當(dāng)歸芍藥散及其拆方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠血小板聚集率及內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的影響

鹿藝星 孫月蒙 孫燕 宗毓麟 閆淑鑫 駢雪 高譽(yù)珊 李宇航

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病、高血壓、高脂血癥等心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ),主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮受損、細(xì)胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAMs)表達(dá)上調(diào)、諸多炎癥因子和脂質(zhì)浸潤、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等在血管內(nèi)大量聚集、血管壁失去彈性、類黃色粥樣斑塊形成[1-3],多累及中、大動(dòng)脈。全球每年死于AS相關(guān)疾病人數(shù)高達(dá)2000 萬,嚴(yán)重威脅著全人類的生命健康[4]。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療AS藥物較多,主要以他汀類為代表,但長期使用導(dǎo)致肝腎損傷等諸多安全問題[5]。中醫(yī)藥在治療AS上具有作用緩和、療效持久、安全性高、副作用少等優(yōu)勢[6]。因此,開展傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療AS的實(shí)驗(yàn)研究以及臨床試驗(yàn)有潛在的發(fā)展前景。

當(dāng)歸芍藥散是《金匱要略》經(jīng)典方劑,具有活血散瘀、養(yǎng)血和血功效,符合AS痰濁內(nèi)生、痰瘀互結(jié)于脈道的證候特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于臨床且療效確切[7-8]。近年來醫(yī)學(xué)界越來越關(guān)注活血散瘀法治療AS的分子機(jī)制,多把血管粘附分子和血小板活化[9]作為血瘀證生成發(fā)展過程中重要的客觀依據(jù)。因此,本研究基于方證對(duì)應(yīng)理論[10-11],從當(dāng)歸芍藥散復(fù)方中拆分出單個(gè)方劑要素進(jìn)行分析,以血小板聚集率和血管內(nèi)皮細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)為切入點(diǎn),研究當(dāng)歸芍藥散及其拆方對(duì)ApoE-/-模型小鼠血小板聚集率和血管內(nèi)皮粘附因子的影響,探討對(duì)AS的防治作用,以期為臨床提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通C57BL/6J 小鼠12 只;SPF級(jí)雄性C57BL/6J ApoE-/-小鼠72 只,6～8 周齡,體質(zhì)量(20±2)g,均購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)動(dòng)物房獨(dú)立通氣籠系統(tǒng),室內(nèi)溫度(25±2)℃,相對(duì)濕度40%～60%,12 小時(shí)明暗交替,自由進(jìn)食與飲水。所有實(shí)驗(yàn)方案得到北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批號(hào):BUCM-4-2021060802-2056)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備

(1)當(dāng)歸芍藥散[12]組成:當(dāng)歸9 g、川芎24 g、白芍48 g、茯苓12 g、白術(shù)12 g、澤瀉24 g;(2)柔肝緩急組:白芍48 g;(3)健脾化濁組:茯苓12 g、白術(shù)12 g、澤瀉24 g;(4)活血散瘀組:當(dāng)歸9 g、川芎24 g。中藥購自北京同仁堂京西藥店有限公司,并由北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論與關(guān)鍵技術(shù)研究中心鑒定為正品。(蒸餾水浸泡中藥30 分鐘,武火煮沸后使用文火煎煮30 分鐘,提取藥液。再加入蒸餾水重復(fù)煎煮,去滓,將兩次提取的藥液混合,進(jìn)行水浴蒸發(fā)濃縮,使用200目過濾網(wǎng)過濾制備中藥液,置于4℃冰箱中儲(chǔ)存以灌胃給藥。阿托伐他汀鈣片磨成粉末,使用蒸餾水制備成2 mg/mL懸浮液,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

阿托伐他汀鈣組:阿托伐他汀鈣片,由輝瑞制藥有限公司(美國,紐約)提供,批號(hào):H20051408,規(guī)格:20 mg/片。

1.3 主要試劑與儀器

4%多聚甲醛(OUBEI,OB10341-1);PBS緩沖液干粉(百瑞極,BN20220-L);粉劑型抗原修復(fù)液(邁新,MVS-0066);DAB顯色試劑盒(邁新,2109290031H);即用型免疫組化染色試劑盒(邁新,2108029706C);ICAM-1 Rabbit PolyAb兔多克隆抗體(proteintech,10020-1-AP);VCAM-1 Rabbit mAb兔多克隆抗體(Cell Signaling Technology,D2T4N);無水乙醇(國藥集團(tuán),10009218);二甲苯(國藥集團(tuán),10023418);氯化鈉溶液(OUBEI,OB20926);改良油紅O染色液(索萊寶, G1261)。

獨(dú)立通氣籠IVC飼養(yǎng)籠(江蘇,蘇杭科技器材有限公司);AL204電子天平(上海,梅特勒托利多儀器有限公司);正置顯微鏡(德國Leica,DM4B);YD-6L生物組織包埋機(jī)(金華市,益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市,中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海,恒科學(xué)儀器有限公司);普通體式顯微鏡(日本,SWZ745T);THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器(太倉市,實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);血小板聚集儀(美國,CHRONO-LOG)。

1.4 分組及給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 天后,將12 只普通C57BL/6J小鼠作為空白對(duì)照組,給予普通飲食飼養(yǎng)。72 只ApoE-/-小鼠給予高脂飲食(含15%豬油、2%膽固醇、0.05%膽酸,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)隨機(jī)分為模型組、當(dāng)歸芍藥散組、柔肝緩急組、健脾化濁組、活血散瘀組和阿托伐他汀鈣組,每組12 只。連續(xù)16 周,建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。

生藥劑量比例參照《方劑學(xué)》[12],根據(jù)“人與動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表”折算[13],從實(shí)驗(yàn)第一天開始給每組動(dòng)物進(jìn)行預(yù)防給藥,灌胃時(shí)間連續(xù)16 周,當(dāng)歸芍藥散組、柔肝緩急組、健脾化濁組和活血散瘀組日給藥劑量分別為:16.77 g/kg、6.24 g/kg、6.24 g/kg、4.29 g/kg,阿托伐他汀鈣片組給藥劑量為5 mg/kg。小鼠給藥體積為0.2 mL/10 g,模型組和正常組給予等體積蒸餾水。

1.5 取材與檢測指標(biāo)

1.5.1 樣本采集 在實(shí)驗(yàn)第16 周結(jié)束,末次給藥后12 小時(shí),禁食不禁水。記錄小鼠體質(zhì)量等一般情況,腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉。采用眼球取血法收集約1～1.5 mL血液,各組隨機(jī)選取6 只小鼠眼球取血后將血液置于含0.1%肝素鈉的1.5 mL抗凝管中以檢測血小板聚集率,另外6 只小鼠眼球取血后將血液置于1.5 mL離心管中,用于血脂檢測;取血后在普通體式顯微鏡下開胸分離主動(dòng)脈弓至髂動(dòng)脈分叉處,清除外膜脂肪組織,用PBS緩沖液進(jìn)行沖洗直至由紅色變成無色透明,完成整個(gè)主動(dòng)脈剝離并進(jìn)行拍照,置于4%多聚甲醛中固定備用。小鼠主動(dòng)脈血管取材后,分別以每組6 只環(huán)切(血管垂直放入)、另外6 只縱切(血管水平放入)的方式,置于裝好OCT包埋劑的離心管內(nèi),并將主動(dòng)脈血管在離心管內(nèi)的位置用標(biāo)記筆大致標(biāo)出。

1.5.2 主動(dòng)脈油紅O染色 取6 只環(huán)切的主動(dòng)脈血管,按標(biāo)記筆標(biāo)記的位置進(jìn)行修片,自出現(xiàn)血管組織開始,以10 μm厚度,每切三次取一張,連續(xù)留片,按照改良油紅O試劑盒說明書進(jìn)行染色。使用正置顯微鏡拍攝血管切片染色,以觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積大小。用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)AS斑塊進(jìn)行標(biāo)注和測量,計(jì)算斑塊面積與管腔面積比值,并評(píng)估AS模型是否成立以及各給藥組的干預(yù)效果。計(jì)算公式:斑塊面積占比=斑塊面積/管腔面積。

1.5.3 血小板聚集率檢測 將每組6 只小鼠血液置于含0.1%肝素鈉的1.5 mL抗凝管中,采用比濁法在血小板聚集儀上進(jìn)行血小板聚集率的檢測。

1.5.4 活血散瘀療效評(píng)價(jià) 采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)小鼠縱切血管圖片進(jìn)行分析,計(jì)算非斑塊面積與血管縱切總面積的比值,得出非斑塊面積率,然后除以血小板聚集率,給予活血散瘀療效評(píng)價(jià)。計(jì)算公式:活血散瘀療效評(píng)價(jià)=(縱切血管總面積-縱切斑塊面積)/縱切血管總面積/血小板聚集率。

1.5.5 血管內(nèi)皮粘附因子水平 每組取另6 只縱切主動(dòng)脈血管用于分子生物學(xué)檢測,按照試劑說明書步驟采用SP法檢測,ICAM-1、VCAM-1抗體分別用PBS按1∶280、1∶50比例稀釋,光鏡下觀測小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮粘附因子的表達(dá)。采用ImagePlus 6.0圖像分析軟件對(duì)免疫組化切片陽性表達(dá)區(qū)域的積分吸光度進(jìn)行測定,計(jì)算平均吸光度(積分吸光度/主動(dòng)脈橫截面積),以平均吸光度表示血管內(nèi)皮粘附因子在主動(dòng)脈中的表達(dá)強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)干預(yù)16 周后,正常組小鼠形體適中,反應(yīng)靈敏,活動(dòng)自如,毛色光亮,納食佳,大小便均正常;模型組小鼠形體偏胖,反應(yīng)較遲鈍,毛色較正常組小鼠晦暗且有脫落現(xiàn)象,納食較多,大便稍硬,小便正常;當(dāng)歸芍藥散組小鼠形體適中,反應(yīng)靈敏,活動(dòng)度較好,毛質(zhì)光亮順滑,神態(tài)安詳,納食佳,大小便正常;柔肝緩急組小鼠較模型組小鼠偏瘦,反應(yīng)稍靈敏,活動(dòng)度良好,毛色較差,納食減少,大便稍軟,小便正常;健脾化濁組小鼠形體偏瘦,反應(yīng)較為靈敏,活動(dòng)度較好,毛質(zhì)順滑有光澤,納食佳,大便軟,小便正常;活血散瘀組小鼠形體偏瘦,反應(yīng)較靈活,活動(dòng)度好,毛質(zhì)順滑有光澤,納食如常,大便稍軟,小便正常;阿托伐他汀鈣組小鼠形體適中,反應(yīng)敏捷,毛質(zhì)光亮順滑,精神略躁,納食欠佳,大小便均正常。

2.2 各組小鼠主動(dòng)脈油紅O染色結(jié)果

與正常組相比,模型組小鼠主動(dòng)脈處斑塊堆積明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),證明AS造模成功;與模型組相比,各給藥組小鼠斑塊面積占比均不同程度減小,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。斑塊面積占比順序依次為:當(dāng)歸芍藥散組<活血散瘀組<健脾化濁組<阿托伐他汀鈣組<柔肝緩急組。與當(dāng)歸芍藥散組比較,其余給藥組斑塊面積顯著變大(P<0.05);與活血散瘀組比較,柔肝緩急組與阿托伐他汀鈣組斑塊面積顯著變大(P<0.05)。見圖1、表1。

注:A正常組;B 模型組;C 當(dāng)歸芍藥散組;D 柔肝緩急組;E 健脾化濁組;F 活血散瘀組;G 阿托伐他汀鈣組。

表1 各組小鼠斑塊面積占比

2.3 各組小鼠血小板聚集率比較

與正常組比較,模型組血小板聚集率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,給藥組小鼠血小板聚集率均降低,其中當(dāng)歸芍藥散組和活血散瘀組血小板聚集率顯著降低,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各拆方組中,活血散瘀組降低血小板聚集率作用好,健脾化濁組次之,柔肝緩急組再次之,且與活血散瘀組比較,兩拆方組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與當(dāng)歸芍藥散組比較,柔肝緩急組、健脾化濁組與阿托伐他汀鈣組血小板聚集率顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血小板聚集率檢測

表3 各組小鼠活血散瘀療效評(píng)價(jià)

2.4 各組小鼠活血散瘀療效評(píng)價(jià)

與正常組比較,模型組活血散瘀療效評(píng)價(jià)低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,各給藥組小鼠療效評(píng)價(jià)均升高,順序依次為:柔肝緩急組<健脾化濁組<阿托伐他汀鈣組<活血散瘀組<當(dāng)歸芍藥散組。其中當(dāng)歸芍藥散組和活血散瘀組縱切非斑塊面積占比高,血小板聚集率數(shù)值小,活血散瘀療效評(píng)價(jià)好。與當(dāng)歸芍藥散組比較,柔肝緩急組、健脾化濁組與阿托伐他汀鈣組療效評(píng)價(jià)水平顯著降低(P<0.05);與活血化瘀組比較,兩拆方組與阿托伐他汀鈣組療效評(píng)價(jià)顯著下降(P<0.05)。見表 3。

2.5 各組小鼠免疫組化染色結(jié)果

ICAM-1和VCAM-1在血管內(nèi)皮集中表達(dá),其陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀。與正常組比較,模型組ICAM-1和VCAM-1在主動(dòng)脈內(nèi)皮表達(dá)顯著增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,各給藥組ICAM-1和VCAM-1表達(dá)均減少,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中當(dāng)歸芍藥散組干預(yù)ICAM-1和VCAM-1效果最好,活血散瘀組次之。與當(dāng)歸芍藥散組比較,柔肝緩急組、健脾化濁組ICAM-1表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與活血化瘀組比較,柔肝緩急組、健脾化濁組ICAM-1表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表4、圖2、圖3。

注:A正常組;B 模型組;C 當(dāng)歸芍藥散組;D 柔肝緩急組;E 健脾化濁組;F 活血散瘀組;G 阿托伐他汀鈣組。

注:A正常組;B 模型組;C 當(dāng)歸芍藥散組;D 柔肝緩急組;E 健脾化濁組;F 活血散瘀組;G 阿托伐他汀鈣組。

表4 小鼠免疫組化粘附因子平均光密度值比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)無動(dòng)脈粥樣硬化的病名,根據(jù)臨床表現(xiàn)可歸屬為 “胸痹”“心痛”“脈積”等范疇?；颊呦忍旆A賦不足或后天失養(yǎng),五臟受損,脾胃運(yùn)化水谷津液功能障礙,產(chǎn)生痰濁、血瘀等病理產(chǎn)物,易結(jié)聚成塊阻滯脈道,血行不利,發(fā)為癥瘕。中醫(yī)認(rèn)為瘀血貫穿AS發(fā)病始終[14],多采用活血散瘀法治療[15]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明具有活血散瘀功效的中藥可以調(diào)節(jié)血流動(dòng)力學(xué)、改善血管通透性、減少內(nèi)皮細(xì)胞破損、通過對(duì)血小板和血管平滑肌細(xì)胞的影響,抑制血栓及減緩斑塊形成,改善AS臨床表現(xiàn)[16]。

近年來關(guān)于中醫(yī)證候的研究取得了極大進(jìn)展,“證候要素”“方劑要素”和“方證要素對(duì)應(yīng)”的相繼提出, 對(duì)于發(fā)展規(guī)范化、 科學(xué)化的中醫(yī)辨證論治體系具有重要價(jià)值[17-19]。以往研究當(dāng)歸芍藥散拆方多從君臣佐使或者藥物功效(血藥、水藥)進(jìn)行簡單劃分[20-23],多體現(xiàn)藥物配伍的主從關(guān)系或者是等級(jí)結(jié)構(gòu),臨床使用該方時(shí)須與本病機(jī)一致。然而患者病機(jī)往往是復(fù)雜的, 很難找到完全相符患者情況的方劑。而“方證要素對(duì)應(yīng)”的組方原則是針對(duì)關(guān)鍵證候要素給與相對(duì)應(yīng)的方劑要素,使組方藥物靶向更加明確,更加強(qiáng)調(diào)理法方藥的邏輯關(guān)系。臨證時(shí)抽取相對(duì)應(yīng)的名方“組件”即可靈活使用,使得組方藥味多而不雜,少而義明。因此,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用“方證要素對(duì)應(yīng)”的中醫(yī)組方原理對(duì)AS的證候要素進(jìn)行分析,分別為:筋脈拘攣、脾虛痰濁內(nèi)生、痰瘀互結(jié),并與當(dāng)歸芍藥散的方劑要素“柔肝緩急”“健脾化濁”“活血散瘀”一一對(duì)應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,活血散瘀組較其他拆方組在減小斑塊面積、降低血小板聚集率和調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子方面效果好,其方劑要素由當(dāng)歸和川芎組成,當(dāng)歸味甘性辛,甘能補(bǔ)血,辛能行能散,辛散之力推動(dòng)氣血周流以養(yǎng)血活血,為血中圣藥;川芎辛溫走竄,為血中氣藥,能活血行氣、調(diào)氣散瘀。二者潤燥相宜,相須為用,養(yǎng)血不致滋膩,祛瘀生新而不傷氣血。在臨床上常配伍使用發(fā)揮養(yǎng)血和血、活血化瘀的功效。

AS是一種慢性血管性炎癥反應(yīng)疾病,血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化是AS發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)。ICAM-1和VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族類,可以增強(qiáng)單核細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)移能力,促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[24]。同時(shí)體內(nèi)表達(dá)過多的血管內(nèi)皮粘附因子也是形成血栓的重要原因[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證患者血清中ICAM-1、VCAM-1存在高水平表達(dá)是衡量瘀血的有效敏感指標(biāo)[27-28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)歸芍藥散組與活血散瘀組可有效抑制或下調(diào)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮ICAM-1和VCAM-1表達(dá),從而減輕AS。此外,血小板大量聚集可促進(jìn)AS脂質(zhì)斑塊的形成和發(fā)展。其機(jī)理是單核細(xì)胞吞噬由血小板產(chǎn)生的富含脂質(zhì)的顆粒,最終發(fā)展成含較多泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)斑塊[29]。本研究表明當(dāng)歸芍藥散及其拆方均能降低血小板聚集率,以活血散瘀方劑要素效果最佳,表明該方劑要素在調(diào)節(jié)ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠血小板聚集率水平、抑制脂質(zhì)斑塊形成起至關(guān)重要的作用。

本研究以血小板聚集率和血管內(nèi)皮粘附分子作為切入點(diǎn),結(jié)合斑塊面積及活血散瘀療效評(píng)價(jià),評(píng)判當(dāng)歸芍藥散及其方劑要素對(duì)AS的防治作用,為臨床使用當(dāng)歸芍藥散及其方劑要素提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這對(duì)于指導(dǎo)臨床中醫(yī)用藥有一定的參考價(jià)值,其中活血散瘀組(當(dāng)歸-川芎)是如何有效減小斑塊面積的信號(hào)通路尚不清楚以及當(dāng)歸芍藥散中方劑要素的兩兩組合對(duì)AS斑塊面積是協(xié)同還是抑制作用,這些問題仍值得進(jìn)一步的研究探索。