劉正蕓,廖晏藺,易世豪,羅 果,秦 穎,龔其海,王 歡

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省普通高等學(xué)校傳染病與生物安全特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)簡稱乙肝病毒,屬于嗜肝DNA病毒科,它可引發(fā)急性和慢性肝炎,后者又可發(fā)展為肝硬化乃至肝癌[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,全球約2.57億慢性HBV患者,每年約有88.7萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[2]。目前臨床主要使用核苷酸類似物(替諾福韋艾拉酚胺、恩替卡韋、阿德福韋和替比夫定等)或干擾素(普通、長效)進(jìn)行抗HBV治療,以上藥物能控制HBV的發(fā)生發(fā)展,但對于HBV的徹底治愈或功能性治愈,目前仍無有效的辦法,故尋求新的、特異的抗病毒藥物依然迫在眉睫。

淫羊藿為我省道地中藥材,具有“補(bǔ)腎陽,強(qiáng)筋骨,祛風(fēng)濕”等功效,中醫(yī)用于治療陽痿、遺精早泄、腰膝酸軟、筋骨攣急、風(fēng)濕痹痛和半身不遂等。研究報道,淫羊藿對甲型流感病毒、水泡性口炎病毒、單純皰疹病毒、雞新城疫病毒以及HBV有抑制作用[3-4]。淫羊藿次苷Ⅱ(icariside Ⅱ,ICS Ⅱ)是淫羊藿的主要活性成分之一,ICS Ⅱ具有抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抗神經(jīng)元損傷、改善心血管功能和提高性功能等作用[5-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ICS Ⅱ在體內(nèi)外對HBV復(fù)制均有一定的抑制作用[8],但其機(jī)制不明。有研究表明,HBV感染會導(dǎo)致胰島素抵抗(insulin resistance,IR)[9],進(jìn)而影響胰島素發(fā)揮正常功能。而淫羊藿苷能通過提高p38 MAPK和Akt T308的磷酸化水平而減輕高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞的IR,提示ICS Ⅱ有可能通過胰島素通路或IR途徑發(fā)揮抗HBV的作用[10]。

本項(xiàng)目擬利用RNA-Seq技術(shù)檢測ICS Ⅱ作用于HBV復(fù)制型C57BL/6小鼠后基因水平的變化,研究ICS Ⅱ抗HBV時對胰島素信號通路的影響,以期找到ICS Ⅱ抗HBV的相關(guān)靶標(biāo),為ICS Ⅱ抗HBV提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與藥品 6周齡C57 BL/6小鼠購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010。本研究已獲遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查編號:ZMU21-2302-270)。淫羊藿次苷Ⅱ購自南京欣厚生物科技有限公司,分子式C27H30O10,分子量為514.53,純度99.90%。

1.2 主要儀器與試劑 全波長酶標(biāo)儀(1500,Thermo scientific),臺式高速低溫離心機(jī)(Allegra X-15R ,Beckman coulter),高通量測序儀(HiSeq 2500,Illumina),梯度PCR儀(T100,Bio-Rad),熒光定量PCR儀(CFX 96,Bio-Rad),PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa,RR036),TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa,RR820),無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(CW2107,康為世紀(jì)),乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(DA-Z051,達(dá)安基因)等,pAAV-HBV 1.2質(zhì)粒由復(fù)旦大學(xué)袁正宏教授惠贈。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物建模及分組 C57BL/6小鼠,25只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,用高壓水動力法注射相當(dāng)于其體重8 %的含20 μg pAAV-HBV1.2質(zhì)粒(質(zhì)粒提取按說明書操作)的PBS到小鼠體內(nèi),NS組注射相同體積的PBS。在第3天取5只小鼠用2 %戊巴比妥鈉(4 mg/kg)麻醉后,摘眼球取血,離心取血清,檢測血清樣本中HBV DNA的拷貝量。按試劑盒定義,其HBV DNA拷貝量大于103copies/mL時認(rèn)為模型建立成功。

確認(rèn)模型建立成功后,隨機(jī)進(jìn)行分組:Model組(模型組,建模后灌胃生理鹽水)、NS組(生理鹽水對照組,建模后灌胃生理鹽水)、ENT組(恩替卡韋組,建模后灌胃ENT 0.5 mg/kg)和ICS Ⅱ組(建模后灌胃ICS Ⅱ 20 mg/kg),每組5只,給藥體積為10 mL/kg,1 d 1次,連續(xù)給藥20 d后取材。取小鼠血清和肝臟,血清用于測定HBV DNA拷貝量,確認(rèn)ICSⅡ?qū)BV DNA有抑制作用后,肝臟分為2份,1份用于測序分析,1份用于后期驗(yàn)證。

1.4 測序及測序結(jié)果分析 樣本送公司測序,本次測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。對測序結(jié)果進(jìn)行差異可視化分析可得到散點(diǎn)圖、火山圖和MA圖,將Unigene基因序列分別于GO、KEGG庫進(jìn)行比對,取相似度>30%,且e<1e-5的注釋。并對篩選出的樣品間差異基因(differential expressed gene,DEG)進(jìn)行差異基因功能顯著性富集分析、KEGG pathway顯著性富集分析。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR (qRT-PCR)對胰島素信號通路相關(guān)分子進(jìn)行驗(yàn)證 用Trizol法對留存的小鼠肝臟樣本提取總RNA,用PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,程序?yàn)?37 ℃15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃∞。通過qRT-PCR檢測ICS Ⅱ?qū)σ葝u素通路相關(guān)差異基因的影響。反應(yīng)體系為15 μL:7.5 μL SYRB GREEN,4 μL水,0.5 μL引物(包括上下游,見表1),3 μL cDNA。反應(yīng)條件為:93 ℃、3 min,93 ℃～60 ℃、45 s,共40個循環(huán)。

表1 胰島素通路相關(guān)差異基因qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 ICS Ⅱ在C57 BL/6小鼠中對HBV DNA的影響 給藥20 d后對Model組、NS組、ICSⅡ組和ENT組血清中HBV DNA的拷貝量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,ICS Ⅱ和ENT都能有效的降低小鼠血清中HBV DNA的拷貝量,與Model組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖1)。

*:與Model組比較,P<0.05。圖1 ICS Ⅱ?qū)BV DNA的影響

2.2 差異基因分析 散點(diǎn)圖能從宏觀上展示組間差異轉(zhuǎn)錄本的多少與上下調(diào)轉(zhuǎn)錄本的個數(shù),紅色代表上調(diào),綠色代表下調(diào),黑色代表沒有差異。結(jié)果顯示,Model組和ICS Ⅱ組相比,上調(diào)的基因?yàn)?82個,下調(diào)的基因?yàn)?56個(圖2)。

圖2 Model組和ICS Ⅱ組差異基因分析

2.3 GO富集功能注釋 GO總共有3個ontology,分別描述基因的分子功能 (molecular function)、所處的細(xì)胞位置 (cellular component)、參與的生物過程 (biological process)。在本次實(shí)驗(yàn)中,將全部的Unigenes進(jìn)行GO功能分類,共注釋到10 075條GO。Model組和ICS Ⅱ組相比,注釋到GO 數(shù)據(jù)庫中的差異基因共有 3 675個。其中,和分子功能相關(guān)的1 212個、和細(xì)胞組分有關(guān)的1 225個、參與生物學(xué)進(jìn)程的1 220個。圖3顯示了3個ontology中差異基因最多的10個GO。

圖3 Model組和ICS Ⅱ組差異基因GO數(shù)據(jù)庫功能注釋

2.4 KEGG通路注釋及分類 功能與基因并不是簡單的一對一的關(guān)系,而是復(fù)雜的多對多關(guān)系。通過關(guān)聯(lián)分析,構(gòu)建功能-功能和功能-基因互作網(wǎng)絡(luò),并利用網(wǎng)絡(luò)分析的手段識別出關(guān)鍵的功能和關(guān)鍵的基因,并基于調(diào)控關(guān)系來闡明基因和功能的作用機(jī)理。KEGG通路注釋結(jié)果顯示,Model組和ICS Ⅱ組的差異基因參與多個信號通路,將Model組與ICS Ⅱ組差異基因與KEGG庫進(jìn)行比對,結(jié)果有493個差異基因被注釋到226條通路中。這些通路主要富集于細(xì)胞內(nèi)吞、PI3K-Akt及MAPK等(圖4),其中參與胰島素通路的差異基因有21個。

圖4 Model組和ICS Ⅱ組差異基因KEGG通路注釋分類

2.5 胰島素通路差異基因驗(yàn)證結(jié)果 臨床研究表明,HBsAg陽性患者的胰島素抵抗指數(shù)和胰島素敏感性檢測指數(shù)均比HBsAg陰性患者高,顯示HBV感染和IR存在著顯著相關(guān)性[11]。由于胰島素通路和HBV聯(lián)系密切,故課題組選擇對胰島素通路相關(guān)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。

如表2所示,通過差異基因顯著富集功能-基因互作網(wǎng)絡(luò)圖選出了參與胰島素通路互作的差異基因6個,分別是Hras原癌基因(HRA Sproto-oncogene,Hras)、葡萄糖激酶(glucokinase,Gck)、磷酸化酶激酶α2(phosphorylase kinase alpha 2,Phka2)、蛋白激酶cAMP依賴性催化亞基β(protein kinase,cAMP dependent,catalytic,beta,Prkacb)、絲/蘇氨酸蛋白激酶2(serine/threonine protein kinase 2,Akt2)和生長因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2,Grb2)。通過熒光定量PCR對測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示ICS Ⅱ能有效下調(diào)Hras、Gck、Phka2、Prkacb、Akt2和Grb2基因(圖5),和測序結(jié)果一致,代表測序結(jié)果具有可信度,可用于下一步ICS Ⅱ抗HBV機(jī)制的探索。

*:與Model組比較,P<0.05。圖5 ICSⅡ?qū)σ葝u素信號通路相關(guān)基因mRNA水平的影響

表2 胰島素通路相關(guān)差異基因

3 討論

本研究采用RNA-Seq對經(jīng)ICS Ⅱ處理后的HBV復(fù)制型C57BL/6小鼠肝臟組織進(jìn)行測序,經(jīng)過數(shù)據(jù)分析得到差異基因共3 675個,主要涉及細(xì)胞組成、生物過程和結(jié)合功能。KEGG通路注釋結(jié)果顯示差異基因參與最多的是細(xì)胞內(nèi)吞信號通路。

IR指正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)。機(jī)體尤其是肌肉、脂肪組織對胰島素不敏感,使胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用效率下降,機(jī)體代償性分泌過多胰島素以維持血糖的穩(wěn)定,同時產(chǎn)生高胰島素血癥[12-13]。研究表明,HBV感染可導(dǎo)致IR的產(chǎn)生[14-15],因?yàn)樵诼訦BV感染時,肝臟在抵抗病毒清除的過程中反復(fù)受到免疫細(xì)胞的侵害,為了補(bǔ)償組織損傷機(jī)體會啟動肝臟再生。但肝臟再生需要胰島素受體信號傳導(dǎo),而HBV感染的肝細(xì)胞對胰島素刺激不敏感,導(dǎo)致肝再生延遲[16]。同時,在肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7細(xì)胞中,過表達(dá)HBV前S2蛋白(pre-S2) 對外周組織(肝臟周圍的器官組織)胰島素受體基因有明顯下調(diào)作用,且胰島素受體數(shù)目減少及生理作用下降也是發(fā)生IR的原因之一[17]。

HBV核心抗原結(jié)合蛋白C-12可下調(diào)胰島素受體(NM.000208)的表達(dá)[18],而HBx蛋白能夠增強(qiáng)SOCS3蛋白表達(dá),降低胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)蛋白的表達(dá),IRS1的減少可導(dǎo)致胰島素受體生成減少,最終導(dǎo)致IR[19-20]。

原癌基因Hras的轉(zhuǎn)錄水平在HBV患者中較高[21],而基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法探究白芨治療糖尿病足作用機(jī)制時發(fā)現(xiàn),白芨活性成分可能通過調(diào)控Hras、AKT1和EGFR等發(fā)揮作用[22]。同時,Akt2與HBV的復(fù)制也密切相關(guān),HBV能夠在mRNA和蛋白水平上上調(diào)肝癌細(xì)胞Akt2的表達(dá)[23],而PI3K-Akt信號通路參與了IR的發(fā)生[24]。

Gck特異表達(dá)于肝細(xì)胞,是胰島素終末通路的信號分子,負(fù)責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入肝細(xì)胞及活化葡萄糖參與糖原合成過程。故Gck能調(diào)節(jié)空腹血糖水平,且Gck基因變異與第一和第二階段胰島素分泌相關(guān)[25]。也有文獻(xiàn)報道,肝細(xì)胞Gck蛋白參與間歇低氧條件下肝IR的形成[26]。Phka2基因突變能導(dǎo)致糖原累積癥Ⅸa型,導(dǎo)致不能激活糖原磷酸化酶,引起糖原分解障礙并在體內(nèi)貯積。臨床表現(xiàn)為空腹低血糖、肝腫大、轉(zhuǎn)氨酶水平升高等[27]。通過對hsa-miR-223-3p靶基因的預(yù)測及生物信息學(xué)分析可知,在糖尿病的發(fā)病過程中,靶基因Prkacb可能通過胰島素分泌通路發(fā)揮作用[28]。而激活的胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)能通過結(jié)合Grb2導(dǎo)致下游MAPK信號通路的激活,最終激活轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)基因表達(dá),影響胰島β細(xì)胞生長、增殖和存活[29]。

以上文獻(xiàn)說明Hras、Gck、Phka2、Prkacb、Akt2和Grb2作為胰島素通路的相關(guān)基因,從不同的機(jī)制途徑參與了胰島素調(diào)控,ICS Ⅱ能夠下調(diào)這些基因的轉(zhuǎn)錄水平,提示ICS Ⅱ可能通過胰島素通路調(diào)節(jié)HBV的復(fù)制。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在HBV復(fù)制型C57BL/6小鼠中,ICS Ⅱ引起的差異基因涉及多個生物學(xué)過程,參與多個通路的調(diào)節(jié)。由于IR和HBV的關(guān)系,課題組重點(diǎn)關(guān)注ICS Ⅱ在抗HBV中對胰島素通路的影響,發(fā)現(xiàn)ICS Ⅱ可能通過下調(diào)胰島素信號通路相關(guān)基因(Hras、Gck、Phka2、Prkacb、Akt2和Grb2)發(fā)揮抗HBV的作用,此發(fā)現(xiàn)為下一步深入研究ICS Ⅱ抗HBV的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。