薛 萊,邱紅梅,黃 波,羅 雯,張昌蘭,孟杉杉,楊 東,楊志堂,蔣青松

(1.江油市人民醫(yī)院 臨床藥學(xué)科,四川 江油 621700;2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室,重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400016;3.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563003)

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病之一,其發(fā)生與胰島素分泌及利用缺陷緊密相關(guān),常伴隨糖脂水平失衡。肝臟是調(diào)節(jié)糖脂代謝的主要器官。有研究發(fā)現(xiàn),糖尿病是肝損傷的一種獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。糖尿病時(shí)血液中長期血糖升高和血脂紊亂可損傷肝臟結(jié)構(gòu)和功能,其引起的肝損傷也被稱為糖尿病肝病,初期的主要特征為脂肪在肝細(xì)胞聚集,又稱為非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)。通常情況下,NAFLD可能并發(fā)炎癥,從脂肪變性進(jìn)展為脂肪性肝炎,即非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH),而后繼續(xù)進(jìn)展為肝纖維化(肝硬化),最終出現(xiàn)肝衰竭[2]。盡管針對糖尿病肝病已進(jìn)行了較多的研究,但其發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明,亦無特異性治療靶點(diǎn)和針對性藥物。

柚[Citrusmaxima(Burm.) Merr.],性味甘、酸、寒,歸肝、脾、胃經(jīng),柚皮苷是其主要活性成分之一。柚皮素(naringenin,NAR)為柚皮苷的苷元,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗糖尿病、保護(hù)肝功能等多種藥理活性[3]。已有研究發(fā)現(xiàn),柚皮素對糖尿病肝損傷有預(yù)防作用[4],但對已經(jīng)形成的糖尿病肝損傷改善作用的研究較少,其相關(guān)機(jī)制尚未闡明。過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)屬于核激素受體超家族,其3種不同亞型,即PPARα、PPARβ和PPARγ均參與了細(xì)胞增殖與分化、機(jī)體炎癥反應(yīng)、糖脂物質(zhì)代謝等重要的生物調(diào)節(jié)過程?，F(xiàn)已公認(rèn),PPARs調(diào)控異常與糖尿病、高血壓、高血脂等代謝紊亂性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[5]。任凱強(qiáng)等[6]的研究發(fā)現(xiàn),PPARs信號通路下調(diào)在糖尿病肝損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。已有實(shí)驗(yàn)提示,柚皮素可激活PPARα和PPARγ,在基因水平調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝[7];柚皮素激活PPARβ,可使高脂模型大鼠血脂水平降低[8];通過激動(dòng)PPARγ相關(guān)信號途徑,柚皮素也可改善大鼠認(rèn)知缺陷[9],減輕膿毒癥小鼠的腸損傷[10]。那么,在糖尿病肝損傷中,柚皮素的作用是否也與其對PPARs信號通路的激活有關(guān),目前未見研究報(bào)道。因此,本研究通過在糖尿病小鼠肝損傷模型中予以不同劑量的柚皮素,初步觀察柚皮素的改善作用,以及該作用與PPARs的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 柚皮素(HPLC,95%)為Sigma公司產(chǎn)品,混懸于羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na),配制成所需濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用清潔級6～8周齡的雄性昆明小鼠40只,體重約(18±2)g;由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【許可證號:SYXK(渝)2012-0001】。建模前,所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.3 試劑 鏈脲菌素(streptozotocin,STZ)購自Sigma公司,用枸櫞酸緩沖液溶解后,調(diào)節(jié)pH值4.1 ～ 4.4,臨用前配制;Trizol、SYBR Green Supermix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara生物制劑公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白酶抑制劑(PMSF)和RIPA裂解液購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司;PPARα、PPARβ和PPARγ鼠多抗購自北京博奧森生物科技公司;天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、總膽固醇(total cholesterol,TCH)、甘油三酯(triglyceride,TG)檢測試劑盒均為南京建成生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.4 儀器 垂直電泳儀(北京六一);CFX Connect TN定量PCR儀、凝膠成像圖像分析系統(tǒng)和ELX-800酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司);光學(xué)顯微鏡(日本 NIKON);血糖儀(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)。

1.5 動(dòng)物模型的建立 將小鼠隨機(jī)分為正常對照組(normal control,NC,n=10)和模型組(model,n=30)。模型組小鼠予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后,連續(xù)5 d腹腔注射予STZ[40 mg/(kg·d)]。7 d后(即STZ 7 d),檢測小鼠的空腹血糖水平(FBG),FBG ≥11.1 mmol/L視為糖尿病小鼠(diabetic model,DM)。繼續(xù)喂養(yǎng)4周后,糖尿病肝損傷形成[9-11]。將糖尿病肝損傷小鼠隨機(jī)分為3組(n=10),分別為:①糖尿病肝損傷模型組:等劑量CMC-Na;②柚皮素低劑量組:NAR 25 mg/(kg·d);③柚皮素高劑量組:NAR 75 mg/(kg·d)。灌胃持續(xù)4周[11-13]。此外,正常對照組小鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)4周后,予等量的枸櫞酸緩沖液腹腔注射,連續(xù)5 d;7 d后檢測其FBG水平,4周后給予等劑量CMC-Na灌胃。觀察小鼠狀態(tài),每周檢測小鼠的FBG水平。

1.6 生化指標(biāo)檢測 小鼠眼眶取血、離心、取上清液。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,檢測不同波長光密度值(AST和ALT:510 nm;TCH和TG:490 nm),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各相應(yīng)指標(biāo)的濃度。

1.7 組織病理學(xué)檢測 脫頸椎處死小鼠,取出肝臟,用4%多聚甲醛浸泡固定24 h,石蠟包埋,將石蠟塊作5 μm冠狀切片,行HE染色,于200×視野下觀察小鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變。

1.8 qRT-PCR檢測PPARα、PPARβ、PPARγ mRNA表達(dá) 引物設(shè)計(jì)參照GenBank中小鼠的基因序列(表1),合成驗(yàn)證單位為上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司。提取肝臟組織總RNA,并測定其濃度。而后利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,采用SYBR Green熒光技術(shù),進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下:95 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s;60 ℃ 30 s,循環(huán)39次。以β-actin作為參考基因,統(tǒng)計(jì)Ct值,根據(jù)相對定量公式對結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 引物序列

1.9 Western Blot法檢測PPARα、PPARβ、PPARγ蛋白表達(dá) 按照蛋白提取說明書步驟,對肝臟組織的總蛋白進(jìn)行提取,使用BCA法測定蛋白含量,并進(jìn)行定量。取30 μg蛋白置于垂直電泳中進(jìn)行分離,轉(zhuǎn)移40 min至PVDF膜上,5 % BSA封閉2 h,加入一抗(β-actin按1∶2 000稀釋,其余均按1∶1 000稀釋),4 ℃搖床孵育過夜,TBST漂洗3次后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (1∶2 000稀釋),室溫?fù)u床孵育1 h,漂洗3次。用ECL發(fā)光試劑顯色,Bio-Rad成像系統(tǒng)成像,用Image Lab軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 柚皮素對小鼠一般情況及血糖的影響 正常小鼠在實(shí)驗(yàn)期間無死亡,一般情況良好;模型組小鼠在建模期間進(jìn)水量和尿量均明顯增加、伴隨精神萎靡,毛色晦暗無光澤;給予STZ后至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,模型組小鼠共死亡2只,柚皮素給藥治療組無小鼠死亡。給予STZ 7 d后,小鼠的FBG水平明顯升高(P<0.01),且模型組小鼠FBG一直維持在20 mmol/L以上直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。4周后給予柚皮素,可劑量依賴性地降低糖尿病肝損傷小鼠的FBG(P<0.05),但仍然遠(yuǎn)高于11.1 mmol/L的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見圖1。

FBG:空腹血糖;STZ:鏈脲菌素; DH:糖尿病肝病;##:與正常對照組比,P<0.01;*、**:與模型組比較,P<0.05、P<0.01;n=8～10。圖1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠空腹血糖值變化情況

2.2 柚皮素對糖尿病小鼠肝臟結(jié)構(gòu)、功能及血脂的影響 小鼠肝臟HE染色提示,正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整,肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(圖2 A);模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞腫脹明顯,其標(biāo)志性結(jié)構(gòu)肝小葉消失,肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等、有張力的空泡,胞漿內(nèi)可見許多脂滴,局部炎細(xì)胞呈灶性浸潤,表示模型組小鼠出現(xiàn)了明顯的肝損傷(圖2 B);同時(shí),模型組小鼠肝功能指標(biāo)AST、ALT水平較正常組顯著升高,血脂(TCH和TG)也明顯升高(P<0.01)。

A:正常對照組;B:模型組;C:柚皮素組:25 mg/(kg·d);D:柚皮素組:75 mg/(kg·d);HE染色,×200。圖2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織病理變化情況

不同劑量柚皮素[25 mg/(kg·d)、75 mg/(kg·d)]干預(yù)后,AST和ALT水平均呈劑量依賴性地降低(P<0.05)。HE染色顯示肝細(xì)胞損傷明顯改善,肝小葉的紊亂程度緩解,脂肪空泡數(shù)量減少,肝細(xì)胞腫脹減輕,柚皮素高劑量組作用更為明顯(圖2 C、D)。同時(shí),TCH和TG水平也呈劑量依賴性下降(P<0.05)。結(jié)果見圖2和表2。

表2 柚皮素對糖尿病小鼠肝功能和血脂水平的影響

2.3 柚皮素對肝臟PPARα、PPARβ、PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠肝臟PPARα、PPARβ和PPARγ的m RNA均明顯下降(P<0.01),mRNA表達(dá)分別減少了62.1%、49.3%、78.8%;蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)(P<0.01),分別減少了68.7%、63.8%、48.4%。柚皮素能濃度依賴性的上調(diào)PPARs mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)果見圖3和圖4。

##:與正常對照組比,P<0.01;*、**:與模型組比較,P<0.05、P<0.01;n=3。圖3 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織PPARs mRNA表達(dá)情況

##:與正常對照組比,P<0.01;*、**:與模型組比較,P<0.05、P<0.01;n=3。圖4 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織PPARs蛋白表達(dá)情況

3 討論

糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病率和死亡率均較高,對人們的身體健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生了廣泛而嚴(yán)重的影響。除常見的糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥外,糖尿病肝病在糖尿病患者中的發(fā)生率也越來越高,但因其臨床表現(xiàn)少,癥狀不典型,經(jīng)常被忽視。隨著其導(dǎo)致的終末期肝病死亡率的增加,糖尿病患者并發(fā)NAFLD、NASH等肝臟疾病也引起了廣泛的關(guān)注和重視[14]。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),長期高能量飼料喂養(yǎng)結(jié)合多次小劑量鏈脲菌素的給予可導(dǎo)致糖尿病肝損傷發(fā)生[11-13]。此次實(shí)驗(yàn)期間,模型小鼠FBG值持續(xù)高于11.1 mmol/L,提示小鼠出現(xiàn)糖尿病且保持穩(wěn)定;模型組小鼠TCH和TG水平明顯升高,提示糖尿病小鼠伴發(fā)血脂紊亂;肝臟組織形態(tài)學(xué)檢查顯示,模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性并伴有炎性細(xì)胞浸潤,小鼠血清AST、ALT水平顯著升高,提示糖尿病小鼠的肝損傷已從NAFLD進(jìn)展到NASH階段。

柚皮素是一種天然的二氫黃酮類化合物,具有廣泛的藥理學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn),柚皮素對糖尿病引起的心肌損傷、視網(wǎng)膜損傷以及神經(jīng)病變均有改善作用[3,15],但關(guān)于柚皮素對糖尿病引起的肝損傷的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)中,給予柚皮素低及高劑量治療均能顯著降低AST和ALT水平,改善肝損傷病理狀態(tài),減少脂肪空泡數(shù)量及炎癥細(xì)胞浸潤,提示柚皮素對糖尿病小鼠肝損傷有改善作用。盡管柚皮素也能降低糖尿病小鼠FBG水平和TCH及TG水平,但仍遠(yuǎn)高于正常對照組,提示柚皮素對糖尿病肝損傷的保護(hù)作用并不完全是通過調(diào)控血糖和血脂水平產(chǎn)生的。

我們前期研究已經(jīng)證實(shí),糖尿病肝損傷小鼠肝臟的PPARα、PPARβ和PPARγ表達(dá)顯著降低,提示PPARs信號通路可能參與了糖尿病肝損傷的病理生理過程[6,13],PPAR受體的3種亞型可能都是糖尿病肝損傷防治的重要作用靶點(diǎn)。羅映等[16]利用放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)和反式激活報(bào)道基因法發(fā)現(xiàn)柚皮素可同時(shí)激活hPPARα、hPPARβ和hPPARγ受體,可能是一個(gè)PPAR泛激動(dòng)劑。本課題組最近研究也發(fā)現(xiàn)[17],在糖尿病小鼠心肌肥厚模型,柚皮素的保護(hù)作用與其對PPARα、PPARβ和PPARγ的激活有關(guān)。與之相似,本研究結(jié)果也顯示,柚皮素在改善糖尿病肝損傷病理變化和肝功能下降的同時(shí),能夠顯著上調(diào)PPARα、PPARβ和PPARγ蛋白和mRNA表達(dá)。這些結(jié)果提示,柚皮素對糖尿病肝損傷的改善作用可能與其激活PPARs受體有關(guān)。

綜上所述,柚皮素對于糖尿病肝損傷具有改善作用,該作用可能與柚皮素激活PPARα、PPARβ和PPARγ的表達(dá)有關(guān)。本研究初步觀察的結(jié)果提示,柚皮素有可能成為治療糖尿病肝損傷并發(fā)癥的有效藥物。但由于糖尿病肝損傷病理生理機(jī)制的復(fù)雜性及柚皮素作用的廣泛性,柚皮素在糖尿病肝損傷中的作用還需進(jìn)行更多臨床前及臨床的深入研究。