位的90%乙醇洗脫部位通過抑制COX途徑從而降低致炎因子PGE2、IL-1β、TNF-a的表達、升高抗炎因子IL-10的表達實現(xiàn)抗炎，但對5-LO途徑誘導的LTB4未見明顯抑制作用。（3）已鑒定的5個化合物中，科羅索酸、槲皮素和蘆丁均有文獻報道其具備抗炎活性，表明仙鶴草正丁醇提取部位的90%乙醇洗脫部位是由科羅索酸、槲皮素和蘆丁等共同發(fā)揮抗炎作用。

關(guān)鍵詞：仙鶴草；正丁醇提取部位；抗炎；化學成分

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2023）04-00086-10

Study on the Anti-inflammatory Effect and Chemical Compositions ofN-butanol Extract from Hairyvein Agrimony

TANG Dang-zhu^1，2， XU Ya-ling²， YANG Qiong-ying²， YANG Yan²， MENG Qing-ting²

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;2. Kunming Health Vocational College， Kunming 650101， China）

【Abstract】Objective： To study the anti-inflammatory activity site of n-butanol extract from Hairyvein Agrimony， and to explore its mechanism of action and material basis. Methods： Arachidonic acid and carrageenan were used to duplicate the rat model of toe swelling. The contents of COX-1， COX-2 and 5-LO in the foot tissues of rats were detected by Western Blotting， and the anti-inflammatory effect of n-butanol extract from the herb were studied. The extract sites of n-butanol were separated by macroporous resin. The experiment of ear swelling induced by xylene in mice was conducted to screen the anti-inflammatory effective site from different elution parts （water elution part， 30% ethanol elution part， 60% ethanol elution part， 90% ethanol elution part） of n-butanol extract from Hairyvein Agrimony. Arachidonic acid and carrageenan were used to duplicate a mouse model of toe swelling. The contents of IL-1β， PGE2， LTB4， TNF-a and IL-10 in the blood of mice were determined by ELISA. The anti-inflammatory mechanism of 90% ethanol-eluting part of n-butanol extract was studied and their chemical components were separated. Results： The n-butanol extract from Hairyvein Agrimony could reduce the toe swelling of rats induced by AA and carrageenan， and reduce the expression of COX-1， COX-2 and 5-LO in the toe tissue of the rats induced by AA and carrageenan. The 90% ethanol elution part of Hairyvein Agrimony could inhibit the ear swelling and toe swelling in mice， decrease the expressions of IL-1β， TNF-a and PGE2， and increase the expression of IL-10， but did not significantly inhibit the expression of LTB4. 8 compounds were isolated and 5 compounds were identified： corosolic acid， quercetin， rutin， carotenoside and β-sitosterol. Conclusions： （1） The n-butanol extract can exert anti-inflammatory effect through the inhibition of COX and 5-LO. （2） The 90% ethanol eluting fraction of n-butanol extract can reduce the expressions of inflammatory factors PGE2， IL-1β， TNF-a and increase the expression of anti-inflammatory factor IL-10 through inhibiting COX pathway to achieve anti-inflammatory effect， but does not show significant inhibitory effect on LTB4 induced by 5-LO pathway. （3） Among the 5 identified compounds， corosolic acid， quercetin and rutin have been reported to have anti-inflammatory activities， indicating that 90% of the ethanol-elution parts of n-butanol extract from Hairyvein Agrimony are composed of corosolic acid， quercetin and rutin.

【Key words】Hairyvein Agrimony; N-Butanol Extraction Site; Anti-Inflammatory; Chemical Composition

炎癥（inflammation）是指具有血管系統(tǒng)功能的生物活體組織應對各種損傷因子刺激所產(chǎn)生的防御性反應，主要表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛及功能障礙等癥狀，其參與心腦血管疾病、腫瘤、人體感染變態(tài)反應等多種人類重大疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，炎癥發(fā)生后如果得不到及時治療，可能引發(fā)一系列級聯(lián)反應^［1-2］。臨床上常用抗炎藥主要為非甾體類抗炎藥（non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs）和甾體類抗炎藥（steroid anti-inflammatory drugs，SAIDs）^［3］。NSAIDs通過抑制花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝的COX途徑（COX-1和COX-2）從而減少炎癥因子前列腺素（prostaglandins，PGs）的釋放而發(fā)揮抗炎作用^［4-5］。目前認為COX-1為機體所固有，維持機體的一般生理功能；COX-2為誘導形成，在過量表達后會引起炎癥反應^［6］。由于非選擇性COX抑制劑對COX-1抑制作用較強，易引發(fā)胃潰瘍、胃出血、肝臟不同程度損傷等不良反應，認為選擇性COX-2抑制劑具有重要的臨床價值^［7-8］。但是，近年有服用選擇性COX-2抑制劑的人群患心肌梗死、腦卒中、血栓等風險增高的報道而相繼撤市^［9-10］。SAIDs為激素類藥物，此類藥物雖抗炎作用強，但易引起糖、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝紊亂，并誘發(fā)糖尿病、骨質(zhì)疏松，加重消化性潰瘍，導致傷口難以愈合等不良反應^［11］。因此，尋找活性強、不良反應少的抗炎藥物成為現(xiàn)代中藥抗炎研究的熱點?！侗静菥V目拾遺》就有仙鶴草治療疔腫、肺癰、乳癰等與炎癥相關(guān)疾病的記載，臨床也常用于滴蟲性陰道炎、口腔炎、腸炎、盆腔炎、原發(fā)性腎小球腎炎等各類炎癥的治療^［12-21］。雖然近年對仙鶴草的化學成分、抗炎作用等開展了廣泛的研究，但作用機制、物質(zhì)基礎(chǔ)仍不夠明確。本研究以藥效學與化學研究相結(jié)合的方法，以尋求抗炎活性物質(zhì)為目標，基于課題組前期發(fā)現(xiàn)仙鶴草正丁醇提取部位具有較強的抗炎活性的基礎(chǔ)上，從與急性炎癥反應密切相關(guān)的COX和5-LO兩條途徑探討其抗炎作用機制，進行抗炎作用藥效及物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠，SPF級（20±2）g，合格證號：SCXK（川）2020-030；SD大鼠（Sprague Dawley，SD），SPF級、雄性，（200±20）g，合格證號：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 藥物及試劑 仙鶴草（云南金發(fā)藥業(yè)有限公司，批號為161102，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學張潔副教授鑒定）；地塞米松（上海麥克林生化科技有限公司，批號為C10113013）；二甲苯（天津化學試劑有限公司，批號為20150301）；乙酸乙酯（天津市大茂化學試劑廠，批號為20190301）；正丁醇、甲醇（天津市風船化學試劑科技有限公司，批號分別為20180830、20170502）；色譜純甲醇（美國SigmaAldrich公司，批號為I1082407013）；色譜純甲酸（美國Fisher公司，批號為20180901）；槲皮素（中國食品藥品鑒定所，批號為100081-201610）；伊文思藍、角叉菜膠、花生四烯酸（美國sigma公司，批號分別為MKCB2532V、SLBW8685、BSCV9532）；地塞米松（大連美侖生物公司，批號為C11508350）；COX-1、COX-2、Beta Actin Rabbit PolyAb、靈敏ECL化學發(fā)光檢測試劑盒（美國Proteintech公司，批號分別為00058753、00100441、00102209、B21202109）；PageRuler Prestained Protein Ladder（Thermo Fisher Scientific公司，批號為01031956）；Anti-5 Lipoxygenase（英國abcam公司，批號為GR3313192-6）；Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（Affinity公司，批號為56j9958）；二硫蘇糖醇（DTT）、乙酸鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、過硫酸銨（APS）、10%SDS、四甲基乙二胺、甘氨酸、吐溫-20（生工生物工程（上海）股份有限公司，批號分別為G717BA0007、CB23BA0025、G617BA0002、G603BA 1017、G731KA6476、0503SJ09、E811BA0001、G506BA 0005）；十二烷基硫酸鈉（SDS）（德國Biofroxx公司，批號為EZ6789B129）；溴酚藍（美國MP Biomedicals公司，批號為MR29664）；30%丙烯酰胺、1M Tris-HCL緩沖液、1.5M Tris-HCL緩沖液、高效RIPA組織/細胞快速裂解液（Solarbio公司，批號分別為202111027、20211014、20211011、20210416）；脫脂牛奶（美國BD公司，批號為7152571）；PMSF（100mM）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號分別為ST506-2、042820200814）；TEMED（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號為0412A21）；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白三烯B4（LTB4）、前列腺素E2（PGE2）、白細胞介素10（IL-10）ELISA試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號均為202111）。

1.3 藥物及試劑配置 地塞米松（20 mg/kg）：稱取地塞米松10 mg加入生理鹽水2 mL，完全溶解后用生理鹽水定容至20 mL，4 ℃保存。

角叉菜膠：角叉菜膠以生理鹽水溶解，濃度為1%，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

花生四烯酸：將規(guī)格為50 mg/支的AA加入濃度為100 mmol/L的Na₂CO₃溶液10 mL，混合均勻后AA的濃度為5 mg/mL，將其進行分裝，保存于-20 ℃的冰箱中，實驗當天稀釋到1 mg/mL，采用的稀釋溶液為100 mmol/L 的Na₂CO₃。

仙鶴草正丁醇提取部位（1 g/kg）：稱取仙鶴草正丁醇提取部位適量，用純化水配置濃度為0.05 g/mL。

仙鶴草90%醇提取部位（0.25 g/kg）：稱取仙鶴草90%醇提取部適量，用雙蒸水配置濃度為0.0125 g/mL。

仙鶴草60%醇提取部位（0.22 g/kg）：稱取仙鶴草60%醇提取部位適量，用雙蒸水配置濃度為0.011 g/mL。

仙鶴草30%醇提取部位（0.07 g/kg）：稱取仙鶴草仙鶴草30%醇提取部位適量，用雙蒸水配置濃度為0.0035 g/mL。

仙鶴草水洗脫部位（0.19 g/kg）：稱取仙鶴草水洗脫部位適量，用雙蒸水配置濃度為0.0095 g/mL。

1.4 實驗儀器 RE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（山東博科科學儀器有限公司）；SCIENTZ-18N型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Victor Nivo 3S酶標儀（PE公司）；1056034型足趾容積測量儀（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司）；Mini-PROTEAN Tetr小型垂直電泳槽、通用型電泳儀電源、小型濕轉(zhuǎn)模塊（美國伯樂公司）；Tanon-5200Multi型凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；1260 Infinity II型高效液相色譜儀（Agilent公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 仙鶴草正丁醇不同提取部位的制備 取仙鶴草5 kg，以10倍量70%乙醇80℃水浴回流提取3次，第一次提取2 h，其余提取1.5 h，將3次提取液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，水浴揮發(fā)成膏狀、冷凍干燥得到醇提取部位501.50 g；用水溶解，依次用等體積的乙酸乙酯、正丁醇萃取6次，得到水提取部位243.08 g，正丁醇提取部位124.52 g，乙酸乙酯提取部位126.02 g。

仙鶴草正丁醇提取部位（62.13 g）采用大孔樹脂進行初步分離，分別采用純化水、30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇進行梯度洗脫并濃縮，分別得到得仙鶴草正丁醇提取部位水洗脫部位12.22 g，30%乙醇洗脫部位4.51 g，60%乙醇洗脫部位13.75 g，90%乙醇洗脫部位15.70 g。

1.5.2 仙鶴草正丁醇提取部位的抗炎作用研究

1.5.2.1 仙鶴草正丁醇提取部位對AA、角叉菜膠致大鼠足趾腫脹度的影響 取健康SD大鼠，將其隨機分成8組，10只/組，依次是模型組（生理鹽水組、Na₂CO₃溶液組、AA組、角叉菜膠組），地塞米松組、仙鶴草正丁醇提取部位（花生四烯酸）組，地塞米松組、仙鶴草正丁醇提取部位（角叉菜膠）組，灌胃給藥2 h后，分別用濃度為0.1 mL的AA（1 mg/mL）或濃度為1%的角叉菜膠注射至大鼠足趾中致炎，以大鼠足趾腫脹體積（左后爪體積減右后爪體積）為炎癥反應強度的評價指標；在注射后的1 h、2 h、3 h和4 h分別將大鼠鼠爪浸入裝好純化水的足趾容積測量儀中，為提高測量結(jié)果的精度，要保證大鼠鼠爪每次浸入液面的深度一致，待測量結(jié)束后，取被處死大鼠的足部組織稱重備用。藥物對鼠爪水腫的抑制率按下面公式計算^［22-23］。

抑制率%=［（模型組鼠爪水腫體積-給藥組鼠爪水腫體積）/模型組鼠爪水腫體積］×100%

1.5.2.2 蛋白免疫印跡法（Western Blot，WB）測定仙鶴草正丁醇提取部位大鼠足部組織中COX-1、COX-2、5-LO的含量 取2.2.1稱重的SD大鼠足部組織，冰上剪碎、裂解、勻漿，4℃下14000 rpm/min離心5 min，上清液用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度；各組蛋白各15 μg用5%濃縮膠、8%分離膠電泳（70 V電泳30 min、110 V電泳5 0min），以200 mA、45 min將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗（COX-1 1∶500，COX-2 1∶1000，5-LO 1∶1000）4℃封閉過夜；二抗（Goat Anti-Rabbit 1∶3000）室溫孵育1 h，靈敏ELC顯色后成像；內(nèi)參為beta Actin（1∶3000）；采用Image J軟件對進行圖像處理。

1.5.3 仙鶴草正丁醇提取部位不同洗脫部位的抗炎活性篩選

1.5.3.1 仙鶴草正丁醇提取部位不同洗脫部位對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 選擇健康昆明種小鼠，雌雄各半，20只/組，隨機分為模型組、陽性藥組（地塞米松，20 mg/kg）、仙鶴草組（水洗脫部位、30%乙醇洗脫部位、60%乙醇洗脫部位、90%乙醇洗脫部位）。給藥1 h后，每只小鼠均立即用移液器精密吸取10 μL二甲苯，并將其均勻涂布于各鼠右耳的上、下兩面，左耳不涂作自身對照；于涂耳30 min后，處死小鼠，將兩耳沿耳廓基線剪下，于左右耳對稱部位采用6 mm直徑打孔器分別打下兩耳耳片，用十萬分之一分析天平稱取耳片的質(zhì)量，并計算小鼠鼠耳腫脹度，腫脹度=（右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量）/左耳質(zhì)量×100%^［24］。

1.5.3.2 仙鶴草正丁醇提取部位90%洗脫部位對AA、角叉菜膠致小鼠足趾腫脹的影響 選取健康昆明種小鼠，雌雄各半，隨機分為8組，每組20只，分別為模型組（AA、角叉菜膠）、地塞米松組、仙鶴草正丁醇提取部位90%洗脫部位組，于灌胃給藥30 min后分別用0.1 mL的AA（1 mg/mL）或1%角叉菜膠注射至小鼠足趾組織中致炎，用游標卡尺精確測定小鼠的足趾厚度，以小鼠足趾腫脹厚度作為炎癥反應強度的評估指標，小鼠足趾腫脹厚度以左后爪厚度減右后爪厚度計算；注射后1 h、2 h、3 h和4 h各時間點用游標卡尺測定小鼠鼠爪足趾厚度，保持每次測量位置一致，待測量結(jié)束后處死小鼠，取血液待用。根據(jù)測量厚度的增加值，作為足趾腫脹度。藥物對鼠爪水腫的抑制率按下面公式計算^［22-24］。

抑制率（%）=（模型組鼠爪腫脹度-給藥組鼠爪腫脹度）/模型組鼠爪腫脹度×100%

1.5.3.3 ELISA檢測小鼠血液中PGE2、LTB4、TNF-a、IL-1β、IL-10的含量 各組小鼠在注射AA或角叉菜膠4h后，取血，使用超低溫高速離心機在4℃下，以3000 r/min離心10 min，獲取血漿上清液，向酶標板中依次加入標準蛋白樣品、待測上清液和抗原，按試劑盒使用說明書步驟完成操作，測定OD值，根據(jù)OD值繪制標準蛋白標準曲線，按照標準曲線計算上清液中PGE2、LTB4、TNF-a、IL-1β和IL-10的含量^［7］。

1.5.4 仙鶴草正丁醇提取部位90%乙醇洗脫部位的分離純化 取90%乙醇洗脫部位（15.70 g），采用硅膠以干法上樣進行分離，氯仿-甲醇梯度洗脫（50∶1至0∶100），經(jīng)TLC檢測，分為Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D四個分段。

Fr.A部分經(jīng)氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫（50∶1至0∶100），得到Fr.A-1和Fr.A-2。Fr.A-1依次采用硅膠以環(huán)己烷-乙酸乙酯（30∶1至1∶1）、葡聚糖凝膠LH-20以氯仿-甲醇（1∶1）反復洗脫，重結(jié)晶后得化合物1（0.5 mg）和化合物2（0.4 mg）。Fr.A-2經(jīng)氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫（50∶1至0∶100），分為Fr.A-2-1、Fr.A-2-2兩部分，F(xiàn)r.A-2-1經(jīng)氯仿-甲醇（100∶1至0∶100）反復洗脫，分離純化并重結(jié)晶得化合物3（0.7 mg）；Fr.A-2-2經(jīng)氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度反復洗脫，分離純化得化合物4（12 mg）和化合物5（8 mg）。

Fr.B部分經(jīng)氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，分為Fr.B-1和Fr.B-2兩部分。Fr.B-1經(jīng)氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫（50∶1至0∶100），葡聚糖凝膠LH-20（氯仿∶甲醇=1∶1）反復等度洗脫，分離純化并重結(jié)晶得化合物6（6.3 mg）。

Fr.C部分經(jīng)氯仿-甲醇系統(tǒng)反復梯度洗脫，分為Fr.C-1、Fr.C-2、Fr.C-3三部分。

Fr.D部分采用硅膠經(jīng)氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫（50∶1至0∶100），分為Fr.D-1、Fr.D-2、Fr.D-3三部分。Fr.D-1采用硅膠經(jīng)氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫（50∶1至0∶100），再用葡聚糖凝膠LH-20以50%甲醇-水反復洗脫，得化合物7（0.3 mg）。Fr.D-3部分采用硅膠經(jīng)氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，再用葡聚糖凝膠LH-20以50%氯仿-甲醇反復等度洗脫，分離純化得化合物8（4.1 mg）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad prism軟件進行統(tǒng)計分析，檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x?±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 仙鶴草正丁醇提取部位對花生四烯酸、角叉菜膠致大鼠足趾腫脹度的影響 與AA組、角叉菜膠組比較，地塞米松組、仙鶴草正丁醇提取部位組能夠抑制AA、角叉菜膠誘導的大鼠足趾腫脹度，差異有統(tǒng)計學意義（^***P<0.001、^**P<0.01或^*P<0.05）。結(jié)果如表1和表2所示。

2.2 仙鶴草正丁醇提取部位對大鼠足部組織中COX-1、COX-2、5-LO含量的影響 與AA組、角叉菜膠組比較，地塞米松、仙鶴草正丁醇提取部位能夠減少AA、角叉菜膠誘導的大鼠足趾組織中COX-1、COX-2、5-LO 的表達，差異有統(tǒng)計學意義（^***P<0.001、^**P<0.01或^*P<0.05）。結(jié)果如表3和表4所示。

注：與Na₂CO₃組比較，^###P<0.001；與AA組比較，^**P<0.01

2.3 仙鶴草正丁醇提取部位不同洗脫部位對二甲苯致小鼠耳腫脹度的影響 與模型組比較，地塞米松對照組、仙鶴草90%乙醇洗脫部位組均能抑制小鼠耳腫脹度，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。如表5所示。

2.4 仙鶴草正丁醇提取部位90%洗脫部位對角叉菜膠、AA致小鼠足趾腫脹度的影響 與模型組比較，地塞米松、仙鶴草90%乙醇洗脫部位能抑制角叉菜膠、AA小鼠足趾腫脹度，差異有統(tǒng)計學意義（^***P<0.001、^**P<0.01或^*P<0.05）。結(jié)果如表6和表7所示。

2.5 仙鶴草正丁醇提取部位90%洗脫部位對小鼠血液中 PGE2、LTB4、TNF-a、IL-1β、IL-10含量的影響 與模型組（角叉菜膠）比較，地塞米松組、仙鶴草90%乙醇洗脫部位組均能抑制角叉菜膠、AA所誘導的小鼠足趾腫脹模型中IL-1β、TNF-a、PGE2的含量，能顯著升高IL-10水平，差異有統(tǒng)計學意義（^***P<0.001、^**P<0.01或^*P<0.05）；但90%乙醇洗脫部位對LTB4未見抑制作用，如表8所示。

2.6 仙鶴草正丁醇提取部位90%乙醇洗脫部位化合物的結(jié)構(gòu)解析 對仙鶴草正丁醇提取部位90%乙醇洗脫部位的化學成分進行了分離，共分離得到8個化合物，采用薄層色譜法、高效液相色譜法、核磁共振技術(shù)對分離得到的化合物進行結(jié)構(gòu)解析，共鑒定5個化合物，分別為β-谷甾醇（β-Sitosterol）、胡蘿卜苷（Daucosterol）、科羅索酸（Corosolic acid）、槲皮素（3，3′，4′，5，7-Pentahy-droxyflavone）、蘆?。?，3′，4′，5，7-Pentahydroxy-flavon3-（o-rhamnosylglucoside）］。

化合物1為無色針狀結(jié)晶，溶于甲醇，mp.136.7～ 136.9 ℃。化合物1與β-谷甾醇經(jīng)三種TLC展開系統(tǒng)展開、10%硫酸-乙醇溶液顯色，于105 ℃烘烤后呈現(xiàn)紫色斑點且Rf值一致。其薄層鑒別與對照品相同，確定為β-谷甾醇（β-Sitosterol）。

化合物2為白色粉末，溶于甲醇，mp.271.1～271.5℃?；衔?與胡蘿卜苷經(jīng)三種TLC展開系統(tǒng)展開、10%硫酸-乙醇溶液顯色，于105 ℃烘烤后呈現(xiàn)紫色斑點且Rf值一致。其薄層鑒別與對照品相同，確定為胡蘿卜苷（Daucosterol）。

化合物5為白色粉末，溶于甲醇，mp.233.2～234.5℃。10%硫酸-乙醇溶液顯色，于105 ℃烘烤后呈現(xiàn)紫紅色斑點。¹H-NMR（500 MHz，MeOD）中δ_H1.183（s）、1.157（s）、1.116（s）、1.008（s）、0.960（s）、0.841（s）、0.800（s）七個甲基信號。¹³C-NMR（500 MHz，MeOD）中有30個碳信號，其中δ_C181.68提示C-28為羧酸，δ_C139.76（s）和126.67（d）為C-12（13）位形成雙鍵，δ_C84.44（d）、69.49（d）提示C-3、C-2位被羥基取代且為3-β-OH、2-α-OH的反式取代模式，¹H-NMR譜中δ_H5.22（1H，dt）、3.61（1H，d），也證實C-2、C-3位是反式羥基取代，故確定化合物5位為2-α，3-β-二羥基，C-12（13）雙鍵，C-28位羧酸的熊果烷型三萜，δ_C48.26（C-1）、69.49（C-2）、84.44（C-3）、40.80（C-4）、56.65（C-5）、19.52（C-6）、34.21（C-7）、40.00（C-8）、48.10（C-9）、39.18（C-10）、24.43（C-11）、126.67（C-12）、139.76（C-13）、43.29（C-14）、29.15（C-15）、25.29（C-16）、48.10（C-17）、54.34（C-18）、40.40（C-19）、40.49（C-20）、31.76（C-21）、38.09（C-22）、29.31（C-23）、17.80（C-24）、17.20（C-25）、17.63（C-26）、24.08（C-27）、181.68（C-28）、17.50（C-29）、21.56（C-30），經(jīng)上所述，鑒定為科羅索酸（Corosolic acid），波譜數(shù)據(jù)與文獻［25-27］數(shù)據(jù)相符合。

化合物6為黃色粉末，溶于甲醇。化合物6與槲皮素對照品經(jīng)三種TLC展開系統(tǒng)展開、10%硫酸-乙醇溶液顯色，于105℃烘烤后呈現(xiàn)黃色斑點且Rf值一致。精密稱定槲皮素對照品，甲醇溶解、0.45 μL微孔過濾制成0.533 mg/mL的槲皮素溶液；精密稱定化合物6，甲醇溶解、0.45 μL微孔過濾制成每1 mL含0.551 mg的化合物6溶液；采用Agilent Poroshell 120 C18柱（150 mm×6 mm，4 μm）、VWD檢測器進行HPLC比對，以1.0%甲酸-甲醇（85∶15）為流動相、1.0 mL/min的流速等度洗脫，于375 nm波長處檢測，其出峰時間、保留時間吻合。其薄層鑒別和HPLC與對照品相同，確定為槲皮素（3，3′，4′，5，7-Pentahy-droxyflavone）。

化合物8為淡黃色粉末，溶于甲醇?；衔?與蘆丁對照品經(jīng)三種TLC展開系統(tǒng)展開、10%硫酸-乙醇溶液顯色，于105 ℃烘烤后呈現(xiàn)黃色斑點且Rf值一致。精密稱定蘆丁對照品，用甲醇溶解，配成0.495 mg/mL的蘆丁溶液，搖勻，0.45 μL微孔濾膜過濾，得對照品溶液；精密稱定化合物8，甲醇溶解、0.45 μL微孔過濾制成0.501 mg/mL的化合物8溶液；采用Agilent Poroshell 120 C18柱（150 mm×6 mm，4μm）、VWD檢測器進行HPLC比對，以1.0%甲酸-甲醇（40∶60）為流動相、1.0mL/min的流速等度洗脫，于320 nm波長處檢測，其出峰時間、保留時間吻合；薄層鑒別和HPLC與對照品相同，確定為蘆丁［3，3′，4′，5，7-Pentahydroxy-flavon3-（o-rhamnosylglucoside）］。

3 討論

AA為含二十個碳的不飽和脂肪酸，存在于細胞膜磷脂分子中，當機體受到致炎因子刺激時，機體的細胞膜磷脂會被磷脂酶A2（PhospholipaseA2，PLA2）催化而釋放AA，AA會通過以下兩種代謝途徑啟動急性炎癥反應：一是通過COX的催化生成PGs，PGs會使血管擴張、增加毛細血管的通透性，從而引起急性炎癥；二是通過5-LO催化AA生成LTs；LTs中LTB4作用最強，介導白細胞激活和炎癥細胞的遷移，并釋放活性氧自由基和溶酶體酶，進而加重炎癥反應、引起組織損傷、導致局部組織水腫等^［28-32］。AA和角叉菜膠是常用的炎癥誘導劑，分別通過AA代謝的5-LO途徑和COX途誘導炎癥反應^［33-34］。在各類炎癥進程中，還可見白細胞介素1（Interleukin-1，IL-1）、TNF-a等致炎因子表達升高等，促進抗炎因子IL-10的表達升高；IL-10可抑制單核細胞表面主要組織相容性抗原Ⅱ（ClassⅡmajor histocompatibilitycomplex，MHCⅡ）的表達，抗原呈遞作用降低，T淋巴細胞活性減弱，炎性細胞的激活、遷移和粘附及炎癥因子的合成與釋放均受到抑制^［35-37］。

課題前期研究表明，仙鶴草抗炎活性成分主要集中在其正丁醇提取部位，為進一步定位其抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，本部分對正丁醇提取部位進行初步的抗炎機制進行研究，研究結(jié)果顯示，仙鶴草正丁醇提取部位能夠抑制AA和角叉菜膠誘導的大叔足趾腫脹體積，能夠降低COX-1、COX-2、5-LO的含量，提示仙鶴草正丁醇提取部位對兩條炎癥途徑均有抑制作用，故采用D101大孔樹脂對仙鶴草正丁醇提取部位進行分離，分別得到仙鶴草的水洗脫部位、30%乙醇洗脫部位、60%乙醇洗脫部位和90%乙醇洗脫部位，對上述四個部位采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型篩選仙鶴草正丁醇提取部位的抗炎有效部位。結(jié)果顯示，仙鶴草90%乙醇洗脫部位能抑制小鼠耳腫脹度，提示仙鶴草90%醇洗脫部位可能是仙鶴草正丁醇的抗炎作用的有效部位。因此本部分采用角叉菜膠、AA致小鼠足趾腫脹模型對仙鶴草正丁醇提取部位90%洗脫部位的抗炎活性進行篩選，并測定小鼠血液中PGE2、TLB4、TNF-a、IL-1β、IL-10的水平。結(jié)果顯示，仙鶴草90%乙醇洗脫部位能抑制小鼠足趾腫脹度；能顯著降低小鼠血液中PGE2、TNF-a、IL-1β的表達，升高抗炎因子IL-10的表達，但對TLB4無影響；提示仙鶴草正丁醇提取部位90%醇洗脫部位可抑制COX途徑從而降低PGE2的表達，降低致炎因子TNF-a、IL-1β的表達，升高抗炎因子IL-10的表達，而發(fā)揮抗炎作用；但對5-LO途徑的LTB4未見明顯抑制作用。

結(jié)合藥理實驗研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草是由多組分協(xié)同而發(fā)揮抗炎作用，其正丁醇提取部位可同時抑制COX和5-LO途徑而發(fā)揮抗炎作用；但仙鶴草正丁醇提取部位的90%乙醇洗脫部位主要通過抑制COX途徑實現(xiàn)抗炎；表明在對仙鶴草正丁醇提取部位進行組分初分離時，存在具有抗炎活性的組分不在90%洗脫部位，可能與仙鶴草正丁醇提取部位經(jīng)D101大孔樹脂洗脫后，抑制5-LO途徑的成分未富集于某一洗脫部位，而導致未顯現(xiàn)出對5-LO途徑的抑制作用。對仙鶴草正丁醇提取部位90%乙醇洗脫部位進行成分分離并鑒定后，發(fā)現(xiàn)仙鶴草正丁醇提取部位90%乙醇洗脫部位含有已被廣泛報道具有抗炎活性的科羅索酸、槲皮素和蘆丁，表明仙鶴草正丁醇提取部位90%乙醇洗脫部位是由多種化合物共同發(fā)揮抗炎作用。

4 小結(jié)

仙鶴草正丁醇提取部位可抑制COX和5-LO途徑實現(xiàn)抗炎，而仙鶴草正丁醇提取部位的90%醇洗脫部位可抑制COX途徑從而減少PGE2的合成，降低TNF-a、IL-1β的表達，升高IL-10的表達，而發(fā)揮抗炎作用，但對5-LO途徑合成的LTB4未見明顯抑制作用。

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（收稿日期：2022-07-28）