何展坤，崔延春，徐慶國，毛東海

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南 長沙 410125）

花青素是植物的主要次生代謝產(chǎn)物之一，屬于類黃酮化合物，廣泛存在于高等植物如谷物、瓜果及蔬菜中，是一種水溶性的天然色素，具有強抗氧化性[1]。動物代謝試驗表明，食用花青素能夠降低心腦血管疾病以及癌癥風(fēng)險[2]。陳琦等[3]研究發(fā)現(xiàn)，花青素能夠下調(diào)p53基因DNA 甲基化，抑制人口腔表皮樣癌細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡。而花青素的主要成分矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）對于腦缺血等腦部疾病以及帕金森綜合征和阿爾茨海默癥都起到了有效的預(yù)防和控制作用[4-6]。此外，花青素還能起到降血脂的作用。Liu 等[7]通過對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，花青素能夠調(diào)節(jié)小鼠腸道中的微生物群，降低小鼠的血脂，從而達到控制體重的目的。利用有色稻米中的花青素生產(chǎn)的復(fù)方膠囊能有效防治肝臟損傷，特別是對血脂高的人群具有明顯的輔助降血脂效果[8]。

水稻是人類最為重要的糧食作物之一，世界60%以上的人口以稻米為主食。米麩中含有許多對人體有用的活性物質(zhì)，在防癌、抗菌、抗氧化、預(yù)防糖尿病等具有重要的保健功效[9]?；ㄇ嗨卦诘久坠ぶ械睦鄯e，會產(chǎn)生有色稻米，根據(jù)花青素含量的不同，可使稻米果皮呈現(xiàn)黑（紫）、紅、黃等不同顏色，其中以黑米和紅米最為常見[8]。與普通白米相比，有色稻米具有提高人體免疫力，預(yù)防疾病等功效，具有重要的營養(yǎng)及保健價值。隨著我國居民生活水平提高，對稻米品質(zhì)及健康功能性稻米的要求越來越高，水稻產(chǎn)業(yè)發(fā)展不僅要解決人們的溫飽問題，還要滿足人們對健康高品質(zhì)生活的向往。因此，未來稻米產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展，必須選育開發(fā)“藥食同源”有色健康功能性稻米新品種，實現(xiàn)有色稻米主食化及其優(yōu)質(zhì)功能性稻米產(chǎn)業(yè)的升級[10]。

功能性稻米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展離不開種質(zhì)資源的創(chuàng)新及品種的改良，而優(yōu)異基因的發(fā)掘是種源創(chuàng)新和品種改良的關(guān)鍵。當(dāng)前可用于健康功能性水稻品種培育的果皮花青素基因資源還十分有限。已克隆的控制水稻果皮顏色的主效基因包括Rc、Rd、OsKala1，OsMYB3（也稱為OsKala3）、OsKala4和OsTTG1基因[11-12]。植物組織中花青素的生物合成主要由三種轉(zhuǎn)錄因子R2R3MYB、bHLH 和WDR 組成的MBW（MYB-bHLH-WD40）三聚體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物激活[13]。Rc和OsKala4負責(zé)編碼bHLH 蛋白，分別控制水稻紅色和黑色果皮性狀[14]。OsMYB3編碼一個R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子，是水稻果皮中花青素合成的關(guān)鍵基因，其在黑米中的表達水平明顯高于白米，黑米中敲除該基因會導(dǎo)致谷物中19 種花青素代謝物和許多其他類黃酮的顯著下調(diào)[15]。OsTTG1負責(zé)編碼WD40 蛋白，東蘭墨米敲除OsTTG1后，其谷粒、穎尖和葉耳的花青素積累量顯著減少或消失[12]。Rd和OsKala1負責(zé)編碼DFR 蛋白，在花青素合成途徑中負責(zé)將二氫槲皮素的羰基還原，產(chǎn)生不穩(wěn)定的中間體無色花青素[16]。在最新的研究中揭示了OsKala4的等位基因OsS1控制水稻莖稈和穎殼的著色，在花青素合成通路中S1位于OsC1的上游，通過調(diào)控C1的表達，達到高效調(diào)控下游花青素結(jié)構(gòu)基因表達的目的[17]。此外，其他已克隆的花青素相關(guān)基因都是影響水稻葉片花青素含量，與籽粒無關(guān)，例如，水稻OsC1、OsRb和OsP1是水稻葉片花青素合成的關(guān)鍵基因[18]，其中C1和Rb基因的某些突變導(dǎo)致的人工選擇，是造成野生稻和栽培稻葉片顏色出現(xiàn)性狀分離的原因之一。水稻OsP1能夠與MYB-bHLH-WD40互作共同調(diào)節(jié)水稻葉片中花青素生物合成基因，同時OsP1能夠特異性激活花青素生物合成的上游基因[19]。由此可見，可用于健康功能性水稻種質(zhì)創(chuàng)新及品種改良的基因屈指可數(shù)，有待更多發(fā)掘。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies, GWAS)是一種可以用于連鎖作圖、尋找特定表型性狀有關(guān)的候選基因，以及揭示表型和基因型關(guān)系的一種有效方法[20]。它可直接利用自然群體在全基因組層面發(fā)掘與農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)的遺傳位點，在水稻遺傳改良上已被廣泛應(yīng)用。例如，Lu 等[21]利用523 份水稻種質(zhì)資源共定位了17 個與水稻株型相關(guān)的QTL，Tan 等[22]通過測量575 份亞洲栽培稻品種在不同環(huán)境中的微量元素積累，并利用GWAS 解析了稻米中礦質(zhì)元素累積的遺傳基礎(chǔ)。然而，目前尚無水稻果皮花青素含量性狀的GWAS 研究。為此，我們開發(fā)了水稻果皮花青素含量的無損傷檢測技術(shù)，獲得533 份水稻種質(zhì)群體材料的測量數(shù)據(jù)，結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析，試圖剖析水稻果皮花青素含量的遺傳基礎(chǔ)，為健康功能性水稻品種的選育提供理論基礎(chǔ)與基因資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料與田間種植

水稻供試種質(zhì)材料主要來自于東亞、東南亞和南亞的水稻產(chǎn)區(qū)，共533 份亞洲栽培稻（Oryza satiνa L.）種 質(zhì)，包 括294 份 秈 稻（Oryza satiνa subsp. indica）種質(zhì)材料，239 份粳稻（Oryza satiνa subsp. japonica）種質(zhì)材料，其中有色稻米共含有29份，27 份紅米以及2 份黑米。水稻種質(zhì)材料分別種植于湖南省長沙市芙蓉區(qū)與海南省三亞市中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所基地。田間種植采用隨機區(qū)組，每個種質(zhì)材料種植1 行（共8 株），株行距為15 cm×15 cm。整個生育期田間管理按一般水稻大田生產(chǎn)管理措施進行。待水稻種子充分成熟后，將每行中間的4 株水稻人工收獲、脫粒后保存。為防止收種及后續(xù)處理過程中的污染，收獲后的種子立即裝入羊皮紙袋中密封保存。

1.2 水稻的花青素表型測定

為防止機械去殼導(dǎo)致水稻糙米的果皮受到損傷，采用人工去殼的方式，采集533 份水稻種質(zhì)材料的糙米并保存到EP 管中。利用活體成像儀以及分光光度計法對不同顏色稻米進行定量測量，并對兩種方法所測量的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性比較分析。

1.2.1 稻米花青素含量的植物活體成像儀分析 水稻糙米果皮花青素含量的植物活體成像儀（VILBER FUSION FX7.EDGE SPECTRA）分析的具體方法如下：分別從每份水稻種質(zhì)材料中，挑選發(fā)育成熟飽滿的糙米作為測量材料，各供試樣品均采用相同的一粒白色米作為對照，然后對測量數(shù)據(jù)進行分析，以經(jīng)過535 nm 波長過濾后的可見光為光源，設(shè)置白色稻米的反射光值為“1”作固定對照，以有色稻米樣品的反射光值作為其花青素的相對含量，每個樣品重復(fù)測定3 次，取平均值。

1.2.2 稻米花青素含量的分光光度計分析 水稻糙米果皮花青素含量的分光光度計分析，按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[NY/T 832-2004]附錄A 黑米色素檢驗方法并稍做修改，具體方法如下：稱取1 g糙米，放置于50 ml 的離心管中，分批次加入20 ml、20 ml、10 ml 的1.5 mol/L 酸化乙醇（HCL/95%乙醇=15/85），在80 ℃的恒溫水浴鍋中浸提1 h。然后將浸提溶液采用高速離心機12 000 r/min 離心5 min，收集上清并定容至50 ml，采用分光光度計在535 nm 處測定其吸光度值（Abs）。根據(jù)以下公式計算各供試糙米樣品花青素的相對含量：

1.3 基因型檢測與分析

533 份供試水稻種質(zhì)材料的單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因型數(shù)據(jù)，均來自5 k 高密度SNP 數(shù)組，利用TASSEL 5.2.81 軟件過濾掉低質(zhì)量的SNP 位點，選擇最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05，最小計數(shù)＜150 及缺失率≥20%后，剩余65 523 個SNP 用于后續(xù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析。

1.4 水稻種質(zhì)材料的重測序

供試水稻種質(zhì)材料的基因型分析，采用第二代測序技術(shù)（Next generation sequencing, NGS）對各供試水稻種質(zhì)材料進行全基因組重測序（Wholegenome resequencing，WGRS）。在去除低質(zhì)量堿基和接頭序列后，總共產(chǎn)生9 627 694 000 條高質(zhì)量的讀序列（reads），1 245.30 Gbp 的堿基數(shù)據(jù)，重測序數(shù)據(jù)從課題組已有數(shù)據(jù)中獲得[22-23]。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用TASSEL 對50 K SNP 標(biāo)記與供試水稻種質(zhì)糙米果皮的表型數(shù)據(jù)間進行關(guān)聯(lián)分析，為減少GWAS結(jié)果中的假陽性，全基因組范圍閾值根據(jù)0.05水平的Bonff eroni 校正法進行篩選，即全部材料中閾值為1e-6，位點的P值小于閾值，則記為顯著關(guān)聯(lián)位點（Signif icant association loci，SAL）。

為了比較各供試水稻種質(zhì)稻米花青素含量，通過植物活體成像儀和分光光度計兩種不同方法獲得的糙米果皮顏色數(shù)據(jù)，進行相關(guān)性分析，并對活體成像測量的結(jié)果進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。分析采用TASSEL 5.2.81 軟件和混合線性模型算法（MLM）完成。GWAS 結(jié)果用Manhattan 圖和QQ-Plot 圖顯示，Manhattan 圖表示水稻全基因組中與花青素有關(guān)的顯著位點以及P值，QQ-Plot 圖表示該模型下的關(guān)聯(lián)分析效果。然后在國家水稻數(shù)據(jù)中心（http://www.ricedata.cn）以及NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，尋找已克隆或定位的與水稻花青素相關(guān)基因的位置信息，與本研究所檢測的QTL 進行共定位。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本研究中的數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 進行T檢驗等統(tǒng)計分析。利用國家水稻數(shù)據(jù)中心（http://www.ricedata.cn）以及NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載候選基因的蛋白序列；rapdb網(wǎng)站(https://rapdb.dna.aff rc.go.jp/tools/blast)對候選基因的蛋白序列進行同源性比對，并利用MEGA_11.03.13 軟件進行進化樹構(gòu)建；利用表達譜數(shù)據(jù)庫（http://www.bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efpWeb.cgi）分析候選基因在不同組織、不同時期的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻果皮花青素含量的檢測

通過活體成像儀，獲取不同果皮顏色水稻種質(zhì)的糙米在535 nm 波長下的顯色圖（圖1）。如圖1所示，不同果皮顏色水稻種質(zhì)的糙米按照其顏色深淺依次由低到高排列，將排列第1 位的白色米作為對照水稻種質(zhì)（圖1 A），隨后對各供試水稻種質(zhì)果皮顏色獲取的圖片分別做進一步的花青素含量的定量分析。分析過程中將水稻種質(zhì)白色米對照的反射光值設(shè)為1，各供試水稻種質(zhì)有色稻米的反色光值則為1～0 之間，其果皮顏色越深，則其反射光值越低。

圖1 不同水稻種皮顏色表型以及相關(guān)性分析Fig. 1 Rice phenotypes and correlation analysis of diff erent rice coats

同時，將測量結(jié)果與中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[NY/T 832-2004]的稻米花青素測量方法的結(jié)果進行對比，二者呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)，與預(yù)期一致，即水稻種質(zhì)糙米果皮顏色越深，其反射光值越低，其花青素含量越高。相關(guān)性分析表明，水稻種質(zhì)糙米反射光值與花青素含量兩者的相關(guān)系數(shù)達到了0.840 6（圖1 D），表明利用活體成像儀分析水稻糙米果皮花青素相對含量的方法是可行的。

2.2 水稻果皮花青素含量的全基因組關(guān)聯(lián)性分析

水稻花青素全基因組關(guān)聯(lián)性分析前，首先利用活體成像儀對533 個水稻種質(zhì)糙米的花青素相對含量進行定量測量，并將此表型數(shù)據(jù)結(jié)果繪制成柱形圖（圖2A）。

圖2 GWAS 群體表型匯總以及主成分分析Fig. 2 GWAS population phenotypic summary and PCA

利用TASSLE 軟件分別對533 份核心群體進行數(shù)據(jù)分析。首先通過群體基因型進行主成分分析（圖2B），發(fā)現(xiàn)本研究中的自然群體存在明顯的群體結(jié)構(gòu)，當(dāng)使用主成份1 和主成份2 作散點圖，可以觀察到整個群體存在明顯的秈粳分化，隨后進行全基因組關(guān)聯(lián)性分析，并選擇以混合線性模型（MLM）鑒定與控制水稻糙米果皮顏色以及花青素有關(guān)的顯著遺傳位點（圖3）。根據(jù)曼哈頓圖所示（圖4），整個基因組共檢測到了725 個與水稻糙米果皮花青素含量有關(guān)的SAL，由于受7 號染色體上控制果皮顏色性狀的RC基因連鎖不平衡的影響，7 號染色體上存在633 個假陽性SNP，排除掉假陽性后共檢測到了92 個SAL。

圖3 水稻果皮性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析的QQ 圖(n=533)Fig. 3 GWAS for rice pericarp traits was showed in quantile-quantile (QQ) plots (n=533)

圖4 水稻糙米果皮性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖(n=533)Fig. 4 GWAS for rice brown rice pericarp traits was showed in Manhattan (n=533).

為了降低假陽性概率，在SNP 上下游200 kb范圍內(nèi)如果存在2 個顯著相關(guān)SNP 位點則記為1 個QTL 位點，對水稻花青素全基因組關(guān)聯(lián)（GWAS）結(jié)果所檢測到的SNP 進行了QTL 分析，共定位到了13 個與花青素顯著相關(guān)的位點（表1）。將定位到的QTL 與已克隆或定位的水稻花青素相關(guān)基因進行共定位，共定位到21 個基因，包括定位到了兩個控制水稻果皮色澤的主效基因，即位于7 號染色體上RC基因與位于1 號染色體上Rd基因，一個參與葉片花青素合成的關(guān)鍵基因Rb，以及與MYB 家族有關(guān)的15 個基因，其中包括7個 已 被 克 隆 基 因（OsRL3、OSMYB1、OSMYB3、OSMYB4、OSMYB22、OsMYB36b和OsMYB55）和8 個未被克隆的基因OsMYB4-2(LOC_Os01g50720)、OsMYB58-1(LOC_Os02g46780)、LOC_Os02g47190、LOC_Os02g49250、LOC_Os02g49986、OsMYB9-1(LOC_Os02g51799)、LOC_Os02g53670 和LOC_Os03g13310，此外還定位到了OsSRT1、OsMADS78及OsbHLH038基因。

表1 13 個與花青素顯著相關(guān)位點Table 1 13 loci signif icantly associated with anthocyanins

2.3 水稻果皮花青素含量關(guān)聯(lián)位點的候選基因分析

2.3.1 候選基因的同源性分析 對定位到的MYB家族以及bHLH家族候選基因利用MEGA_11.03.13 軟件進行同源性分析后發(fā)現(xiàn)，MYB家族中的OsMYB4、OsMYB22、OsMYB1、OsMYB36b、OsMYB55、OsMYB4-2、OsMYB58-1、LOC_Os02g49986、OsMYB9-1與已知的花青素合成相關(guān)基因OsMYB3和OsC1的同源關(guān)系較近（圖5），bHLH家族中的OsbHLH038與已知基因Rb和OsKala4同源關(guān)系較近，表明上述候選基因與已知花青素相關(guān)基因在功能上存在一定的相似性。

圖5 花青素候選基因中MYB（A）和bHLH（B）家族成員進化樹Fig. 5 Phylogenetic tree of MYB (A) and bHLH (B) family members in anthocyanin candidate genes

2.3.2 候選基因的表達模式分析 利用表達譜數(shù)據(jù)庫對21 個候選基因進行了表達模式分析，在4 個已知的與花青素相關(guān)基因中，Rd基因在種子的生長發(fā)育期表達量最高（圖6A），Rb基因則在種子開始休眠后表達量上升，且在葉片中有高表達（圖6B），而Rc基因在胚的發(fā)育過程中表達量逐步上升并在種子成熟期表達水平達到頂峰（圖6C），MYB家族成員中的OsMYB3基因在胚的發(fā)育過程中保持著高表達，并隨著種子發(fā)育成熟表達量逐步下降（圖6D），對上述四個基因的表達模式分析表明，果皮中花青素的合成與積累與胚的發(fā)育和種子的形成有關(guān)。bHLH家族中的OsbHLH038基因在整個花粉發(fā)育期以及胚根中表達量最高，其次是在種子發(fā)育期表達水平較高（圖7A）。除OsMYB3外的其余14 個MYB 轉(zhuǎn)錄因子，目前尚未有研究報道是否與花青素的合成有關(guān)。表達譜分析表明，OsMYB4和OsMYB36b基因表達模式與OsMYB3相似，均在種子的生長發(fā)育過程中保持高表達（圖7B～7C），而OsMYB22、OsMYB1在種子發(fā)育的球形胚早期表達量最高（圖7D～7E），因此，推測它們可能與果皮中花青素的合成和積累有關(guān)。OsMYB58-1在胚根中表達量最高，進入生殖生長期后其表達量呈現(xiàn)出先升后降的趨勢（圖7F），LOC_Os02g49250在胚根和整個種子發(fā)育時期表達量最高（圖7G），OsMYB9-1在胚根和葉片中表達量最高，在種子發(fā)育后期也有一定的表達（圖7H），LOC_Os03g13310在葉片、頂端分生組織萌發(fā)期、花粉發(fā)育期以及種子發(fā)育期都有較高表達（圖7I），從這四個基因在種子發(fā)育期的表達量可以推測，它們很可能參與了果皮中花青素的調(diào)控。而其他6 個MYB家族基因中，OsRL3、LOC_Os02g4719、0LOC_Os02g53670雖 在種子中也有表達（圖8A，8D，8F），但與OsMYB3的同源關(guān)系較遠，OsMYB55、OsMYB4-2與LOC_Os02g49986基因在種子中的表達水平較低（圖8B，8C，8E），因此它們作為花青素候選基因的可能性很小。OsSRT1基因在莖尖分生組織和幼穗以及幼根中表達量最高（圖8G）。OsMADS78是具有M-α型的MADS-box 家族基因，該基因在花藥和幼穗其次是種子中表達量最高（圖8H）。

圖6 花青素主效基因表達圖譜Fig. 6 The expression prof iles from anthocyanin potent gene microarray data

圖7 花青素候選基因表達圖譜Fig. 7 The expression prof iles of anthocyanin candidate genes

圖8 花青素非候選基因表達圖譜Fig. 8 The expression prof iles of anthocyanin non-candidate genes

3 討論

3.1 利用植物活體成像系統(tǒng)開發(fā)了稻米花青素的無損傷定量檢測技術(shù)

本研究所發(fā)明的活體成像技術(shù)檢測水稻花青素相對含量的方法，具有高效、精準(zhǔn)、無損傷、無污染的優(yōu)點。此方法不僅能夠節(jié)約成本，而且能在不損傷水稻種胚的情況下完成數(shù)據(jù)的測量，同時對所測量的數(shù)據(jù)與中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[NY/T 832-2004]的傳統(tǒng)測量方法得到的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩種方法所獲得的數(shù)據(jù)間的正相關(guān)達極顯著水平（R=0.840 6），進一步驗證了該方法的可靠性。以往傳統(tǒng)花青素的提取工藝主要為傳統(tǒng)溶劑萃取法，花青素溶劑主要包括酸化水、乙醇和甲醇等，這種方法雖簡單，但耗時長，且易對環(huán)境造成污染。而本研究研發(fā)的花青素含量定量分析方法是利用了光學(xué)原理，包括最近張東方等[24]發(fā)明的利用光譜技術(shù)測量花青素含量，劉秀英等[25]發(fā)明的高光譜遙感反演測量花青素相對含量的新方法。這些方法都能高效、無損傷、無污染地對花青素含量進行定量分析，為植物花青素測定提供了新的技術(shù)方法參考。

3.2 基于全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘了多個與水稻果皮花青素含量相關(guān)的新基因

3.2.1 已知果皮花青素相關(guān)基因的定位 本研究首次對水稻果皮花青素性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共鑒定到13 個與果皮花青素相關(guān)的QTL 位點，通過對候選基因分析后，確定了9 個新的與花青素合成相關(guān)候選基因。在這13 個QTL 位點中，包括已報道的控制水稻葉色的Rb基因以及控制水稻果皮色澤的關(guān)鍵基因Rc、Rd和OsMYB3。Hu 等[26]將PSH1劃分為兩個緊密連接的bHLH基因Rb1和Rb2，這兩個基因的異位表達導(dǎo)致花青素3-O-葡萄糖苷和牡丹素3-O-葡萄糖苷在葉片、葉鞘和果皮中大量積累，通過進一步研究發(fā)現(xiàn)OsC1和Rb（Rb1和Rb2）之間的顯性互補互作控制了水稻紫色葉鞘性狀，但目前并沒有研究報道Rb基因與果皮花青素的合成相關(guān)。Rc與OsKala4基因是已報道的與水稻果皮色澤相關(guān)的基因，分別控制紅色和黑色果皮性狀[27]。OsMYB3編碼一個R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子，與黑米中花青素的合成有關(guān)，Kim 等[27]在對黑米的研究中表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子OsKala4是決定黑米性狀的主效基因，并發(fā)現(xiàn)OsMYB3編碼的R2R3 MYB 蛋白能夠與OsKala4相互作用介導(dǎo)種子內(nèi)部花青素生物合成基因的活化，進而影響水稻果皮中的色素積累。定位到的這4 個已知花青素相關(guān)基因表明我們基于花青素相對含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析方法的有效性。

3.2.2MYB家族候選基因的定位 除了以上4 個已報道的與花青素有關(guān)的基因外，還定位到了8 個已克隆的基因，其中6 個是來自MYB轉(zhuǎn)錄因子家族，分 別 是OsMYB4、OsMYB22、OsRL3、OsMYB1、OsMYB36b和OsMYB55。已有研究表明，OsMYB4與水稻耐冷性有關(guān)[28]，OsMYB22參與水稻抗稻瘟病基因的調(diào)控[29]，OsMYB1為水稻穗期調(diào)節(jié)的候選基因[30]，OsMYB36b與水稻根部礦物質(zhì)選擇性吸收有關(guān)[31]，目前尚無研究報道它們是否與花青素的合成有關(guān)。通過對候選基因蛋白同源比對及表達譜分析發(fā)現(xiàn)，OsMYB4、OsMYB36b與OsMYB3的同源關(guān)系較近，且三者表達模式基本一致，在種子發(fā)育的五個階段均有較高的表達，因此，OsMYB4、OsMYB36b為花青素合成相關(guān)候選基因的可能性極高。而OsMYB22、OsMYB1基因系統(tǒng)進化樹分析表明，同樣與花青素合成相關(guān)基因OsMYB3和OsC1同源，雖表達模式與OsMYB3不同，但在種子不同發(fā)育階段中都具有較高的表達水平，推測OsMYB22和OsMYB1同樣為果皮花青素合成相關(guān)的候選基因。Park 等[32]的研究表明，OsRL3能夠通過ABA 信號通路促進葉片衰老并延遲鹽脅迫反應(yīng)，但并無與花青素相關(guān)的報道，而Hiratsuka 等[33]的研究中表明ABA 可以促進花青素的合成，由此推斷OsRL3是否能夠通過調(diào)節(jié)ABA 來影響花青素的合成，有待進一步的驗證。此外還定位到8 個未被克隆的MYB家族成員OsMYB4-2、OsMYB58-1、LOC_Os02g47190、LOC_Os02g49250、LOC_Os02g49986、OsMYB9-1、LOC_Os02g53670 和LOC_Os03g13310。系統(tǒng)進化樹分析表明，除LOC_Os02g47190 與LOC_Os02g53670 外，其余6 個成員與已知花青素相關(guān)基因OsMYB3同源關(guān)系較近，結(jié)合表達譜分析發(fā)現(xiàn)OsMYB58-1、LOC_Os02g49250、OsMYB9-1與LOC_Os03g13310 在種子中都具有較高的表達水平，與OsMYB3相似，因此，這4 個基因也很可能與果

皮花青素含量相關(guān)。

3.2.3 其它可能性候選基因的定位 除MYB家族成員外，還定位到了一個bHLH基因OsbHLH038，位于4 號染色體上的組蛋白去乙?；富騉sSRT1以及9 號染色體上的OsMADS78基因。OsbHLH038是個尚未被克隆的新基因，系統(tǒng)進化樹分析表明，其與已知的果皮花青素相關(guān)基因Oskala4具有一定的同源性，且在種子中具有較高表達水平，很可能參與果皮花青素的調(diào)控。Zhang 等[34]的研究表明，OsSRT1可以直接參與種子和幼苗中代謝相關(guān)基因的表觀調(diào)控，位于9 號染色體上的OsMADS78基因能夠影響水稻種子胚乳的發(fā)育進而影響種子的大小[35]，上述兩個基因都參與種子的代謝和發(fā)育，那么猜測是否也會參與水稻果皮中的花青素合成，尚需進一步的研究證實。

4 結(jié)論

1）本研究發(fā)明了一種利用植物活體成像儀測量水稻果皮花青素相對含量的新方法。該方法具有高效、精準(zhǔn)、無損傷、無污染等優(yōu)點，為花青素等植物色素含量的定量分析提供了新的方法參考。

2）通過對核心群體中的花青素測量數(shù)據(jù)進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共定位到了包括Rd、Rb、Rc和OsMYB3基因在內(nèi)的21 個候選基因；通過系統(tǒng)進化樹及表達譜分析，最終確定了8 個MYB家族基 因OsMYB4、OsMYB22、OsMYB1、OsMYB36b、

OsMYB58-1、LOC_Os02g49250、OsMYB9-1、LOC_Os03g13310和1 個bHLH基 因OsbHLH038為 新 的花青素合成相關(guān)的候選基因。新的候選基因的發(fā)掘可為水稻果皮花青素含量的遺傳基礎(chǔ)研究提供參考，對功能性水稻種質(zhì)資源創(chuàng)新與品種改良具有重要意義。