田甜 李軍喬 王鑫慈 曲俊儒

摘要 本研究旨在對危害蕨麻的病毒種類進(jìn)行探究，明確引起蕨麻病毒病的主要病原。以青海蕨麻2號(hào)品種和青海蕨麻4號(hào)品系為研究對象，分別編號(hào)為“PA-2”和“PA-4”，利用小RNA測序技術(shù)對其進(jìn)行高通量測序，對測序結(jié)果進(jìn)行處理和拼接后進(jìn)行生信分析，鑒定出病毒種類。結(jié)果顯示，PA-2中共鑒定出9種病毒，其中懸鉤子黃網(wǎng)病毒和覆盆子葉斑駁病毒為主要病毒；PA-4中共鑒定出8種病毒，其中主要病毒為覆盆子葉斑駁病毒、玫瑰黃脈病毒和懸鉤子黃網(wǎng)病毒。經(jīng)過候選病毒有效性檢測，PA-4BF和PA-4GR中均檢測出RLMV，分別比對到2 375 655條reads和1 838 987條reads，占小RNA的81.66%和82.08%，說明RLMV是侵染蕨麻的主要病毒。

關(guān)鍵詞 蕨麻；深度測序；病毒檢測

中圖分類號(hào) S432.1? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）09-0127-07

植物病毒對植物而言是毀滅性的存在，病毒寄生于植物體內(nèi)，破壞植物葉綠素、物質(zhì)代謝以及使植物激素紊亂，導(dǎo)致植物可能出現(xiàn)葉色黃化、生長緩慢以及矮化等癥狀，嚴(yán)重者使植物死亡。至今已報(bào)道的病毒種類大概有1 100多種[1]，病毒侵染植物速度快而且傳播途徑多，一旦在植物中流行，就會(huì)造成嚴(yán)重的損失。因此，對植物進(jìn)行病毒檢測以預(yù)防病毒侵染在植物研究中顯得尤為重要。目前，病毒檢測手段已較為成熟[2-5]，小RNA深度測序在植物病毒檢測中也被廣泛應(yīng)用[6]。小RNA深度測序鑒定病毒是利用植物寄主本身被病毒侵染時(shí)發(fā)生的RNA沉默反應(yīng)產(chǎn)生的siRNA來鑒定病毒的存在以及通過序列比對確定病毒種類[7-8]。該方法省時(shí)、高效且不限制是DNA病毒還是RNA病毒，在植物病毒鑒定中發(fā)揮了巨大的作用[9-10]。

蕨麻（Potentilla anserina L.），俗稱“人參果”，是薔薇科鵝絨委陵菜屬的一個(gè)變種，與其主要的區(qū)別特征是蕨麻的塊根在高原地區(qū)可以膨大[11]。蕨麻內(nèi)含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，作為食品食用已有淵遠(yuǎn)的歷史，在藥用方面，蕨麻可以對腫瘤病毒的復(fù)制產(chǎn)生抗性[12]，具有護(hù)肝和增強(qiáng)免疫力的功效，是優(yōu)質(zhì)的“藥食同源”的資源植物[13]。在西部高原地區(qū)，蕨麻種植產(chǎn)業(yè)是農(nóng)牧民主要經(jīng)濟(jì)來源之一，蕨麻市場價(jià)為200～400 元/kg，經(jīng)濟(jì)效益較高。蕨麻在生態(tài)環(huán)境上可起到修繕土壤、防沙固土的作用，蕨麻根系和匍匐莖發(fā)達(dá)，耐旱、耐寒、克隆性強(qiáng)，生長速度快，因此在固土、涵養(yǎng)水源等方面能夠發(fā)揮作用[11]。2021年8—10月，筆者在青海湟源縣日月藏族鄉(xiāng)蕨麻種質(zhì)資源圃中采挖蕨麻時(shí)發(fā)現(xiàn)，蕨麻地上部分葉片出現(xiàn)皺縮、黃化、畸形以及部分壞死，地下塊根部分出現(xiàn)畸形、變小以及色澤變差等疑似病毒病侵染的癥狀，有些蕨麻品種雖然葉片沒有表現(xiàn)出癥狀，但地下塊根有畸形、變小的表現(xiàn)，導(dǎo)致市場價(jià)值受到影響。研究發(fā)現(xiàn)，植物受到病毒侵染后，其內(nèi)含成分會(huì)受到影響，或降低其主要有效成分[14]，從而影響蕨麻口感。蕨麻病毒病的研究目前相對較少，是一個(gè)非常值得挖掘研究的領(lǐng)域，基于在種植基地的觀察，初步判斷蕨麻的異常癥狀是由病毒侵染造成。為此，本試驗(yàn)采用小RNA深度測序?qū)檫M(jìn)行病毒測序和鑒定，以明確蕨麻中的病毒種類，為后續(xù)病毒病的預(yù)防和研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年9月17日，于青海省湟源日月藏族鄉(xiāng)蕨麻種質(zhì)資源圃采集疑似感病蕨麻，地上部分表現(xiàn)為脈黃、畸形以及皺縮，地下塊根變小、畸形等癥狀（圖1）。以青海蕨麻2號(hào)品種和青海蕨麻4號(hào)品系為研究材料，摘取葉片后，液氮快速冷凍，后帶回實(shí)驗(yàn)室后存貯于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將青海蕨?號(hào)樣品編號(hào)為PA-2，青海蕨麻4號(hào)品系樣品編號(hào)為PA-4。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理及小RNA測序。采用TRlzol試劑提取樣品總RNA，經(jīng)檢測合格后，送至北京百邁客生物科技有限公司，委托其進(jìn)行文庫構(gòu)建和小RNA深度測序。

1.2.2 原始數(shù)據(jù)過濾及18～30 nt小RNA篩選。對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選過濾，即將含有接頭的序列以及低質(zhì)量序列過濾掉。當(dāng)植物被病毒侵染后，體內(nèi)合成的小RNA主要長度在19～24 nt[8]。為了更高效率篩選出合適的序列，先將原始數(shù)據(jù)中18～30 nt的小RNA序列篩選出來得到clean reads，再將clean reads進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.3 樣品候選病毒分析。將篩選出的clean reads序列進(jìn)行注釋，去除掉能夠與非編碼數(shù)據(jù)庫比對上的序列，剩余未知序列使用velvet進(jìn)行序列拼接，拼接后得到較長的重疊群（contigs），與NCBI NT（NCBI non-redundant nucleotide sequences）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到高度同源序列，將沒有比對到的數(shù)據(jù)與NCBI NR（NCBI non-redundant protein sequences）數(shù)據(jù)庫比對，得到部分同源序列，后將在2個(gè)數(shù)據(jù)庫中都比對到的序列，在GenBank Virus RefSeq核酸數(shù)據(jù)庫（簡單表示為“Virus RefSeq Nucletide”），GenBank Virus RefSeq蛋白數(shù)據(jù)庫（簡單表示為“Virus RefSeq Protein”）進(jìn)行比對，得到與病毒同源的contings，根據(jù)其相似度和contigs比對數(shù)，初步評估為候選病毒。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取質(zhì)量檢測

使用Nanodrop和Agileng 2100對提取的蕨麻樣品RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，結(jié)果顯示，樣品PA-2和PA-4的RNA質(zhì)量滿足試驗(yàn)要求（RIN≥7，且28S/18S≥1.8）（表1）。

2.2 小RNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

質(zhì)檢合格的樣本通過Small RNA測序后，樣品PA-2中獲得27 492 685條Raw Reads和25 068 078條有效reads（Clean reads），占Raw reads的91.18%；樣品PA-4中獲得29 769 472條Raw Reads和25 356 893條有效reads（Clean reads），占Raw reads 的85.18%（表2）。兩者皆可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

2.3 18-30 nt小RNA的條數(shù)

由表3可知，在采集到的2個(gè)樣品PA-2和PA-4中，分別篩選到18～30 nt的小RNA數(shù)量為184 840條和219 614條，其中，22 nt、21 nt在樣品中占比最高，在PA-2和PA-4中分別為21.32%、17.99%和19.06%、17.57%。主要以21 nt、22 nt數(shù)量最多（圖2）。

2.4 小RNA的拼接與注釋

利用Bowtie[15]軟件，將Clean Reads分別與Silva數(shù)據(jù)庫[16]、GtRNAdb數(shù)據(jù)庫[17]、Rfam數(shù)據(jù)庫[18]和Repbase數(shù)據(jù)庫[19]進(jìn)行序列比對，對小RNA進(jìn)行分類注釋。由表4可知，rRNA所占比例分別為35.30%（PA-2）和34.00%（PA-4），說明RNA沒有降解，在植物樣品中是質(zhì)量較好的rRNA，文庫構(gòu)建合格[20]。2個(gè)樣品中未知序列的占比都超過了60%，這可能與缺少蕨麻的全基因組有關(guān)。其他小RNA種類占比都較少，除tRNA最高（3.75%）外，其他都在3.00%以下。

在PA-2和PA-4中分別獲得3 471、1 981條contigs，其中，PA-4在病毒核酸數(shù)據(jù)庫中注釋到2條contigs，PA-2中沒有注釋到；在病毒蛋白數(shù)據(jù)庫中分別注釋到92條和136條contigs（表5）。

2.5 候選病毒

由表6可知，PA-2中比對鑒定到9種病毒，其中，與懸鉤子黃網(wǎng)病毒（Rubus yellow net virus，RYNV）同源的contigs最多，有36條；其次是覆盆子葉斑駁病毒（Raspberry leaf mottle virus，RLMV）和原綠球菌噬菌體P-TIM68病毒（Prochlorococcus phage P-TIM68），分別為20、18條；其他病毒比對結(jié)果均為10條以下。PA-4中共比對鑒定到8種病毒，懸鉤子黃網(wǎng)病毒比對到的同源的contigs最多，有15條，其次是覆盆子葉斑駁病毒（Raspberry leaf mottle virus，RLMV）、番茄黃色斑駁相關(guān)病毒（Tomato yellow mottle-associated virus，TYMAV）以及玫瑰黃脈病毒（Rose yellow vein virus，RYVV），分別為13、12和11條，其他病毒比對到的同源的contigs較少，均在10條以下。

通過對蕨麻樣品的候選病毒的初步篩選，PA-2F中鑒定到的RYNV和RLMV可能是其主要病毒。PA-4中主要病毒可能為RLMV、RYVV、RYNV以及TYMAV。對候選病毒進(jìn)行有效性評估、鑒定發(fā)現(xiàn)（表7），RLMV在PA-2和PA-4中比對到的reads分別有2 375 655條和1 838 987條，占總參考序列的81.66%和82.08%，說明候選病毒有效，2種樣品中均包含的主要病毒為RLMV。

3 結(jié)論與討論

深度測序技術(shù)是目前植物病毒學(xué)研究的熱點(diǎn)工具，因其高靈敏度和樣品量少且快速檢測的特點(diǎn)而廣泛被應(yīng)用[21]。本研究中，通過小RNA深度測序研究發(fā)現(xiàn)，小RNA長度集中于21～24 nt，小RNA的長度基本在此范圍內(nèi)[8]，結(jié)果可靠。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，采集的樣品中PA-2和PA-4分別檢測到9種、8種病毒，經(jīng)過候選病毒有效性檢測可知，2個(gè)樣品中均含有RLMV，比對到的reads分別有2 375 655條和1 838 987條，占比分別為81.66%、82.08%。其他病毒比對到的重疊群條數(shù)雖然多，但和有效性不成正比，說明蕨麻中可能含有多種復(fù)合病毒，但主要病毒為RLMV。

RLMV是新發(fā)現(xiàn)的一種暫定為closterovirus屬的病毒[22]，在樹莓中可以造成脆果、果實(shí)變小等嚴(yán)重影響，目前尚未在國內(nèi)有過報(bào)道，而在波蘭、波斯尼亞、美國等國家均有報(bào)道[23-25]，這與不同國家種植得主要產(chǎn)物不同有關(guān)。本研究中，通過序列比對和候選病毒有效性分析在蕨麻中發(fā)現(xiàn)了RLMV，是國內(nèi)的首次相關(guān)報(bào)道。

蕨麻作為青藏高原特有植物資源，其在藥用成分、食用營養(yǎng)成分以及生態(tài)價(jià)值等方面均有研究，是一種優(yōu)良的植物資源[26-27]。觀察發(fā)現(xiàn)，植物葉片出現(xiàn)皺縮、黃化、畸形，塊根變小、畸形等疑似病毒感染癥狀。為探究原因，課題組在土壤成分變化、真菌細(xì)菌感染以及根腐病等方面做了研究，而在病毒上的研究尚未涉及，目前仍處于空白領(lǐng)域。調(diào)查同科植物病毒發(fā)現(xiàn)，薔薇科植物中已研究的病毒種類較多，如在果樹中的草莓[28]、樹莓[29]、梨[30]、桃[31]，花卉中的玫瑰、月季[32]等都已有研究。RLMV在薔薇科植物中已有研究，Miros?awa[24]對RLMV研究表明，其會(huì)造成樹莓果實(shí)易碎、植物生長緩慢以及果實(shí)減少等影響，Diego等[25]同樣在樹莓中發(fā)現(xiàn)有RLMV，導(dǎo)致葉脈變黃，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡，在果實(shí)收獲時(shí)，使果實(shí)變得易碎，從而影響產(chǎn)量和品質(zhì)。本試驗(yàn)中，2個(gè)樣品中都檢測到RLMV，說明該病毒在蕨麻中已有一定的傳播范圍，蕨麻塊根大小的變化以及畸形在很大程度上都與其有關(guān)。蕨麻在種植過程中，基本以塊根無性繁殖進(jìn)行播種，連作的耕田制度可能使土壤的營養(yǎng)成分發(fā)生變化[33]，蕨麻生長受到一定影響，再加上秋冬季節(jié)采挖時(shí)不能完全將土里的蕨麻塊根采挖干凈，使得部分蕨麻多年連續(xù)繁殖，給病毒的積累提供了條件，使得多種病毒復(fù)合侵染，積累在蕨麻中。病毒侵染造成蕨麻地上部分出現(xiàn)黃化、皺縮和壞死的癥狀，使得地上部分生物量減少，在秋季蕨麻地下塊根膨大時(shí)，地上部分無法完全轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)提供給塊根[34]，影響塊根的膨大，造成塊根畸形、變小，從而使經(jīng)濟(jì)價(jià)值下降。

研究發(fā)現(xiàn)，通過序列比對得到的病毒除了RLMV外，還包括RYNV和RYVV等，這些病毒在薔薇科植物中均有研究和報(bào)道，也是同科主要病毒的組成部分[32]，這進(jìn)一步說明測序結(jié)果可靠。研究還發(fā)現(xiàn)，病毒浸染植物并不總是單一侵染，大部分以復(fù)合侵染為主。病毒的復(fù)合侵染在植物中非常普遍，張永鵬等[35]對青海部分地區(qū)馬鈴薯病毒檢測中發(fā)現(xiàn)，有2種病毒侵染的樣品占檢測樣品的7.73%；楊小龍[36]對福建福清地區(qū)的馬鈴薯病毒檢測中發(fā)現(xiàn)，同一植株有達(dá)3種病毒同時(shí)侵染；楊波[37]對新疆草莓研究中發(fā)現(xiàn)，有2種病毒復(fù)合侵染的比例達(dá)16.67%。本研究對蕨麻病毒檢測中得到的病毒種類較多，樣本雖為3個(gè)品種和品系的混合樣，但不排除有復(fù)合侵染的可能，病毒的復(fù)合侵染可能造成蕨麻形態(tài)的多樣變化以及地下部分的不同癥狀表現(xiàn)，共同作用而使得蕨麻形變，進(jìn)一步對生態(tài)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值以及藥用和食用價(jià)值產(chǎn)生影響。盡早地發(fā)現(xiàn)病毒病原可以有效防預(yù)，減少損失，因此可在后續(xù)試驗(yàn)中對蕨麻病毒復(fù)合侵染情況做相關(guān)研究，更可以在不同品種中研究病毒的侵染情況，做到早發(fā)現(xiàn)、早防預(yù)。

病毒鑒定方法是發(fā)現(xiàn)植物病毒最重要的一環(huán)，盡管小RNA深度測序?yàn)橹参锊《镜臋z測提供了良好的平臺(tái)，但大量的數(shù)據(jù)和小片段的拼接以及拼接使用的軟件的不同會(huì)對拼接結(jié)果產(chǎn)生一定的影響[8]。再加上拼接的結(jié)果并不能完全是病毒的完整基因組，比對的片段有長有短，比對的一致性高低不一，還需要通過有效性檢測，或通過PCR驗(yàn)證來初步確認(rèn)病毒種類[38，39]。本研究中，RYNV在2個(gè)樣品中均有最多條序列能與之比對，但其有效性卻都不高。研究中還發(fā)現(xiàn)有Prochlorococcus phage P-TIM68，這可能與采樣時(shí)未完全清除樣品表面上的雜質(zhì)有關(guān)。樣品的采集和制備在小RNA病毒檢測測序中也是非常重要的一環(huán)，RNA容易降解且制備過程中易污染，因而需要格外注意RNA的質(zhì)量[21，40]

蕨麻作為青藏高原地區(qū)特色植物，在多方面均已有研究，而對近年來出現(xiàn)疑似感病癥狀的研究相對較少，因此，從病毒學(xué)角度來探究引起蕨麻癥狀的原因以及找出病原是目前較為迫切的研究。植物病毒繁殖快、變異率高、分布和傳播途徑都較廣泛，而目前對植物病毒的防預(yù)主要采用早發(fā)現(xiàn)、早防預(yù)的對策，加之缺少有效的防治藥劑使得病毒成為生產(chǎn)上的難題[41-42]，因此，盡早發(fā)現(xiàn)病毒可以有效對植物進(jìn)行早期預(yù)警和綜合防治，減少損失。在后續(xù)研究中，可將研究方向集中于對得到的病毒種類設(shè)計(jì)引物進(jìn)一步驗(yàn)證病毒的存在以及明確病毒的侵染性強(qiáng)弱、病毒的侵染是否為大范圍的暴發(fā)、病毒的侵染是否會(huì)對蕨麻的藥用成分、食用成分和生態(tài)價(jià)值造成影響以及有什么樣的影響等。

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基金項(xiàng)目 青海省重點(diǎn)研發(fā)與轉(zhuǎn)化計(jì)劃（2022-NK-120）和青海民族大學(xué)2021年研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（54M2021005）。

作者簡介 田甜（1997—），女，貴州銅仁人，在讀碩士。研究方向：藥用植物資源學(xué)。