田 鑫,張 艷,余 明,曹泮相,張建永,段燦燦

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室,貴州 遵義 563099;3.貴州務(wù)川萬年峰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,貴州 務(wù)川 564300)

香榧(TorreyagrandisFort.),為中國原產(chǎn)樹種、國家二級保護植物,主產(chǎn)地為江蘇南部、浙江等,貴州也有引種。香榧目前的藥用部位是種子,其化學(xué)成分包括:萜類和揮發(fā)油、有機酸、脂肪等?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中有記錄榧子“主腹中邪氣,去三蟲,蛇螫”,并已被2020版《中國藥典》收錄,其可以起到殺蟲消積、潤肺止咳和潤燥通便的作用[1]?，F(xiàn)代的藥理學(xué)研究表明香榧種子可降血糖[2],且香榧種子中黃酮類化合物的作用較強[3];香榧種子中的煙酸和葉酸具有助消化和滋潤皮膚等藥理活性[4-5]。然而,目前《中國藥典》中僅有榧子(種子)的薄層色譜定性鑒別和酸敗度、酸值、羰基值、過氧化值檢查項,湖北、山東和上海等省市地方標(biāo)準(zhǔn)中加有雜質(zhì)、水分、總灰分檢查項[6-8]。綜上可知,香榧種子目前尚無含量測定項,影響了對香榧種子指標(biāo)成分的質(zhì)量控制,制約了其進一步開發(fā)利用。

貴州省目前引種香榧樹的面積已達到5.1萬畝[9],主要分布在遵義市,香榧種子作為主要產(chǎn)品初步形成了產(chǎn)業(yè)鏈,整體發(fā)展前景很好。然而引種后的質(zhì)量和品質(zhì)如何?目前尚無相關(guān)研究。因此,本研究擬建立黔產(chǎn)香榧種子HPLC指紋圖譜及多指標(biāo)含量測定方法,為黔產(chǎn)香榧種子的質(zhì)量控制和進一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(美國Agilent公司);沃特浦超純水設(shè)備(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司);超聲波清洗器(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司);電子天平、十萬分之一電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑 甲醇(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),甲醇(分析純,成都金山化學(xué)試劑有限公司),乙酸(色譜純,賽默飛世爾科技公司),對照品沒食子酸(分析純,純度≥99%,批號PS000688,成都普思生物科技股份有限公司),綠原酸(分析純,純度≥99%,批號PS08072303,成都普思生物科技股份有限公司)。

1.3 樣品 20批香榧種子采自貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng),經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室張建永教授鑒定為紅豆杉科榧樹屬榧樹TorreyagrandisFort.的種子,具體樣品信息見表1。

表1 樣品產(chǎn)地匯總情況

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 香榧種子干燥后粉碎,稱取香榧種子粉末1.0 g于錐形瓶內(nèi),加入20%乙醇30 mL,稱重,充分振搖,超聲60 min(40 kHz,180 W),待其冷卻至室溫,再次稱重,以20%乙醇補足損失的重量,充分振搖,過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,備用。

2.2 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);乙腈(A)-0.06%醋酸-水溶液(B)為流動相;梯度洗脫,洗脫程序見表2;在280 nm處檢測;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量15 μL。

表2 HPLC梯度洗脫程序

2.3 黔產(chǎn)香榧種子的指紋圖譜研究

2.3.1 黔產(chǎn)香榧種子指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.3.1.1 儀器精密度的考察 取香榧種子供試品溶液,按上述色譜條件進樣6次,記錄5個共有峰的保留時間和峰面積,并分別計算它們的RSD 值,考察色譜峰相似度的一致性。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版本),評價其相似度。結(jié)果6次測定的5個共有峰保留時間的RSD值不超過1.35%,各色譜峰峰面積的RSD值不超過3.72%,相似度為1.000,儀器精密度良好。

2.3.1.2 重復(fù)性試驗 取6份同一批次的香榧種子粉末,以相同的方法制得供試品溶液,在同樣的色譜條件連續(xù)進樣,記錄5個共有峰的保留時間和峰面積,并分別計算RSD 值,考察色譜峰相似度的一致性。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng),評價其相似度。結(jié)果6次測定的5個共有峰的保留時間的RSD值不超過1.35%,各色譜峰峰面積的RSD值不超過2.82%,相似度達到1.000,表明方法重復(fù)性良好。

2.3.1.3 穩(wěn)定性試驗 取一份香榧種子粉末按“2.1”項下制備供試品溶液,分別在0、4、8、12、16、20、24 h連續(xù)進樣7次,記錄5個共有峰的保留時間和峰面積,并分別計算RSD 值,考察色譜峰相似度的一致性。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng),評價其相似度。結(jié)果5個共有峰保留時間的RSD值不大于2.61%,各色譜峰峰面積的RSD值不超過2.67%,相似度達到1.000,表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 黔產(chǎn)香榧種子HPLC指紋圖譜的建立 稱取不同批次的黔產(chǎn)香榧種子粉末,依照上述方法制備供試品溶液,按色譜條件進樣分析。最后有5個特征峰被選出(這5個共有色譜峰峰面積之和大于總峰面積的92.05%,符合建立指紋圖譜的技術(shù)要求),S1為對照圖譜,時間窗寬度是0.1,得到20批黔產(chǎn)香榧種子樣品重疊的HPLC指紋圖譜,如圖1～2。

峰3為沒食子酸;峰5為綠原酸。圖1 對照指紋圖譜

圖2 20批黔產(chǎn)香榧種子的HPLC指紋圖譜

2.3.3 黔產(chǎn)香榧種子HPLC指紋圖譜相似度的評價 應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版本),用中位數(shù)矢量法計算20批黔產(chǎn)香榧種子的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度,計算得到20批香榧種子相似度為0.983～1.000,結(jié)果見表3,顯示相似度良好。

表3 20批黔產(chǎn)香榧種子樣品指紋圖譜相似度的結(jié)果

2.4 香榧種子中2種化學(xué)成分的含量測定 與對照品色譜圖進行比對后,定性了黔產(chǎn)香榧種子中可能存在沒食子酸與綠原酸,本部分對黔產(chǎn)香榧種子中的這2種成分進行定量分析。

2.4.1 溶液配制 單一對照品溶液配制:分別精密稱量適量沒食子酸和綠原酸于2個25 mL容量瓶內(nèi),以20%乙醇定容,充分振搖,得到單一對照品貯備液,其濃度分別是0.380 mg/mL和0.312 mg/mL,過0.22 μm微孔濾膜,備用。

混合對照品溶液①的配制:取2個單一對照品溶液各2.0 mL于試管中,揮干溶劑,加入2.0 mL 20%乙醇定容,充分振搖,即得混合對照品溶液①,過0.22 μm微孔濾膜,備用。

混合對照品溶液②的配制:取2個單一對照品溶液各2.5 mL于5 mL容量瓶中,充分振搖得混合對照品溶液②,過0.22 μm微孔濾膜,備用。

供試品溶液配制:同“2.1”項下方法。

2.4.2 HPLC色譜條件 同“2.2”項。

2.4.3 專屬性考察 分別將空白溶劑(20%乙醇)、兩種單一對照品溶液、混合對照品溶液②、供試品溶液按色譜條件進樣。圖3中,黔產(chǎn)香榧種子供試品溶液所測成分沒食子酸(280 nm、4.752 min)和綠原酸(280 nm、12.917 min)色譜峰的保留時間與對照品溶液中色譜峰保留時間一致,溶劑與其余成分對測定均無干擾。可見專屬性良好。

A:空白溶劑(20%乙醇);B:沒食子酸;C:綠原酸;D:混合對照品溶液②;E:供試品溶液;1:沒食子酸;2:綠原酸。圖3 測試樣品的HPLC(280 nm)

2.4.4 線性關(guān)系的考察 將混合對照品溶液①按一定比例稀釋,按上述色譜條件進樣。濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算其回歸方程和線性范圍等,結(jié)果如表4,表明沒食子酸和綠原酸的對照品溶液在各自濃度范圍里有良好的線性關(guān)系,(S/N>10)。

表4 2種對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.5 精密度考察 取混合對照品溶液②,在同樣的色譜條件下進樣6次,分別計算2個對照品色譜峰的保留時間和峰面積的RSD值。沒食子酸、綠原酸保留時間的RSD值分別為0.72%和0.56%;峰面積的RSD值分別為0.29%和0.25%,表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批次黔產(chǎn)香榧種子,依照上述方法制備供試品溶液,在“2.2”項色譜條件下,在0、4、8、12、16、20、24 h不同時間點進樣,分別計算2個對照品色譜峰的保留時間和峰面積的RSD值。沒食子酸、綠原酸保留時間的RSD值分別是2.61%和1.25%;峰面積的RSD值分別是4.69%和0.37%。樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性考察 取同一批次黔產(chǎn)香榧種子粉末6份,依照上述方法制得供試品溶液,在同樣的色譜條件下進樣,分別計算2個對照品色譜峰的保留時間和峰面積的RSD值。結(jié)果沒食子酸、綠原酸保留時間的RSD值分別是2.56%和1.55%;其含量的RSD值分別是1.49%和0.84%。從結(jié)果可以看出該方法的重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率的試驗 稱取9份已知含量的黔產(chǎn)香榧種子粉末,每份為0.5 g,依次按照80%、100%、120%的比例分別精密加入對應(yīng)體積的2種單一對照品溶液,按“2.1”項下制備供試品溶液,在“2.2”項色譜條件下進樣,記錄2種化學(xué)成分對應(yīng)的色譜峰峰面積,計算其加樣回收率。沒食子酸和綠原酸的平均回收率在97.75%～98.82%,符合95%～105%的范圍,RSD≤1.62%,符合要求,由此可見該方法的加樣回收率良好(表5)。

表5 黔產(chǎn)香榧種子中2種成分加樣回收率的結(jié)果

2.4.9 20批香榧種子樣品中2種成分的含量測定結(jié)果 取20批香榧種子樣品,依照上述方法制備供試品溶液,按色譜條件逐個進樣,分別將沒食子酸和綠原酸的峰面積代入線性回歸方程,計算其含量(表6)。其中,沒食子酸和綠原酸含量最高的分別是S15(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)高峰村)和S8(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)浪水村)。該2種化學(xué)成分總含量最高的為S9(貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)浪水村)。

表6 20批香榧種子中2類成分含量(μg/g)

2.4.10 聚類分析 應(yīng)用Simca-P 14.1軟件,共有峰峰面積為變量,展開系統(tǒng)聚類分析(HCA),結(jié)果如圖4。20批香榧種子樣品被分為2類:Ⅰ類包括S14～S16號樣品,此類樣品均產(chǎn)自遵義市高峰村;Ⅱ類包括S6、S8和S9號樣品,此類樣品均產(chǎn)自遵義市浪水村;Ⅲ類包括S1～S5、S7、S10～S13和S17～S20號樣品,其中S1～S5號樣品產(chǎn)自遵義市大漆村,S7號樣品產(chǎn)自遵義市浪水村,S10～S13號樣品產(chǎn)自遵義市京竹村,S17～S20號樣品產(chǎn)自遵義市沙坂村。Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ樣品表明不同村子之間的樣品存在一定差異。

Ⅰ類:S14～S16號樣品;Ⅱ類:S6、S8和S9號樣品;Ⅲ類:S1～S5、S7、S10～S13和S17～S20號樣品。圖4 3類樣品聚類分析情況

3 討論

3.1 方法的建立

3.1.1 色譜柱和流動相考察 考察了2種色譜柱類型:Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)和Agilent Eclipse XDB C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),結(jié)果表明,Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)的柱效更好。并且考察了不同的流動相體系:甲醇-水、乙腈-水、甲醇-醋酸水和乙腈-醋酸水等。結(jié)果使用乙腈-0.06%醋酸水為流動相體系時,色譜出峰時間最佳,特征峰分離度可達到要求,色譜圖基線較平穩(wěn),色譜峰有較好的對稱性。

3.1.2 檢測波長的選擇 采用HPLC-DAD對各對照品以及香榧種子供試品溶液進行全波長掃描。沒食子酸和綠原酸的紫外最大吸收波長分別是270 nm和330 nm。但香榧種子在330 nm處無峰,而綠原酸在265 nm左右吸光度最低。在280 nm時,香榧種子中沒食子酸和綠原酸對應(yīng)色譜峰的峰面積都高于270 nm時其二者的峰面積。參考各對照品的紫外光譜圖以及香榧種子色譜圖,最終決定以280 nm作為沒食子酸和綠原酸的檢測波長。

3.1.3 黔產(chǎn)香榧種子樣品處理方法考察 其他條件相同時,本實驗分別考察了5%、10%、20%、40%、70%、100%乙醇提取香榧種子的效果,對比特征峰峰形和峰面積選擇最優(yōu)提取溶劑百分比。再以20%甲醇同法操作,測得結(jié)果和20%乙醇的結(jié)果相比較。最終確定當(dāng)提取溶劑為20%乙醇時,樣品峰形較好,2個對照品對應(yīng)色譜峰峰總面積最大。

其他條件相同時,實驗中分別考察了超聲30、60、90 min提取香榧種子的效果,發(fā)現(xiàn)提取60 min時香榧種子的2個對照品對應(yīng)的峰總面積最大,因此選擇提取60 min。

其他條件相同時,實驗分別考察了采用超聲、冷浸和水浴回流提取香榧種子的效果,發(fā)現(xiàn)超聲提取香榧種子時,香榧種子的2個對照品對應(yīng)的峰總面積最大。因此,本研究選擇超聲方式提取香榧種子。

在保證其余條件一樣的情況下,實驗考察了料液比1∶10,1∶20,1∶30,1∶40時的香榧種子提取效果,發(fā)現(xiàn)料液比1∶30時2個對照品的總含量最高。

香榧種子樣品處理方法最終篩選結(jié)果為:以20%乙醇提取香榧種子,料液比為1∶30,超聲60 min。

3.2 黔產(chǎn)香榧種子質(zhì)量分析 本實驗的20批香榧種子樣品采自貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)的5個不同村子,樣品批次多,具有一定的代表性。測定結(jié)果表明,20批不同村子香榧種子指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度為0.983～1.000,相似度均較高,表明引種后,貴州省遵義市務(wù)川縣石朝鄉(xiāng)樣品之間的指紋圖譜具有較好的一致性。20批香榧種子的沒食子酸和綠原酸含量分別為 33.25～97.00 μg/g和1 072.28～1 279.56 μg/g。不同村子香榧種子中2種成分含量有一定差異,2種成分總含量平均值為1 231.92 μg/g,總含量最高的為浪水村的S9(1 327.88 μg/g),總含量最低的為沙坂村的S17(1 157.39 μg/g),采自浪水村的S6、S8和S9總含量排進前四位。香榧種子中化學(xué)成分總含量的村子排序規(guī)律與前期研究中假種皮規(guī)律相反,這可能與香榧的生長環(huán)境有關(guān)。

本實驗建立了黔產(chǎn)香榧種子的指紋圖譜,建立了同時測定香榧種子中的沒食子酸與綠原酸2種化學(xué)成分含量的HPLC分析方法,為黔產(chǎn)香榧種子的品質(zhì)評價及資源利用提供科學(xué)依據(jù)。更多具有藥理活性的化學(xué)成分有待進一步研究。