壯藥前列舒外洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

黃蓓 符軍 黃鴻敖 梁國(guó)成 韋世民

【摘 要】 目的：建立壯藥前列舒外洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行洗劑的常規(guī)檢查。方法：對(duì)壯藥前列舒外洗劑進(jìn)行最低裝量及微生物限度檢查；采用薄層色譜法鑒別壯藥前列舒外洗劑中姜黃、三叉苦；采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定壯藥前列舒外洗劑總黃酮的含量。結(jié)果：壯藥前列舒外洗劑最低裝量、微生物限度檢查均符合2020年版《中國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定；薄層色譜中，姜黃、三叉苦的特征斑點(diǎn)顯色清晰，分離效果好，陰性對(duì)照無(wú)干擾；以HCl-Mg法顯色，蘆丁為對(duì)照品，282 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定，蘆丁在22.18～133.08 μg/mL濃度間呈良好的線性關(guān)系好（R2=0.9995，n=6），樣品平均回收率98.14%（RSD=1.04%，n=6）。結(jié)論：所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，可用于壯藥前列舒外洗劑的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】壯藥前列舒外洗劑；薄層色譜法；紫外可見(jiàn)分光光度法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2023）11-0040-05

Abstract：Objective To establish the quality standard of Zhuang Medicine Qianlieshu lotion and to conduct routine examination of the lotion.Methods The minimum quantity and microbial limit of Qianlieshu lotion were examined，and the turmeric and Trischia in Qianlieshu lotion were identified by Thin layer chromatography The content of total flavonoids in Qianlieshu lotion was determined by UV-Vis Spectrophotometer.Results the minimum loading and microbial limit of Qianlieshu lotion were in accordance with the relevant regulations of Chinese pharmacopoeia （2020 edition），and the characteristic spots of turmeric and trisporia were clearly displayed in TLC，HCl-Mg method was used for the determination of rutin at 282 nm wavelength，rutin showed a good linear relationship between the concentrations of 22.18-133.08μg/mL （R2=0.9995，n=6），and the average recovery was 98.14%（RSD=1.04%，n=6），it can be used for quality control of Qianlieshu lotion.

Keywords：Zhuang Medicine Qianlieshu External Lotion;Thin Layer Chromatography;Ultraviolet Visible Spectrophotometer;Quality Standard

壯藥前列舒外洗劑是廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥物研發(fā)中心與男性科結(jié)合中醫(yī)藥理論和壯醫(yī)藥理論研制的用于治療慢性前列腺炎的壯藥制劑，用法為外用坐浴。該洗劑由馬鞭草、扛板歸、了哥王、三叉苦、半枝蓮、鬼針草、姜黃等九味壯藥材組成，具有清熱、祛濕、活血化瘀、緩解疼痛的功效，外洗可用于慢性前列腺炎的治療，臨床應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)研究表明其具有確切的療效［1-4］。為控制制劑質(zhì)量，研究采用薄層色譜法對(duì)其中姜黃、三叉苦進(jìn)行定性鑒別，采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定壯藥前列舒外洗劑總黃酮的含量，并對(duì)其進(jìn)行最低裝量及微生物限度檢查，建立簡(jiǎn)便可行的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 WHF-205B可見(jiàn)透射紫外反射儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；CQ-250超聲波清洗劑（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；GZX-DH-30×35電熱恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.2 材料 姜黃素對(duì)照品（批號(hào)：110823-201706中國(guó)食品藥品檢定研究院）；三叉苦對(duì)照藥材（批號(hào)：121682-201301，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201811，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；水為自制純化水，其余試劑均為分析純。壯藥前列舒外洗劑（批號(hào)：20220104、20220107、20220111，廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥物研發(fā)中心配制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 姜黃薄層鑒別 取壯藥前列舒外洗劑10 mL，濃縮至5 mL，加入50 mL三氯甲烷，超聲30 min后倒入分液漏斗中，待分層后取下層溶液，水浴蒸干，殘?jiān)? mL三氯甲烷使溶解，作為供試品溶液。取缺姜黃陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制得缺姜黃陰性樣品溶液。另取姜黃素對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含0.5 mg姜黃素的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（2020年版《中國(guó)藥典》第四部通則0502）試驗(yàn)［5］，吸取供試品溶液和陰性樣品溶液各7 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-三氯甲烷-甲醇-甲酸（2∶10∶0.7∶0.4）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑，陰性樣品無(wú)干擾。如圖1所示。

2.1.2 三叉苦薄層鑒別 取壯藥前列舒外洗劑15 mL，濃縮至2 mL，加入50 mL乙醇，加熱回流1 h，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹兓?0 mL，超聲處理20 min，過(guò)濾，濾液用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。取缺三叉苦陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制得缺三叉苦陰性樣品溶液。取三叉苦對(duì)照藥材粉末1 g，加50 mL乙醇，按供試品溶液制備方法同法制得三叉苦對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（2020年版《中國(guó)藥典》第四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（5∶5∶1∶ 0.5）靜置30 min后的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置254 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑，陰性樣品無(wú)干擾。結(jié)果如圖2所示。

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液和供試品溶液制備 精密稱取12.0 mg蘆丁對(duì)照品（供UV法測(cè)定，含量為92.4%）置50 mL容量瓶中，加入70%乙醇45 mL，超聲溶解后加70%乙醇至刻度，搖勻，制備成含量為0.2218 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取1 mL壯藥前列舒外洗劑于50 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，超聲1 h后加70%乙醇補(bǔ)足至刻度，振搖均勻，過(guò)濾，收集續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2.2 測(cè)定方法 取供試品溶液1 mL、對(duì)照品溶液 2 mL 置加有0.3 g鎂粉的具塞刻度試管中，將試管置冷水浴中緩慢滴加3 mL濃鹽酸，并不時(shí)振搖試管，最后加入70%乙醇至10 mL刻度處，沸水浴中加熱1 h，取出置冷水中迅速冷，用70%乙醇補(bǔ)足至10 mL，以試劑為空白，按照2020年版《中國(guó)藥典》紫外分光光度法立即在 200～700 nm掃描。結(jié)果供試品與蘆丁在 282 nm左右皆有最大吸收峰，且峰形對(duì)稱（如圖3所示），與查閱的文獻(xiàn)一致［6］，故選擇以蘆丁為對(duì)照品在282 nm處測(cè)定供試品吸光度。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分別置于加有0.3g鎂粉的具塞刻度試管中，按2.2.2的方法測(cè)定吸光度Ａ，以蘆丁對(duì)照品的濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝1.6475X-0.0003（R2=0.9995，n=6），結(jié)果表明蘆丁在 0.02218～0.13308 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（如圖4所示）。

2.2.4 精密度考察 取同一供試品溶液經(jīng)2.2.2項(xiàng)方法處理后，在282 nm波長(zhǎng)處重復(fù)測(cè)定吸光度6次，結(jié)果分別為：0.462、0.458、0.459、0.460、0.458、0.463，RSD =0.46%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性考察 取平行制備的供試品溶液6份，再分別精密吸取1 mL按2.2.2項(xiàng)下方法在282 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果分別為：0.460、0.448、0.459、0.451、0.466、0.450，RSD=1.55%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一供試品測(cè)定液，放置0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、180 min，后在282 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，結(jié)果分別為：0.462、0.460、0.463、0.461、0.459、0.458，RSD=0.41%，說(shuō)明供試品溶液在180 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取6份已知總黃酮含量（mg/mL）的供試品溶液各1 mL，再分別精密加入0.5mL的對(duì)照品溶液（ 0.2218 mg/mL），按2.2.2方法測(cè)定吸收度A，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.8 樣品含量測(cè)定 取3批壯藥前列舒外洗劑各1 mL共6份，按2.2.1項(xiàng)制備供試品溶液，再取1 mL供試品溶液按2.2.2 項(xiàng)方法在282 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，計(jì)算樣品中的總黃酮含量見(jiàn)表2。

2.3 最低裝量檢查 按照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則0942“最低裝量檢查法”檢查3批壯藥前列舒外洗劑。取每批供試品各3瓶，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至預(yù)經(jīng)標(biāo)化的250 mL干燥量筒中。讀出每個(gè)容器內(nèi)容物的裝量，并求其平均裝量，平均裝量應(yīng)不少于標(biāo)示裝量200 mL，每瓶裝量應(yīng)不少于標(biāo)示裝量的97%（194 mL），結(jié)果均符合規(guī)定。見(jiàn)表3。

2.4 微生物限度檢查

2.4.1 供試液制備 取壯藥前列舒外洗劑10 mL，加含5%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，制成1∶10供試液。

2.4.2 檢查方法 依照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則1105、1106 “非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法”檢查。

2.4.3 需氧菌總數(shù)檢查 取1∶10供試液1 mL注皿，依法檢查。

2.4.4 霉菌和酵母菌總數(shù) 取壯藥前列舒外洗液原液1 mL注皿，依法檢查。

2.4.5 控制菌檢查 取1∶10供試液10 mL，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL中，依法檢查金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。

2.4.6 三批壯藥前列舒外洗劑的微生物限度檢查 按上述所建立的微生物限度檢查法，對(duì)三批壯藥前列舒外洗劑進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 薄層色譜研究 由于壯藥前列舒外洗劑由多種壯藥水提制成，成分多樣復(fù)雜，而且各種化學(xué)成分相互干擾的情況十分常見(jiàn)，再加上多種藥材含有相似的黃酮類成分，薄層鑒別過(guò)程中極易出現(xiàn)陰性干擾，阻礙了薄層鑒別研究進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)方中杠板歸、了哥王、馬鞭草、絞股藍(lán)進(jìn)行薄層色譜鑒別研究，均出現(xiàn)陰性干擾情況，姜黃、三叉苦的薄層色譜鑒別特征斑點(diǎn)顯色清晰，分離效果好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，鑒別方法分離度好，穩(wěn)定性高，可行性強(qiáng)。

3.2 顯色方法選擇 紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量常用的顯色法有直接測(cè)定法［7］、NaNO2-AlNO3-NaOH法［8-9］、AlCl3 法［10-11］、HCl-Mg法［6、12］等4種方法。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了以上幾種方法，結(jié)果表明，直接測(cè)定法試劑吸收峰與供試品吸收峰相鄰太近，影響大；NaNO2-AlNO3-NaOH 法中，供試品溶液加入4%NaOH溶液立即出現(xiàn)絮狀沉淀，且供試品溶液在對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)處無(wú)吸收峰；AlCl3 法供試品溶液在對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)處也無(wú)吸收峰；HCl-Mg法供試品溶液與蘆丁對(duì)照品溶液在282 nm左右有最大吸收，且峰形對(duì)稱，故選擇HCl-Mg法為壯藥前列舒外洗液總黃酮含量測(cè)定的顯色方法。

3.3 供試品溶液提取方法選擇 供試品溶液的提取方法曾選用超聲波提取法、回流提取法、正丁醇提取法進(jìn)行比較，結(jié)果正丁醇提取法制備的供試液總黃酮含量較低，超聲提取和回流提取率差別不大，但超聲提取時(shí)間快，效率高，故選用超聲提取法。

3.4 壯醫(yī)理論基礎(chǔ) 壯醫(yī)認(rèn)為毒邪是導(dǎo)致疾病發(fā)生的重要原因，慢性前列腺炎發(fā)病多為人體受到痧、瘴、毒、火、濕等邪毒侵犯，致天、人、地三氣同步失調(diào)，從而導(dǎo)致水道、氣道病變及龍路和火路功能失調(diào)，致咪?。ㄆⅲ?、咪腰（腎）和咪疊（肝）三臟功能失常為主。基于壯醫(yī)理論對(duì)慢性前列腺炎的認(rèn)識(shí)，廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院研發(fā)了壯藥前列舒外洗劑對(duì)慢性前列腺炎患者進(jìn)行熏洗治療，全方由馬鞭草、了哥王、杠板歸、三叉苦、絞股藍(lán)、姜黃等組成，方中三叉苦祛風(fēng)濕、除濕毒；了哥王清熱解毒、消腫止痛、軟堅(jiān)散結(jié)；杠板歸利水消腫；絞股藍(lán)清熱解毒、補(bǔ)脾益氣、調(diào)氣道；以上諸藥合用，作用于龍路、火路，疏通瘀滯，祛濕解毒，恢復(fù)“三道兩路”同步，從而達(dá)到治療目的。我院男性科自2011年以來(lái)，采用壯藥前列舒外洗方治療慢性前列腺炎，取得了很好的療效，將壯藥前列舒外洗方方開(kāi)發(fā)成院內(nèi)制劑，并制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)推動(dòng)民族壯醫(yī)藥特色療法治療慢性前列腺炎具有十分重要的意義。

綜上，研究旨在對(duì)壯藥前列舒外洗劑進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的科學(xué)依據(jù)，并將這一經(jīng)驗(yàn)方開(kāi)發(fā)成院內(nèi)制劑，以便將壯藥理論與臨床治療相結(jié)合，方便患者使用，為臨床治療慢性前列腺炎提供一種新的特色壯藥制劑。但因方中含有多味壯藥材，成分復(fù)雜，再加上多種藥材含有相似的黃酮類成分，干擾成分較多。研究采用薄層色譜法對(duì)姜黃、三叉苦進(jìn)行定性鑒別，采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定壯藥前列舒外洗劑總黃酮的含量，建立簡(jiǎn)便可行的質(zhì)量控制方法。今后研究可增加其他藥味的薄層色譜鑒別及主要藥效成分的含量測(cè)定，進(jìn)一步完善壯藥前列舒外洗劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)

［1］戴芳，陸智華，朱閩，等.壯藥前列舒外洗劑對(duì)ⅢA型前列腺炎患者相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響［J］.西部中醫(yī)藥，2021（8）：136-138.

［2］朱閩，荀建寧，覃兆偉，等.壯藥前列舒外洗劑治療慢性前列腺炎的臨床研究［J］.西部中醫(yī)藥，2015，28（8）：57-59.

［3］朱閩，荀建寧，覃兆偉，等，壯藥前列舒外洗劑治療慢性前列腺炎的臨床觀察［J］.中國(guó)性科學(xué)，2014，23（9）：62-65.

［4］朱閩，荀建寧，覃兆偉.壯藥前列舒外洗劑治療Ⅲ型前列腺炎40例臨床觀察［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17（36）：57-58.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（四部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：39-40.

［6］熱毛先，熱增才旦，周加本，等.藏藥甘青青蘭總黃酮含量測(cè)定方法對(duì)比研究［J］.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2021（6）：49-51.

［7］胥秀英，吉光見(jiàn)稚代，石誠(chéng)岑，等.紅花配方顆粒制備及總黃酮含量測(cè)定研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2020（1）：109-110.

［8］韋瑀龍，黃小鷗，藍(lán)曉慶.固本補(bǔ)腎口服液的總黃酮含量測(cè)定方法研究［J］.實(shí)用藥物與臨床，2016（10）：1287-1289.

［9］郝少君，李文俊，高延玲，等.復(fù)方黃櫨口服液中總黃酮含量測(cè)定方法［J］.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2017（11）：1024-1026.

［10］張瑩，傅靜，王孝勛，等.把天門化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)及其總黃酮含量測(cè)定［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021（3）：137-140，192.

［11］張明，陳華國(guó)，趙超，等.杠板歸中總黃酮的含量測(cè)定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012（18）：77-80.

［12］黨曉芳，曹颯麗，祁娟娟，等.鬼箭羽總黃酮含量測(cè)定方法的建立［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014（9）：96-98.

（收稿日期：2022-09-29 編輯：陶希睿）