聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法檢測宿遷地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性及其與氯吡格雷抵抗相關(guān)性研究

劉麗平, 陳素梅, 劉東聲, 朱 青, 梁 偉

1.徐州醫(yī)科大學(xué),江蘇 徐州 221004;2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院 檢驗(yàn)科,江蘇 宿遷 223800;3.連云港市贛榆區(qū)人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科,江蘇 連云港 222100;4.徐州醫(yī)科大學(xué)連云港臨床學(xué)院 檢驗(yàn)科,江蘇 連云港 222000

腦卒中為多種原因所致腦組織缺血、缺氧病變,進(jìn)而產(chǎn)生對應(yīng)的神經(jīng)損傷表現(xiàn)。氯吡格雷是腦卒中后最常用的抗血小板藥物之一,在卒中和短暫性腦缺血發(fā)作患者卒中預(yù)防指南中常被推薦作為缺血性卒中的一級治療和二級預(yù)防[1-2]。氯吡格雷屬于前體藥物,在肝中通過CYP2C19酶代謝后產(chǎn)生可以選擇性抑制ADP與P2Y12受體相結(jié)合產(chǎn)物,從而對血小板聚集有抑制作用。CYP2C19酶由CYP2C19基因編碼組成,其基因存在顯著的遺傳多態(tài)性和種族分布差異。有研究報(bào)道,CYP2C19等位基因中的*2、*3及*17基因均對氯吡格雷代謝產(chǎn)生一定的影響[3-4]。CYP2C19*17是由于CYP2C19基因側(cè)翼序列5′端806位點(diǎn)C>T突變,增加CYP2C19 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)而可以增加CYP2C19蛋白產(chǎn)物。有研究報(bào)道,攜帶CYP2C19*17等位基因純合子與雜合子的出血風(fēng)險(xiǎn)分別是未攜帶者的3.41倍和1.85倍[5]。CYP2C19*17基因型攜帶者會(huì)促進(jìn)氯吡格雷活性代謝物的產(chǎn)生、增強(qiáng)血小板聚集抑制效果、提高出血風(fēng)險(xiǎn)及降低缺血事件風(fēng)險(xiǎn)等方面存在一定的相關(guān)性[5-7]。根據(jù)CYP2C19基因*2、*3、*17位點(diǎn)基因型,可將CYP2C19酶分為4類：慢代謝型(*3/*3,*2/*3,*2/*2)、中間代謝型(*17/*3,*17/*2,*1/*3,*1/*2)、快代謝型(*1/*1)及超快代謝型(*17/*17,*1/*17)[8]。分析CYP2C19基因多態(tài)性可推斷其代謝表型,進(jìn)而可預(yù)測藥物代謝能力及藥物療效,指導(dǎo)臨床合理用藥。本研究基于等位基因特異性原理,建立快速檢測CYP2C19基因多態(tài)性的方法,探索特異性檢測最佳反應(yīng)條件,并運(yùn)用所建立方法對健康人群和腦卒中人群CYP2C19基因多態(tài)性等位基因的分布頻率進(jìn)行初步分析,探究等位基因分布與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022年1—6月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療且診斷為初發(fā)急性腦卒中的77例患者設(shè)為腦卒中組,其中,男性44例,女性33例;平均年齡(57.3±11.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡>18歲;漢族;籍貫為宿遷;明確診斷為急性腦卒中,以《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[9]為診斷依據(jù)。另選取同期于本院體檢中心進(jìn)行健康體檢且無血緣關(guān)系的200例健康體檢者設(shè)為健康組,其中,男性103例,女性97例;平均年齡(38.7±12.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：無慢性病;漢族;籍貫為宿遷;經(jīng)過一般體檢,排除其他慢性疾病;標(biāo)本采集前1周內(nèi)未服用藥物。兩組研究對象一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對象均對本研究知情同意。

1.2 基因組DNA提取 分別采集兩組研究對象的外周抗凝血液,采用DNA提取試劑盒(天根生化科技公司),參照說明書操作,提取基因組DNA,經(jīng)核酸濃度檢測儀測定其濃度及純度后,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 單特異性引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中的CYP2C19基因序列,利用Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物。根據(jù)SNP位點(diǎn)等位基因不同,在引物的3′設(shè)計(jì)一對等位基因特異性擴(kuò)增引物,達(dá)到只能特異性擴(kuò)增目標(biāo)堿基而不擴(kuò)增其他堿基的目的。在引物3′末端倒數(shù)第二位或倒數(shù)第三位甚至倒數(shù)第四位引入錯(cuò)配堿基(表1),以增加引物的特異性[10]。同時(shí)設(shè)計(jì)了一對內(nèi)對照引物(Humanβ-Actin-F,Humanβ-Actin-R),以排除因聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)體系中某成分漏加,造成假陰性結(jié)果。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物反應(yīng)體系及退火溫度的選擇 30 μl反應(yīng)體系：包含2×PCR預(yù)混液15 μl,正向rs4986893-R)、(rs12248560-F,rs12248560-R)各15 pmol,模板DNA 50～100 ng,剩余體積以雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件設(shè)定為：94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,退火30 s,每對引物設(shè)置8個(gè)反應(yīng)管,退火溫度分別為延伸40 s,30個(gè)循環(huán)后,PCR產(chǎn)物4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離,凝膠成像儀觀察結(jié)果,選擇無非特異擴(kuò)增條帶且特異性擴(kuò)增條帶最亮的反應(yīng)管,對應(yīng)的退火溫度為后續(xù)反應(yīng)的退火溫度。

表1 單特異性引物列表

1.5 構(gòu)建重組質(zhì)粒 切下大小正確的PCR產(chǎn)物條帶,用膠回收試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)純化回收PCR產(chǎn)物,將純化的PCR產(chǎn)物連接至T-載體,得到重組質(zhì)粒,經(jīng)測序驗(yàn)證帶有目的片段的重組質(zhì)粒分別命名為：T681A,T681G;T636A,T636G;T-806C,T-806T。

用上述得到的重組質(zhì)粒模擬不同基因型：T681A,模擬681A/A純合子;T681G,模擬681G/G純合子;T681A、T681G以1∶1混合模擬681G/A雜合子。同理可得636A/A,636G/G,6363G/A;-806C/C,-806T/T,-806C/T等基因型的純合子和雜合子。

1.6 聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物擴(kuò)增準(zhǔn)確性驗(yàn)證 探究聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primers,PCR-SSP)敏感性及抗干擾性后并應(yīng)用PCR-SSP法對健康組與腦卒中組進(jìn)行PCR擴(kuò)增,隨機(jī)按比例挑選30%純合子和雜合子用測序引物擴(kuò)增后(F+R),對PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序,經(jīng)測序驗(yàn)證結(jié)果與PCR-SSP法檢測結(jié)果完全一致。

2 結(jié)果

2.1 PCR-SSP反應(yīng)退火溫度的確定 溫度梯度PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,在57℃～60℃范圍內(nèi)均可擴(kuò)增出特異性條帶,且在59℃時(shí)條帶最亮,為獲得較高分辨率,后續(xù)選擇59℃為最佳退火溫度,以確保特異性PCR的準(zhǔn)確性。

2.2 PCR-SSP檢測CYP2C19基因型 用質(zhì)粒模擬3個(gè)SNP位點(diǎn)的各種基因型,經(jīng)PCR-SSP反應(yīng)后,各基因型均可準(zhǔn)確分辨。對健康組和腦卒中組DNA樣本PCR-SSP反應(yīng),每個(gè)標(biāo)本采用一對單特異性反向引物與共同正向引物平行擴(kuò)增,每個(gè)反應(yīng)孔中均可見747 bp的內(nèi)對照PCR產(chǎn)物,特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物分別為132 bp、376 bp、341 bp。

2.3 PCR-SSP敏感性及干擾性探究 單特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)引物敏感性及抗干擾性能對反應(yīng)至關(guān)重要,本研究中CYP2C19基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的單特異性擴(kuò)增引物敏感度分別為：rs4244285G,103 copies/μl;rs4244285A,104 copies/μl;rs4986893G,102 copies/μl;rs4986893A,104 copies/μl;rs12248560C,105 copies/μl;rs12248560T,105 copies/μl。

2.4 DNA測序驗(yàn)證 隨機(jī)挑選部分標(biāo)本,采用引物對(rs4244285-F+rs4244285-R)、(rs4986893-F+rs4986893-R)、(rs12248560-F+rs12248560-R)進(jìn)行PCR,產(chǎn)物直接測序,與PCR-SSP法檢測結(jié)果對比,完全一致。見圖1。

2.5 江蘇宿遷地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性分布 采用單特異性引物對健康組和腦卒中組樣本DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。對野生型基因中攜帶1個(gè)功能缺失的等位基因、攜帶2個(gè)功能缺失的等位基因,以及攜帶功能增強(qiáng)等位基因頻率進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,腦卒中組中,攜帶2個(gè)功能缺失等位基因患者的頻率明顯高于健康組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

77例腦卒中患者存在氯吡格雷抵抗的患者30例,氯吡格雷敏感47例;其中,未攜帶功能缺失等位基因25例,發(fā)生氯吡格雷抵抗4例(16.0%);攜帶一個(gè)功能缺失等位基因30例,發(fā)生氯吡格雷抵抗9例(30.0%);攜帶兩個(gè)功能缺失等位基因22例,發(fā)生氯吡格雷抵抗17例(77.3%)。攜帶兩個(gè)功能缺失等位基因氯吡格雷抵抗發(fā)生率高于氯吡格雷敏感,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

圖1 CYP2C19基因測序結(jié)果

表2 宿遷地區(qū)漢族健康組與腦卒中組基因頻率比較/例(百分率/%)

表3 腦卒中組氯吡格雷不同代謝情況的CYP2C19基因頻率比較/例(百分率/%)

3 討論

卒中后常規(guī)使用抗血小板藥物治療,并使用氯吡格雷藥物治療,可顯著降低急性卒中患者復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),是預(yù)防急性卒中后再梗死的重要治療方法[11]。細(xì)胞色素P450(CYP)酶系在抗血小板藥物氯吡格雷代謝中占有極其重要的地位[12]。CYP2C19(S-美芬妥英羥化酶)是CYP酶系中占主導(dǎo)地位的酶之一,其遺傳多態(tài)性對臨床藥物的代謝產(chǎn)生一定的影響,且由于該酶活性的個(gè)體差異較大,造成不同個(gè)體的藥物不良反應(yīng)及藥物治療效率產(chǎn)生較為嚴(yán)重的影響[13]。氯吡格雷在常規(guī)劑量下治療慢代謝型患者時(shí),會(huì)使其活性代謝物及抑制血小板聚集作用降低,提高了血栓形成的風(fēng)險(xiǎn);而在超快代謝型患者中產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物增加,抑制血小板聚集作用增強(qiáng),出血風(fēng)險(xiǎn)相對增加。因此,2010年美國食品及藥物管理局修改了黑框警告：CYP2C19基因型結(jié)果可作為醫(yī)師治療策略調(diào)整的參考[14]。

氯吡格雷是一種前體藥物,其自身不具有活性,但經(jīng)過小腸吸收后約85%的藥物前體經(jīng)過酯酶水解作用變成了無活性物質(zhì),其他約15%的前體藥物會(huì)通過肝生成的代謝產(chǎn)物具有活性。氯吡格雷作為ADP受體拮抗劑之一,可以結(jié)合血小板膜表面ADP受體,并能阻礙血小板膜糖蛋白與纖維蛋白原的結(jié)合,從而產(chǎn)生血小板聚集抑制的現(xiàn)象[15]。但在臨床中,部分患者應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)劑量的氯吡格雷后,并不能取得預(yù)期的抑制血小板聚集效果,被稱為氯吡格雷抵抗或血小板高反應(yīng)性[16]。對氯吡格雷藥效產(chǎn)生影響的因素除了患者年齡、性別、藥物相互作用、吸煙與否、糖尿病及高血脂等因素外,CYP2C19的基因多態(tài)性具有重要的作用[17]。有研究報(bào)道,CYP2C19基因上已有超過35個(gè)SNP位點(diǎn),而大部分位點(diǎn)在亞洲人群中出現(xiàn)的頻率<1%[18]?；贑YP2C19基因的SNP位點(diǎn)在亞洲人群中的分布情況,本研究選擇對CYP2C19*2、*3、*17以及*1(野生型)進(jìn)行檢測。近年來研究發(fā)現(xiàn),CYP2C19酶活性差異與其基因多態(tài)性密切相關(guān),基因型與表型間有良好的一致性?；驒z測較蛋白活性測定具有操作簡便且結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)勢,但同時(shí)具有檢測成本高昂、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。本研究旨在建立快速、靈敏且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的檢測方法(PCR-SSP),引物設(shè)計(jì)和退火溫度選擇是該檢測方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié),PCR-SSP法檢測CYP2C19基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性是基于引物3′末端堿基與模板互補(bǔ),引入倒數(shù)第二或倒數(shù)第三甚至倒數(shù)第四位堿基錯(cuò)配,增加引物與模板結(jié)合不穩(wěn)定性,進(jìn)而提高檢測特異性。

本研究共納入200例健康者與77例腦卒中患者,運(yùn)用PCR-SSP法檢測并分析CYP2C19基因多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)腦卒中患者中,同時(shí)攜帶2個(gè)功能缺失等位基因(CYP2C19*3、CYP2C19*2)的頻率顯著高于健康組,其原因可能是動(dòng)脈粥樣硬化為腦卒中發(fā)病的常見病因,而血小板聚集學(xué)說是眾多闡述動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制學(xué)說之一[19]。經(jīng)血栓彈力圖檢測,發(fā)生氯吡格雷抵抗患者共30例,其中,攜帶兩個(gè)功能缺失等位基因的患者22例,攜帶兩個(gè)功能缺失等位基因患者氯吡格雷抵抗發(fā)生率為77.3%(17/22);未攜帶功能缺失等位基因的患者中也有4例存在氯吡格雷抵抗現(xiàn)象,說明氯吡格雷抵抗現(xiàn)象的發(fā)生不僅與患者自身基因型相關(guān),還可能與其服用的藥物、基礎(chǔ)疾病或接受其他治療手段等因素相關(guān)。此外,由于個(gè)體用藥后存在明顯差異,依臨床治療時(shí)的常規(guī)劑量用藥,可能會(huì)致使部分患者出現(xiàn)過高的血藥濃度而發(fā)生中毒現(xiàn)象,或出現(xiàn)過低的血藥濃度而無法起到治療的效果。因此,可通過基因檢測確定患者的基因類型,依基因多態(tài)性結(jié)果用藥,及時(shí)調(diào)整藥物的劑量或品種,個(gè)體化用藥,進(jìn)而提高治療效果、降低不良反應(yīng)發(fā)生率。

綜上所述,PCR-SSP法可用于CYP2C19基因型的快速檢測,明確宿遷地區(qū)漢族人群的CYP2C19基因型情況,證實(shí)慢代謝型(*3/*3,*2/*3,*2/*2)患者基因型與氯吡格雷抵抗的發(fā)生存在相關(guān)性。