銀屑靈顆粒質量標準的研究

張云玲 筆雪艷 馮樂然 趙榮生 高飛 那微

【摘 要】 目的：控制銀屑靈顆粒質量。方法：采用薄層色譜（TLC）法鑒別制劑中赤芍、山銀花、黃柏、防風；采用高效液相色譜法（HPLC）測定制劑中苦參堿的含量。結果：TLC斑點清晰，分辨率好，陰性無干擾?？鄥A的測定在0.137501～4.400046 μg之間有良好的線性關系，線性方程Y=2.0270×106A-2843.7361，r=0.9999，平均回收率為100.07%（RSD=2.2%，n=6）。結論：該質量標準項目設置合理，操作便捷、準確，可用于對銀屑靈顆粒的質量控制。

【關鍵詞】銀屑靈；質量標準；薄層色譜 ；含量測定

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）11-0050-05

Abstract：Objective Establish the quality control method of Yinxieling granules.Methods Radix Paeoniae Rubra，F(xiàn)los Lonicerae，Cortex Phellodendri and Radix sileris were identified by TLC，and the contents of matrine in the preparation were deter mined by HPLC.Results TLC spots were clear，good separation and negative.The content deter mination method of matrine showed a good linear relationship between 0.275003-4.400046 μg.The average recovery of matrine in Yinling granules was 100.07%，（RSD 2.2%，n=6）.Conclusion The method is simple，accurate and effective in separation，andcan be usedto evaluate the quality of Yinling granules.

Keywords：Yinxieling; Quality Standard;TLC Identification; Content Deter Mination

銀屑病，是臨床上常見的一種慢性皮膚病，在中醫(yī)上又稱其為白疕，這種疾病的發(fā)病機制復雜并且容易復發(fā)［1］。臨床上患者深受其擾，生活質量大大下降。對于銀屑病的治療，中醫(yī)藥展現(xiàn)出了其獨特的優(yōu)勢，能極大改善銀屑病的預后［2-3］。銀屑靈顆粒是由苦參、白鮮皮、土茯苓、山銀花、黃柏、蟬蛻、防風、連翹、赤芍、地黃、當歸、甘草等十二味中藥材組成的復方制劑。其中苦參，去濕殺蟲，療風熱細疹，治赤痢惡瘡；白鮮皮在《雷公炮炙藥性解》中可療楊梅諸瘡熱毒，和血脈，通九竅；土茯苓，益脾胃，化濕邪，善治楊梅惡瘡，毒竄筋骨；三藥配合可增強祛風止癢、殺蟲療癬之功。山銀花、連翹，主寒熱，療癰腫惡瘡，消癰散毒，善行上焦；黃柏燥濕清熱，主瀉下焦之火；相和使用可清一身之火。蟬蛻，輕浮發(fā)散，逐邪熱。防風祛邪外出，防護腠理；蟬蛻、防風二藥可引藥達表，增強藥物作用效果。當歸、甘草合用調營養(yǎng)血，以防血虛化燥生風。地黃、牡丹皮、甘草、赤芍，為常用清熱涼血藥配伍藥對［4］兼能活血祛瘀。全方上下與表里同治；驅邪與補益藥同用以防損耗正氣。具有清熱解毒、通絡活血祛濕之效。用于濕熱蘊膚，郁滯不通所致的白疕，癥見皮損呈紅斑濕潤、偶有淺表小膿包，多發(fā)于四肢曲側部位［5］。

銀屑靈顆?，F(xiàn)行質量標準號為YBZ10512005-2009Z，為企業(yè)標準；為更好的對產(chǎn)品的內(nèi)在質量進行控制，對銀屑靈顆粒質量控制的方法進行了實驗研究，取消了原標準中苦參堿和當歸的薄層鑒別，保留了赤芍和鹽酸小檗堿的薄層鑒別，建立了處方中防風的薄層鑒別方法和山銀花特征鑒別；同時采用HPLC法測定苦參堿的含量，將原質量標準HPLC法測定綠原酸刪除。經(jīng)方法學驗證、方法基本可行，可納入質量標準，以期能為其更全面的質量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Sartorius CP225D電子分析天平（德國賽多利斯公司產(chǎn)）；Julabo TW20水浴鍋（日本產(chǎn)）；Waters e2695高效液相色譜儀（日本沃特世公司）；超聲波清洗儀（上?？茖С晝x器有限公司，220v，250w）。高效液相用色譜柱—Angilent SB-C18；Kromasil 100-5-C18；phenomenex Luna C18。

1.2 試劑與試藥 色譜級乙腈、甲醇；水為超純水；其它試驗所用試劑均為分析純；鹽酸小檗堿對照品（110713-202015）、赤芍對照藥材（121093-201804）、防風對照藥材（120947-200907）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（111523-200404）、灰氈毛忍冬皂苷乙對照品（111814-201604）、苦參堿對照品（110805-202010、98.7%）均來源于中國食品藥品檢定研究院。硅膠G預制薄層板為青島海洋公司生產(chǎn)。銀屑靈顆粒15批（哈爾濱大洋制藥股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 黃柏 取本品20 g，研細，加入50 mL無水乙醇，加熱回流40 min，過濾，濾液蒸至約1 mL，作為供試品溶液。按處方配比以同樣方法制備的黃柏陰性樣品，按供試品同樣方法制備作為陰性對照溶液。再取鹽酸小檗堿對照品，加乙醇制成每1 mL含30μg的溶液，作為對照品溶液。分別取待測溶液 2 μL、陰性對照溶液 2 μL、對照品溶液 5 μL，點在同一硅膠 G 薄層板上。以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，取出，干燥，在紫外燈（365 nm）下檢測。在供試品的色譜圖中，與對照品比較在色譜圖的對應位置，顯示相同顏色的熒光點，而陰性對照溶液在與鹽酸小檗堿色譜相應位置上未出現(xiàn)相同熒光斑點，表明陰性對照無干擾，該方法專屬性良好。如圖1所示。

2.1.2 赤芍 取本品20 g，研細，加入30 mL乙醇溶液，經(jīng)30 min超聲處理，過濾，濾液蒸干，殘渣加入15 mL水使其溶解，過濾，濾液用乙醚振搖萃取2次，每次15 mL，棄乙醚溶液，用水飽和正丁醇萃取3次，每次15次 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，使殘渣溶解于1 mL乙醇溶液中，作為供試品溶液。取另一份按規(guī)定比例制備的缺赤芍陰性樣品，用同樣的方法制備陰性對照溶液。取0.5 g赤芍對照藥材，加入10 mL乙醇，振搖萃取5 min，過濾，濾液蒸干，殘渣中加入2 mL 乙醇，使其溶解，作為對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，并將它們分別點在以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的同一硅膠G薄層上。以氯仿-甲醇-乙酸乙酯（8∶4∶1）為展開劑，展開，取出，自然晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至顏色清晰，出現(xiàn)斑點。供試品色譜圖中，與對照藥材色譜圖對應的位置有相同顏色的斑點，而陰性對照溶液在與對照藥材色譜相應位置上無相同顏色斑點出現(xiàn)，表明陰性對照液對赤芍的鑒別無干擾，專屬性良好。如圖2所示。

2.1.3 防風［6-7］ 取本品20 g，研細，加入50 mL丙酮溶液，并經(jīng)過20 min的超聲處理，過濾，將濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。同時按照處方比例將制備好的無防風陰性樣品采用同樣的方法制成陰性對照溶液。另取防風對照藥材1 g，同樣方法制備對照藥材溶液。再取5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品，加入乙醇制成濃度為1 mg·mL-1的溶液。吸取上述4種溶液各5 μL，分別點在同一硅膠 GF254薄層板上。以氯仿-甲醇（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干。噴上10%硫酸乙醇溶液，105 ℃高溫加熱至斑點顯色清晰，置于365 nm紫外光燈下觀察。供試品色譜圖中，與對照藥材色譜圖和對照品色譜圖對應的位置有同色熒光點，陰性樣品在防風對照藥材和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品相應位置上無斑點干擾，表明該方法專屬性良好。如圖3所示。

2.1.4 山銀花［8-9］ 取山銀花 15 g，研細，加入60 mL甲醇溶液，超聲15 min，過濾，將濾液蒸干，加入25 mL水使殘渣溶解，用水飽和正丁醇提取兩次，每次30 mL，將兩次正丁醇提取液合并，用氨水洗滌兩次，每次30 mL，將正丁醇溶液蒸干，使殘渣溶于2 mL甲醇溶液中，作為供試品溶液。同時取按處方配比制備的無山銀花的陰性樣品，采取同樣方法制備陰性對照溶液。此外，取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品，加乙醇制成濃度為1 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各 5 μL，分別置于同一硅膠 G 薄層板上，展開劑采用氯仿-甲醇-水（6∶4∶1），展開，取出，晾干，噴上10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至出現(xiàn)清晰的斑點顏色，在日光下觀看。供試品色譜圖中，與對照品色譜圖對應的位置有同色熒光點。陰性樣品在與灰氈毛忍冬皂苷乙相應色譜位置無干擾，表明該方法專屬性良好。如圖4所示。

2.2 含量測定［10-13］

2.2.1 色譜條件 以氨基鍵合硅膠為填料；使用乙腈-異丙醇和3%磷酸溶液（異丙醇-3%磷酸溶液 （5∶15）（88∶12） 作為流動相；檢測波長為203 nm。按苦參堿峰計算理論板數(shù)應不低于3000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取適量苦參堿對照品，加入流動相配成濃度為50μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 在裝量差異項下稱取適量本品，研細，經(jīng)精密稱量，取約5g，置于錐形瓶中，精密加入25 mL三氯甲烷-甲醇-濃氨溶液（50∶50∶1）的混合溶液，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率35 Khz）20 min，冷卻后再次稱重，減失的重量用三氯甲烷-甲醇-濃氨溶液（50∶50∶1）的混合溶液補足，搖勻后濾過。精密量取10 mL續(xù)濾液，加入中性氧化鋁色譜柱（100-200目，5 g，內(nèi)徑1.0 cm）中，先用40 mL氯仿洗脫，再用30 mL氯仿-甲醇（7∶3）混合液洗脫（流速為30滴/min），將洗脫液進行合并，并回收溶液至干，殘渣中加入適量流動相使其溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加入流動相至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例，取除苦參以外的其他處方量藥材，按處方制備方法制備不含苦參的陰性對照樣品，并按“2.2.3”項下相同方法制備陰性對照溶液

2.2.5 系統(tǒng)適用性 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，按“2.2.1”的項下色譜條件進樣。結果表明，在供試品的色譜圖中，在對照品色譜圖中相應位置有相應的色譜峰，陰性樣品在苦參堿峰相應位置無干擾，分離度及理論板數(shù)均符合要求。色譜圖如圖5～7所示。

2.2.6 線性關系 取苦參堿對照品適量，精密稱定，22.29 mg于50 mL 容量瓶中，加入流動相至相應刻度，用移液管精密量取5 mL于10 mL 容量瓶中，然后從10 mL 容量瓶中精密量取5 mL，放入10 mL 容量瓶中，加流動相定容至刻度，依次制成6個不同濃度的對照品溶液，進樣量為10 μL。以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制關系曲線，回歸方程為：Y=2.0270×106 A- 2843.7361，相關系數(shù)r=0.9999.結果表明苦參堿在0.137501～4.400046 μg范圍內(nèi)濃度與吸收峰面積值呈良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣5次測定苦參堿峰面積，RSD值為1.0%，結果顯示儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下的供試品溶液，按含量測定方法進樣后每隔5 h進樣1次，連續(xù)進樣9次，測定峰面積。結果苦參堿含量相對標準偏差（RSD）為3.3%，苦參堿隨時間增加峰面積有增大趨勢，40 h內(nèi)總體穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復性試驗 取批號為210509的樣品，照“2.2.3”項下所述方法處理，平行制備6份，所得溶液依“2.2.1”項下色譜條件測定，計算含量。結果苦參堿的平均含量為0.2430 mg·g-1（RSD值為1.5%，n=6），表明重復性結果良好。

2.2.10 回收率試驗 精密取“2.2.2”項下制備的對照品溶液（濃度為0.055 mg·mL-1）1.50 mL，分別置6個容器中，使干。精密稱取本品適量，各按2.2.3項方法制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件測定含量，并計算回收率。平均回收率為100.07%，RSD值為2.2%。結果見表1。

2.2.11 耐用性試驗 取本品含量測定項下的對照品溶液與供試品溶液，分別以色譜柱①Thermo APS-2 HYPERSIL、②Phenomenex Luna NH2 100A、③MEDJEN Magasil NH2分別進行分析測定，結果顯示分離度均大于1.5，含量結果RSD為4.7%，耐用性良好。

2.2.12 樣品含量測定 按“2.2.1”項下方法，對生產(chǎn)企業(yè)提供的15批樣品進行苦參堿含量測定，15批產(chǎn)品含量均值為：0.1996 mg·g-1，3.99 mg/袋。結果見表2。

3 討論

3.1 薄層鑒別 鹽酸小檗堿的原質量標準方法可行，陰性樣品無干擾，后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，赤芍鑒別的供試品溶液中也可檢出鹽酸小檗堿，可與赤芍鑒別共用供試品溶液。金銀花與山銀花功效相近、成分相似，均具有抗菌、抗炎、抗病毒等作用；有研究［14-15］表明山銀花中綠原酸含量遠高于金銀花，而有機酸與金銀花和山銀花的抗菌、清熱解毒作用有關，山銀花的水提物具有抗病毒的作用。由于二者成分相近且在價格上相差較大，故現(xiàn)企業(yè)根據(jù)實際情況確定了現(xiàn)處方投料為“山銀花”。

3.2 含量測定 原質量標準中含量測定下指標“綠原酸”成分不穩(wěn)定，且專屬性不強，無法對產(chǎn)品進行質量控制，故將之刪去。從品種處方看，苦參為方中君藥，苦參堿為目前公認的苦參藥材活性成分，有免疫調節(jié)、抗病毒及抗腫瘤等作用。故建立以“苦參堿”為對照的含量測定方法對品種進行含量控制。

3.3 色譜條件選擇

3.3.1 提取方法的選擇 在預實驗實驗中，通過甲醇超聲處理、氯仿超聲處理，加水溶解后用三氯甲烷振搖提取、三氯甲烷超聲處理后濾液過中性氧化鋁柱，4種方法進行比較。甲醇超聲獲得的供試品溶液，色譜分離未見苦參堿色譜峰；樣品經(jīng)水溶解繼用三氯甲烷萃取的供試品，在萃取過程中乳化現(xiàn)象嚴重，苦參堿色譜峰位置處有雜峰干擾且含量低；經(jīng)三氯甲烷超聲的兩個供試品制備方法均可分離得到苦參堿，單位質量內(nèi)過中性氧化鋁柱制備的供試品溶液含量遠高于單用三氯甲烷液超聲處理的供試品溶液。故選用“2.2.3”項下方法制備供試品溶液。

3.3.2 流動相的選擇 試驗分別使用了C18柱、氨基柱；以液相系統(tǒng)①乙腈-0.1%磷酸溶液；②甲醇-乙腈-三乙胺-磷酸鹽緩沖液（10∶17∶0.1∶73）；③甲醇-磷酸鹽緩沖液溶液（7∶93）；④乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫銨（33∶67）；⑤乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10）；⑥乙腈-異丙醇-3%磷酸溶液（80∶5∶15），進行分離樣品中的苦參堿。結果表明，分離系統(tǒng)⑥乙腈-異丙醇-3%磷酸溶液（80∶5∶15）可以使樣品中的苦參堿獲得良好分離，故選擇此流動相作為分離系統(tǒng)；試驗中DAD檢測器200～400 nm波長掃描，苦參堿最大吸收波長203 nm。

[LL]

4 結論

鹽酸小檗堿及赤芍的原質量標準方法可行。原標準處方投料為“金銀花”，現(xiàn)企業(yè)根據(jù)實際情況確定了現(xiàn)處方投料為“山銀花”；所以用山銀花的專屬性成分灰氈毛忍冬皂苷乙做為鑒別點。通過本實驗建立的銀屑靈顆粒的薄層色譜法操作便捷，斑點清晰，專屬性強。高效液相色譜法中選用最大吸收波長203 nm，選用最佳分離系統(tǒng)乙腈-異丙醇-3%磷酸溶液（80∶5∶15）。試驗結果表明該方法穩(wěn)定、可靠，可作為銀屑靈顆粒的質量控制標準。

參考文獻

［1］李志鋒，李立紅，李小靜.針藥合用對紅皮病型銀屑病患者外周血中T淋巴細胞亞群及TH1/TH2影響與免疫學機理分析［J］.四川中醫(yī)，2018，36（6）：173-175.

［2］張曉彤，高云逸，宋坪.尋常型銀屑病中醫(yī)辨證特點概況及思考［J］.中醫(yī)雜志，2019，60（20）：1732-1736.

［3］謝揚，向陽.中醫(yī)動態(tài)思想防治尋常型銀屑病的探討［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2020，41（6）：11-13.

［4］談依菱.基于數(shù)據(jù)挖掘研究當代名老中醫(yī)治療銀屑病方藥證治規(guī)律［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2017.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：1618.

［6］譚紅聲.十味鵝黃顆粒質量控制研究［D］.南寧：廣西中醫(yī)藥大學，2019.

［7］張銳，馬天翔，顧志榮，等.消風止癢顆粒質量標準研究［J］.甘肅中醫(yī)藥大學學報，2021，38（6）：33-40.

［8］孫旭剛.金銀花及蓮花清瘟系列藥物中山銀花鑒別方法的研究［J］.臨床醫(yī)藥文獻雜志，2018，5（104）：181.

［9］筆雪艷，張清波，劉曉鳳，等.七種常用中藥制劑中金銀花與山銀花的應用初探［J］.藥物分析雜志，2010，30（11）：2208-2211.

［10］季雪，李憲剛，崔韶婧，等.HPLC法測定喘嗽寧片中苦參堿的含量［J］.藥物研究，2019，19（85）：152-155.

［11］楊健，郭書臺，李凡，等.婦炎寧栓質量標準研究［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2019，39（2）：104-107.

［12］李振興，單雪梅，袁萬瑞，等.HPLC測定十味苦硝熏洗散中苦參堿和氧化苦參堿的含量［J］.海峽藥學，2020，32（11）：58-61.

［13］趙麗艷，李明春，馬燕，等.清咽顆粒的HPLC指紋圖譜研究［J］.熱帶醫(yī)學雜志，2020，20（10）：1288-1291.

［14］肖美鳳，劉文龍，周晉，等.金銀花和山銀花研究現(xiàn)狀及質量控制的關鍵問題［J］.中草藥，2018，49（20）：4905-4911.

［15］張靜，許保海，潘旭.金銀花和山銀花的鑒別要點研究［J］.北京中醫(yī)藥，2019，38（1）：73-76.

（收稿日期：2022-09-30 編輯：陶希睿）