QuECHERS結(jié)合LC-MS/MS檢測(cè)動(dòng)物源食品中的9種β-受體激動(dòng)劑

王蘇樂(lè) 海娜

β-受體激動(dòng)劑是一類動(dòng)物興奮劑，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、加速脂肪分解等生理作用，但卻會(huì)嚴(yán)重影響畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，食用β-受體激動(dòng)劑污染的食物可能會(huì)引起食物中毒，甚至侵害人體的心血管及神經(jīng)系統(tǒng)。因此，β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)十分重要。

β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)手段多樣，常見(jiàn)方法包括免疫分析法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中，免疫分析法檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便，但其結(jié)果假陽(yáng)性率高；毛細(xì)管電泳法操作簡(jiǎn)單，但分離效果不好；液相色譜法能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離，但定性不準(zhǔn)確、特異性差；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法通常需要對(duì)樣品衍生化，步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)。相較以上方法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、抗干擾強(qiáng)和定性準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)階段β-受體激動(dòng)劑獸藥殘留檢測(cè)的首選方法，應(yīng)用十分廣泛。不過(guò)，其前處理主要依賴固相萃取法凈化，操作復(fù)雜、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，影響實(shí)驗(yàn)效率。

QuEChERS前處理方法具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠、安全等特點(diǎn)，是近年來(lái)興起并快速得到商業(yè)化應(yīng)用的一種方法。本實(shí)驗(yàn)在已有研究基礎(chǔ)上，用QuEChERS法進(jìn)行樣品前處理，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了處理時(shí)間，降低了實(shí)驗(yàn)成本，豐富了樣品類型，為動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑批量化檢測(cè)提供了新思路。

一、材料與方法

1.儀器與試劑。（1）主要儀器。TSQ Quantum三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、U3000高效液相色譜儀：美國(guó)Thermo Fisher公司；臺(tái)式離心機(jī)：鹽城安信；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；超聲波清洗器：上海晶壇儀器制造有限公司；渦旋混合器：Scientific industries；電子天平：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

（2）標(biāo)準(zhǔn)品及試劑。標(biāo)準(zhǔn)品沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺、非諾特羅、特布他林、氯丙那林、西馬特羅、妥洛特羅、噴布特羅（純度≥98.0%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；色譜純甲醇、乙腈、甲酸：美國(guó)Thermo Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水：屈臣氏蒸餾水。

2.樣品處理。（1）提取。稱取樣品2g（精確至0.01g），置于50mL塑料離心管中，加入15mL乙腈溶液及緩沖鹽包SBEQ-CA8802-B，渦旋混勻3min，超聲波提取10min，8000r/min離心6min，將上清液轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)凈化管SBEQ-CA8803-25。按以上步驟重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。

（2）凈化。將凈化管中的提取液渦旋混勻5min，8000r/min離心6min。轉(zhuǎn)移凈化后的上清液于雞心瓶中，40℃減壓蒸發(fā)至近干。加入1mL的50%（v/v）乙腈水溶液溶解，渦旋混勻3min，溶液過(guò)0.22μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

3.標(biāo)準(zhǔn)溶液制備。（1）單一標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。分別稱取9種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及3種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)各10mg（精確到0.01mg，對(duì)于含鹽或者含酸的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的含量折算后再稱?。?，用甲醇溶解后定容至10mL容量瓶中，配制成1.0mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20℃下保存待用。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。從上述9種單一標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別準(zhǔn)確吸取1.0m置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容為100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20℃下保存待用。將上述儲(chǔ)備液用甲醇稀釋為1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用于優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，使用時(shí)根據(jù)需要用流動(dòng)相稀釋配成合適的基質(zhì)標(biāo)曲點(diǎn)。采用同樣的步驟配制混合內(nèi)標(biāo)中間液。

4.液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件。（1）色譜條件。色譜柱：Hypersil GOLD C18柱（2.1mm×100mm，1.9μm），美國(guó)Thermo Fisher公司。流動(dòng)相：A泵為0.1%（v/v）甲酸水溶液，B泵為0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0min，96%A；2min，96%A；12min，40%A；12.1min，96%A；16min，96%A。流速：0.3mL/min。柱箱溫度：30.0℃。進(jìn)樣量：5μL。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：ESI；掃描方式：正離子；檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；電噴霧電壓（V）：3000；霧化氣溫度（℃）：300；離子源溫度（℃）：350；鞘氣流速（arb）：35；輔助氣流速（arb）：10；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表1。

二、結(jié)果與分析

1.前處理方法優(yōu)化。QuEChERS法的應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)前處理階段優(yōu)勢(shì)明顯，能夠分析的基質(zhì)類型更加豐富，處理時(shí)間可降低至約1.5h（按n=6計(jì)算），提高了檢測(cè)效率。QuEChERS法、農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008、GB/T 22286-2008方法對(duì)沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺、非諾特羅、特布他林、氯丙那林、西馬特羅、妥洛特羅、噴布特羅的平均回收率（n=7，添加量5μg/kg）分別為：79.1、77.5、83.0，84.5、82.0、85.8，88.4、90.6、87.7，88.0、92.0、81.8，80.5、79.9、79.6，98.0、102、89.3，76.9、80.0、74.0，93.0、89.6、101，91.5、92.8、95.0，無(wú)顯著差異，均符合相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.儀器條件優(yōu)化。優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，得到色譜峰峰形最好、響應(yīng)最高的參數(shù)信息，建立儀器方法，進(jìn)行序列信息采集。本實(shí)驗(yàn)獲得的9種β-受體激動(dòng)劑的SRM掃描色譜圖如圖1所示。

3.方法的線性及檢出限。按照優(yōu)化的儀器條件，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列進(jìn)行測(cè)定，采用內(nèi)標(biāo)法定量，分別以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)物濃度比值、被測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值作為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺、非諾特羅、特布他林、氯丙那林、西馬特羅、妥洛特羅、噴布特羅對(duì)應(yīng)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2、方法檢出限（μg/kg）分別為：Y=1.322e-1X+1.027e-1、Y=1.267e-1X-1.923e-2、Y=2.472e-1X+7.959e-2、Y=8.703e-3X-3.278e-4、Y=2.024e-2X-2.502e-3、Y=9.19e-2X+1.083e-2、Y=6.764e-2X+7.326e-2、Y=1.266e-1X-1.923e-2、Y=4.921e-2X+1.26e-2；0.9997、0.9995、0.9997、0.9996、0.9993、0.9991、0.9991、0.9998、0.9999；0.25、0.20、0.10、0.20、0.25、0.20、0.25、0.10、0.10。結(jié)果表明，9種β-受體激動(dòng)劑在0.5-20ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.9991-0.9999，方法檢出限為0.1-0.25μg/kg，滿足畜產(chǎn)品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)要求。

4.方法的精密度和加標(biāo)回收率。隨機(jī)選取市售豬肉、豬肝、牛肉、羊肉樣品，按2個(gè)濃度水平加入9種β-受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成加標(biāo)樣品，按照本方法對(duì)每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定7次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表2所示。由表2可知，9種β-受體激動(dòng)劑的加標(biāo)回收率為72.8%-106.2%，滿足相關(guān)檢測(cè)要求，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.7%-9.1%，說(shuō)明該方法結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)基于QuEChERS提取包與凈化包的使用，對(duì)不同類型樣品基質(zhì)的凈化效果良好，與農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008及GB/T 22286-2008標(biāo)準(zhǔn)方法相比，極大地縮短了提取和凈化時(shí)間，豐富了樣品基質(zhì)類型，提高了樣品前處理效率，9種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，方法檢出限、樣品回收率和方法精密度等均符合實(shí)際檢測(cè)相關(guān)要求。因此，可以通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)對(duì)不同類型樣品的快速處理和檢測(cè)，為應(yīng)對(duì)大批量樣品檢測(cè)提供參考。

作者簡(jiǎn)介：王蘇樂(lè)（1989-），男，漢族，內(nèi)蒙古錫盟人，助理工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)。

海娜（1987-），女，蒙古族，內(nèi)蒙古呼和浩特人，講師，碩士研究生，研究方向?yàn)樯飳W(xué)。