FXR 通過調(diào)控脂滴蛋白PLIN5 延緩纖維化的調(diào)控機制

黃曉霞，鄭志民，龐碧瀅，黃娜娜，李 馨，熊文婷，孔 波，劉吉升

（廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006）

非酒精性脂肪肝病 （non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是目前世界范圍內(nèi)最常見的肝臟疾病，目前世界上約有25% 的人患有NAFLD，NAFLD 與2 型糖尿病和肥胖密切相關(guān)，其特征是由于脂肪在肝細胞的過度堆積而造成的肝損傷［1］。肝纖維化是NAFLD 進展中的生理過程，是肝臟受到損傷后的一種自我修復(fù)，其病理特征為匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)有大量的細胞外基質(zhì)沉積和纖維組織增生。酒精、脂質(zhì)代謝失衡、病毒等因素都會造成肝纖維化［2］。在肝纖維化過程中，肝細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）等相互作用，產(chǎn)生多種細胞因子和氧化活性產(chǎn)物，進一步刺激炎癥和纖維化的發(fā)展［3］。如果不加以干預(yù)，會惡化為肝硬化甚至肝癌［4］。

肝纖維化的標志是HSC 的激活［5］。HSC 位于肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞的Disse 間隙中，約占所有肝臟細胞的10%。在健康生理狀態(tài)下，HSC 處于不增殖的靜息狀態(tài)，貯存大量含維生素A 的脂滴。當受到外界刺激因素時，HSC 分化為肌成纖維細胞，轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋车幕罨癄顟B(tài)，隨后脂滴丟失。其中α-SMA 蛋白表達增加，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)和膠原纖維［6］。由于肝纖維化是可逆的，因此阻斷和逆轉(zhuǎn)HSC 激活是預(yù)防肝纖維化的關(guān)鍵手段［7］。

HSC 的激活與脂滴的丟失緊密相連，PLIN5 屬于脂滴蛋白家族的一員，PLIN5 在心肌、骨骼肌和肝星狀細胞中高表達，具有維持脂滴穩(wěn)態(tài)的作用［8］。研究表明，外源性PLIN5 能逆轉(zhuǎn)HSC 的激活并恢復(fù)脂滴的形成，這種作用是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和減少氧化應(yīng)激來實現(xiàn)的［9，10］。通過課題組前期研究發(fā)現(xiàn)小鼠的Plin5 啟動子區(qū)存在多個法尼醇X 受體（farnesoid x receptor，F(xiàn)XR）的順式調(diào)控元件FXRE（FXR response element，F(xiàn)XRE）。FXR 屬于核受體超家族的一員，在肝臟，腸道和腎臟高表達，膽汁酸是FXR 的生理配體［11］。FXR 作為一種轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)控膽汁酸穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)代謝、減少纖維化等多重生理功能［12］。因此，F(xiàn)XR 是針對肝病的熱門研究靶點［13］。已有文獻報道，小鼠缺乏FXR 會導(dǎo)致肝臟膽固醇和甘油三酯增加，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展，以上結(jié)果強調(diào)了FXR 在調(diào)節(jié)脂質(zhì)和脂蛋白代謝中的作用［14］。但FXR 是否能通過調(diào)控PLIN5 減緩脂肪肝病的纖維化進程，尚未報道。本研究中選擇用人肝星狀細胞系LX-2，通過雙熒光素酶報告基因體系，驗證生物信息學預(yù)測的人PLIN5 FXRE 位點能否與FXR 結(jié)合；用TGF-β1 刺激LX-2 構(gòu)建肝纖維化細胞模型，探究FXR 和PLIN5 過表達對脂滴形成和抑制LX-2 活化的影響，以期為FXR 調(diào)控脂質(zhì)代謝和抑制肝纖維化的機制提供科學理論支持。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人胚胎腎細胞HEK293T 由廣州大學精準基因編輯中心喬云波課題組饋贈，由本實驗室保存；人肝星狀細胞系LX-2 購自武漢普諾賽公司；報告基因質(zhì)粒pGL4-Luc （101788）購自addgene 平臺；過表達質(zhì)粒pCI-GFP 由廣州大學精準基因編輯中心王剛課題組饋贈；2×Taq Master Mix PCR，T4 DNA連接酶、Exfect 轉(zhuǎn)染試劑、M-MLV （H-）逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA-easy 總RNA 提取試劑盒、ChamQ 實時熒光定量PCR 試劑盒、DH5α 感受態(tài)細胞和BCA 試劑盒均購自南京諾唯贊公司；TGF-β1 細胞因子購自美國PeproTech 公司；opti-MEM 培養(yǎng)基，血清FBS，DMEM 高糖培養(yǎng)基，胰酶均購自Invitrogen 公司；ECL 化學發(fā)光試劑盒，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑，兔二抗，鼠二抗，β-actin 一抗，4%的多聚甲醛固定液和改良油紅O 試劑盒均購自上海碧云天公司；組織細胞甘油三酯酶法測定試劑盒購自普利萊公司；α-SMA 一抗，Collagen Ⅰ一抗購自abcam 公司，PLIN5 一抗購自Proteintech 公司。

1.2 主要儀器

Nanodrop 微量分光光度計，Thermofisher 公司；ABI miniAMP PCR 擴增儀，Thermofisher 公司；ABI QuantStudio 3 定量PCR 儀，Thermofisher 公司；CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermofisher 公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺，蘇州蘇凈集團安泰公司；Infinite M Plex 多功能酶標儀，Tecan 公司；Biospectrum Imageing System 化學發(fā)光成像儀，UVP公司；SCILOGEX SLK-O3000-S 水平搖床，Scilogex 公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

LX-2 細胞培養(yǎng)于含10% FBS 高糖DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2的環(huán)境下生長。細胞肝纖維化體外模型誘導(dǎo)條件：使用TGF-β1（10 ng/mL）誘導(dǎo)LX-2 細胞，分別在 24 h 和48 h 用于mRNA 和蛋白檢測。

1.4 qPCR

參考總RNA 提取試劑盒說明書進行總RNA提取，用Nanodrop 進行RNA 定量分析，用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄。參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。參考ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 說明書配置反應(yīng)體系，采用ABI QuantStudio 3 進行qPCR 檢測。引物由擎科生物合成，qPCR 所用引物如表1 所示。

表1 qPCR 所用引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.5 PLIN5 FXRE 位點預(yù)測

通 過 在 線軟 件 UCSC genomic browser（https：//genome.ucsc.edu/），確定人和小鼠PLIN5基因的調(diào)控區(qū)域DNA 序列信息。進一步通過在線軟件工具NubiScan（https：//www.nubiscan.unibas.ch/）預(yù)測這些DNA 片段中可能含有的順式作用元件FXRE，預(yù)測結(jié)果如圖1 A 中所示。

圖1 FXRE 位點預(yù)測（A）和構(gòu)建的質(zhì)粒示意圖（B-C）Fig 1 Prediction of FXRE sites（A）and constructed reporter gene plasmid（B-C）

1.6 質(zhì)粒構(gòu)建

參考諾唯贊 2×Taq Master Mix PCR 試劑說明書進行PCR 克隆得到目的片段，所用引物如表2 中所示。參考內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、DH5α 感受態(tài)細胞的說明書進行酶切、連接和轉(zhuǎn)化，在pGL4-Luc的熒光素酶基因上游插入FXRE 片段得到pGL4-PLIN5 FXRE wt-Luc、pGL4-PLIN5 FXRE mut-Luc 和pGL4-3×PLIN5 IR-1-Luc 質(zhì)粒（圖1 B）。在過表達質(zhì)粒pCI-GFP 的CMV 啟動子下游切除原有的GFP 基因，插入對應(yīng)基因的編碼序列（Coding sequence，CDS），構(gòu) 建 得 到 質(zhì) 粒pCI-PLIN5 和pCI-FXR（圖1 C）。

表2 DNA 克隆引物序列Tab 2 Primer sequences for DNA cloning

1.7 細胞轉(zhuǎn)染

將LX-2 接種于6 孔板中，待細胞聚合度為70%～80%時，參考轉(zhuǎn)染試劑的說明書，按照每孔共1.5 μg 質(zhì)粒與 3 μL 轉(zhuǎn)染試劑進行瞬時轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑分別用200 μL opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋后混勻，靜置15 min 后，滴加到六孔板中并搖勻，轉(zhuǎn)染6 h 后換液。HEK293T 轉(zhuǎn)染條件如上所述。

1.8 油紅O 染色

細胞處理后，按照碧云天制造商的說明進行固定和染色，在倒置顯微鏡下進行觀察。

1.9 雙熒光素酶報告基因檢測

GW4064 是常用的FXR 激動劑，本實驗室用于激活FXR 的使用濃度為2 μmol/L。HEK293T 細胞按1.6 方法轉(zhuǎn)染6 h 后，將細胞用胰酶消化并離心，均勻接種到96 孔板，以保證轉(zhuǎn)染效率一致。設(shè)置相同體積的DMSO 溶劑組和2 μmol/L GW4064處理組，每組3 個重復(fù)，分別在18 h 和42 h 進行雙熒光素酶報告基因檢測。誘導(dǎo)細胞完成后，吸除培養(yǎng)基，用PBS 漂洗2 次后棄去，96 孔板每孔加入50 μL報告基因裂解液，室溫靜置裂解5 min，吹打并吸取細胞裂解產(chǎn)物至1.5 mL EP 管中，4 ℃，12 000×g 離心3 min，取上清液進行檢測。吸取10 μL 上清液至96 孔檢測板中，將50 μL 孵育至37 ℃的Luciferase Substrate 加入檢測孔中，迅速混勻后立即用酶標儀檢測螢火蟲熒光素熒光值。另取10 μL 上清液，加入50 μL 孵育至37 ℃的Renilla 工作液，迅速混勻后立即用酶標儀檢測海腎熒光素熒光值。以檢測的螢火蟲熒光素酶數(shù)值和海腎熒光素酶數(shù)值的比值（Fluc/Rluc）表示熒光素酶活性的強弱，從而顯示轉(zhuǎn)錄活性的強弱。在轉(zhuǎn)染相同質(zhì)粒的組中，繼續(xù)用GW4064 處理組相對于溶劑組的比值（GW/DMSO）表示相對熒光素酶活性，作為本底活性誘導(dǎo)效率。

1.10 Western blot

使用RIPA 裂解液對細胞進行裂解，4 ℃離心后，取上清。通過BCA 法測定樣品蛋白濃度。樣品加入蛋白上樣緩沖液后，在100 ℃金屬浴中加熱10 min 進行變性。根據(jù)不同蛋白的分子大小，配置8%，10%，12%的SDS-PAGE 膠，在80 V/30 min，120 V/60 min 條件下進行電泳，在230 mA/90 min條件下將蛋白轉(zhuǎn)移到提前被甲醇激活的PVDF 膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h 后，加入一抗4 ℃孵育14～18 h，用TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h 后，用TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min；加入ECL 發(fā)光液反應(yīng)3 min，進行顯影成像。

1.11 TG 檢測

細胞處理后，按照制造商的說明進行TG 含量的檢測；用BCA 法對剩余樣品進行總蛋白定量，以蛋白濃度校正TG 含量。

1.12 統(tǒng)計學處理

用 Graphpad Prism 9.0 進行統(tǒng)計分析和作圖 。結(jié)果用（±s）表示。采用t檢驗來統(tǒng)計分析兩組間的差異顯著性，采用單因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計分析多組間差異顯著性。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FXR 與PLIN5 IR-1 結(jié)合

FXR 作為轉(zhuǎn)錄因子能識別并結(jié)合下游靶基因的FXR 反應(yīng)元件，典型的FXRE 片段為IR-1，即被1個核苷酸分隔形成的反向重復(fù)序列［15］。圖1 A 中，NUBIScan 分析顯示，小鼠和人PLIN5 基因上游調(diào)控序列均存在IR-1 片段，同時將包含IR-1 片段及其上下游部分序列進行了比對。為了確定FXR 結(jié)合PLIN5 啟動子的能力，將含有IR-1 序列的起始轉(zhuǎn)錄位點-176/+179 的序列克隆到熒光素酶基因的上游，構(gòu)建了pGL4-PLIN5 FXRE wt-Luc，命名為FXRE wt 組。類似地構(gòu)建了包含IR-1 突變序列的熒光素酶載體pGL4-PLIN5 FXRE mut-Luc（圖1 B），命名為FXRE mut 組。在HEK293T 細胞中進行瞬時共轉(zhuǎn)染，將pGL4-Luc 組作為對照組，命名為Vec 組。FXRE wt 組和FXRE mut 組的相對熒光素酶活性（GW/DMSO）無顯著差異（圖2 B）。在FXRE wt 組和FXRE mut 組中，無論是DMSO 處理組還是GW4064 處理組的熒光素酶活性，都相比于Vec 組高150 多倍（圖2 A）。這可能是由于該片段存在LX-2 細胞中其它調(diào)控因子調(diào)控的位點，GW4064 激活FXR 后無法進一步地激活報告基因。因此重新構(gòu)建了包含3 段PLIN5 IR-1 重復(fù)相連的質(zhì)粒，命名為3×IR-1 組。在圖2 B 中，3×IR-1 組的相對熒光素酶活性（GW/DMSO）相對于Vec 組增加10 倍（P＜0.000 1）（圖2 B）。以上結(jié)果表明，PLIN5 啟動子上游含有FXR 的反應(yīng)元件IR-1，能與FXR 結(jié)合并調(diào)控下游靶基因。

圖2 PLIN5 FXRE 片段與FXR 的結(jié)合效應(yīng)Fig 2 Binding effect of PLIN5 FXRE fragments with FXR

2.2 FXR 在LX-2 細胞中低量表達

驗證LX-2 細胞中FXR 是否能被激活。圖3 A表明GW4064 處理LX-2 細胞后，已知的FXR 靶基因SHP 的轉(zhuǎn)錄水平相較于DMSO 處理組沒有顯著差異。進一步的qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)LX-2 細胞中的FXR 表達量低（未顯示），GW4064 處理無法激活FXR 的靶基因。通過進一步向LX-2 細胞中轉(zhuǎn)染FXR 過表達質(zhì)粒和雙熒光報告基因體系來檢測FXR 的激活，pCI-GFP 轉(zhuǎn)染組作為陰性對照（Vec組），GW4064 處理LX-2 細胞24 h 和48 h 后，F(xiàn)XR過表達組的相對熒光素酶活性（GW/DMSO）相比Vec 組分別升高12 倍（P＜0.001）（圖3 B）和6 倍（P＜0.01）（圖3 C）。上述的結(jié)果表明在LX-2 細胞中過表達FXR 能夠被FXR 激動劑GW4064 激活。

圖3 qPCR 和雙熒光報告基因體系檢測LX-2 中FXR 的激活Fig 3 Detection of FXR activation by qPCR and dual luciferase reporter gene system in LX-2 cells

2.3 FXR上調(diào)PLIN5的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平

在LX-2 細胞中過表達FXR，用GW4064 處理后，檢測PLIN5 的表達水平。Control 組未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，pCI-GFP 轉(zhuǎn)染組作為陰性對照（Vec 組）。結(jié)果顯示，過表達FXR 組相比于Control 組和Vec 組，PLIN5 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01）（圖4）。這些結(jié)果表明FXR 激活能夠上調(diào)PLIN5 的基因表達。

圖4 FXR 激活上調(diào)PLIN5 的表達Fig 4 Activation of FXR up-regulates PLIN5 expression

2.4 FXR 激活無法進一步促進脂滴的形成和抑制LX-2 的活化

在體外模型中，通常用油酸來提供游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）的來源［16］。油酸處理在LX-2 細胞形成微小脂滴，脂滴的形成和維持與HSC 的活化可能相關(guān)。圖5 A 的油紅O 染色結(jié)果和圖5 B 的TG 含量檢測結(jié)果顯示，30 μmol/L 油酸處理不足以形成能被油紅O 染色的脂滴，F(xiàn)XR 過表達和GW4064 激活后并不能進一步地促進細胞中的脂滴形成。TGF-β1 是誘導(dǎo)HSC 激活的強效細胞因子，用來刺激LX-2 以構(gòu)建肝星狀細胞活化模型。圖5 C 中，F(xiàn)XR 在激活的條件下，對TGF-β1 上調(diào)的纖維化基因α-SMA 和Collagen Ⅰ的mRNA 水平?jīng)]有顯著的抑制作用。

圖5 過表達FXR 對脂滴和纖維化基因的影響Fig 5 Effect of FXR over-expression on lipid droplet and genes of fibrosis

2.5 過表達PLIN5 促進脂滴的形成并抑制LX-2 的活化

已有研究顯示，PLIN5 的基因表達在活化的HSC 細胞中顯著降低甚至消失［10］。LX-2 在體外已經(jīng)是高度活化的狀態(tài)。根據(jù)2.4 的結(jié)果，驗證過表達PLIN5 能否通過促進脂滴的形成并抑制LX-2 的活化。圖6 A 和B 中，由油紅O 染色和TG 含量檢測結(jié)果可知，PLIN5 過表達后，在30 μM 油酸處理條件下促進脂滴的形成。圖6 C-D，PLIN5 過表達能顯著抑制TGF-β1 上調(diào)的纖維化基因α-SMA 和Collagen Ⅰ的mRNA 水平（P＜0.001）和蛋白水平（P＜0.05）。

圖6 過表達PLIN5 對脂滴和纖維化基因的影響Fig 6 Effect of PLIN5 over-expression on lipid droplet and genes of fibrosis

3 討論

FXR 作為核受體，通常與配體結(jié)合后被激活，F(xiàn)XR 通過與RXRα 形成異源二聚體，識別并結(jié)合其下游靶基因的FXRE，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。通常與FXR 結(jié)合最強的FXRE 片段為IR-1。本課題組通過生物信息學預(yù)測，發(fā)現(xiàn)人的PLIN5 啟動子區(qū)域可能存在FXRE 位點，通過構(gòu)建雙熒光素酶報告基因體系證明了PLIN5 FXRE 位點。并且FXR 激活能夠增加PLIN5 的mRNA 水平和蛋白水平，這可能是FXR 激活抑制肝纖維化的部分機制。

圖2 A 中的FXRE wt 組和FXRE mut 組的結(jié)果顯示，構(gòu)建的FXRE 上下游片段在LX-2 細胞中存在其它調(diào)控因子調(diào)控的位點，即使是DMSO 處理組，仍顯示出較高的熒光素酶活性，GW4064 激活FXR后無法進一步地激活報告基因。3×PLIN5 IR-1 組的相對熒光素酶活性（GW/DMSO）相比于Vec 組增強10 倍，這表明了PLIN5 IR-1 能與FXR 結(jié)合。雙熒光素酶報告基因體系是一種高靈敏的檢測手段，盡管通過此體系顯示，F(xiàn)XR 激活后結(jié)合PLIN5 IR-1，并上調(diào)熒光素酶的表達，但這種結(jié)合活性對PLIN5 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控還未知。

在過表達FXR 并激活的條件下，發(fā)現(xiàn)在LX-2中能增加PLIN5 的mRNA 水平和蛋白水平（圖4）。推測增加的PLIN5 的表達可能會影響脂滴的形成和LX-2 的活化，但圖5 的結(jié)果表明，F(xiàn)XR 過表達并用GW4064 激活后，未能恢復(fù)脂滴的形成和抑制纖維化基因α-SMA 和CollagenⅠ的mRNA 水平。以往的研究表明，F(xiàn)XR 能在大鼠HSC 及2 種細胞系HSC-T6 和LX-2 中表達，F(xiàn)XR/SHP 通過減少膠原蛋白CollagenⅠ表達、抑制AP-1 下游促纖維化信號、抑制Timp-1 的表達并增加MMP-2 的活性來促進HSC 靜息態(tài)的發(fā)展并增加HSC 的凋亡，從而防止肝纖維化的發(fā)展，F(xiàn)XR 配體可能會有利于治療肝纖維化［17，18］。而結(jié)果未能支持上述研究，可能存在以下原因：一方面，在驗證LX-2 細胞中FXR 激活條件時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR 在LX-2 中的表達量很低，導(dǎo)致GW4064 處理后，檢測FXR 靶基因SHP 的mRNA水平無顯著變化（圖3 A）。推測可能是由于體外模型LX-2 的活化程度存在差異，活化程度太高導(dǎo)致其喪失在靜息態(tài)時的某些基因功能，而獲得了肌成纖維細胞的某些功能，F(xiàn)XR 可能在此過程中也下調(diào)了表達，發(fā)揮的生物學功能有限。另一方面，圖4 中過表達FXR 誘導(dǎo)的PLIN5 蛋白處于低水平，相比圖6 中過表達PLIN5 檢測的蛋白水平，存在顯著的差距。因此，這種FXR 誘導(dǎo)的PLIN5 水平還不足以發(fā)揮PLIN5 恢復(fù)脂滴和抑制LX-2 的活化的功能。

已有證據(jù)表明FXR 在HSC 中存在，并發(fā)揮抗纖維化的作用［19，20］。Plin5 在新鮮分離的小鼠原代HSC 中也有表達，在分離后的活化過程中，Plin5 伴隨著脂滴迅速喪失，過表達Plin5 能恢復(fù)脂滴的形成并延緩HSC 的活化［9］。在圖6 的結(jié)果中，也支持PLIN5 抑制LX-2 活化的作用。盡管在研究體外模型中，F(xiàn)XR 表現(xiàn)出的參與肝纖維化的作用有限，但體外用于研究的LX-2 細胞系和體內(nèi)HSC 存在差異，F(xiàn)XR 結(jié)合PLIN5 FXRE 參與HSC 活化的作用在體內(nèi)未知，需要進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FXR 激活能結(jié)合PLIN5 IR-1，并上調(diào)PLIN5 的mRNA 水平和蛋白水平；同時，過表達PLIN5 能夠下調(diào)肝纖維化基因的表達。盡管在本研究的體系中，F(xiàn)XR 上調(diào)PLIN5 后參與肝纖維化的作用有限，但結(jié)合目前的研究結(jié)果，仍不能排除FXR 參與肝纖維化的作用。這些數(shù)據(jù)補充了FXR 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝基因PLIN5 的空白，為今后進一步的體內(nèi)研究揭示FXR 參與HSC 活化和保護肝纖維化的機制提供了理論支持。

作者貢獻度說明：

黃曉霞：思路設(shè)計，數(shù)據(jù)獲取分析，起草或修改文章關(guān)鍵內(nèi)容；孔波：思路設(shè)計，數(shù)據(jù)獲取分析，起草或修改文章關(guān)鍵內(nèi)容；鄭志民，龐碧瀅，黃娜娜，李馨，熊文婷，劉吉升：參與實驗評估。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。