徐全飛 牛宇 潘保華 蒙秋霞 馮婉君 聶建軍

摘??? 要：為了充分利用和開發(fā)山西云丘山野生木耳種質(zhì)資源，以從山西云丘山的柳木上采集、分離、純化到的野生木耳菌株為供試材料（YM²27），對該菌株生物學(xué)特性進(jìn)行研究。以菌絲形態(tài)、生長勢、色澤、菌落形態(tài)和菌絲日平均生長速度為指標(biāo)，研究了不同碳源、氮源、無機(jī)鹽、pH和培養(yǎng)溫度對該野生木耳菌絲生長的影響。試驗結(jié)果表明：供試菌株YM²27最適宜菌絲生長的碳源是麥芽糖，最適氮源是蛋白胨和酵母粉，最適無機(jī)鹽是磷酸二氫鉀，最適宜 pH范圍在6.5～7.5之間，該野生木耳菌株菌絲在17～29 ℃之間均可快速生長，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時，菌絲濃密、潔白、長勢強(qiáng)、菌落完整、生長速度最快。木耳的種質(zhì)資源是育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，有效收集、評價、保護(hù)和利用種質(zhì)資源對山西省木耳產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

關(guān)鍵詞：野生木耳：碳源：氮源：無機(jī)鹽：培養(yǎng)條件

中圖分類號：S646.6???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.07.010

Study on Biological Characteristics of Wild Auricularia auricula Stains in Mount Yun， Shanxi Province

XU Quanfei1， NIU Yu1， PAN Baohua1， MENG Qiuxia2， FENG Wanjun1， NIE Jianjun1

（1. College of Agricultural Economics and Management， Shanxi Agricultural University， Taiyuan， Shanxi 030006，China; 2.College of Resources and Environment，Shanxi Agricultural University， Taiyuan， Shanxi 030031， China）

Abstract： In order to fully utilize and develop the wild Auricularia auricular germplasm resources in Mount Yun， Shanxi Province， this article used wild Auricularia auricular strain（YM²27） as the test material to study its biological characteristics，which was collected， isolated， and purified from willow trees in Mount Yun， Shanxi Province. The morphology， growth potential， color， and average daily growth rate of and the colony morphology were used as evaluation indexes to investigate the effects of different carbon source， nitrogen source， inorganic salt， pH and culture temperature on mycelial growth of the isolate on solid medium. The results showed that the optimal carbon source for mycelial growth of YM²27 was maltose ， the optimal nitrogen sources were peptone and yeast powder ， the optimal inorganic salt was potassium dihydrogen phosphate ， and the optimal pH was 6.5-7.5. While the mycelia of YM²27 could grow fast at the culture temperature of 17-29 ℃， they grew the fastest and were dense， white at 25 ℃， showing stronger growth potential and forming complete colony. Germplasm resource is the base of breeding. Therefore the collection， evaluation， protection and utilization of the germplasm resource is of great significance to the healthy development of the Auricularia auricular industry in Shanxi Province.

Key words： Wild Auricularia auricular; carbon resource; nitrogen resource; inorganic salt; culture conditions

黑木耳[Auricularia auricula（L.ex Hook.）Underw][1]，口感鮮美，質(zhì)地脆嫩，營養(yǎng)豐富，而且含有多糖、維生素K、纖維素酶、黑色素等活性成分，是一種重要的食藥用真菌[2]，也是我國主要栽培的食用菌之一[3]。山西省黑木耳主栽品種大多引自于東北[4]，實際生產(chǎn)中存在出芽不整齊、菌種轉(zhuǎn)接次數(shù)過多導(dǎo)致活性退化和栽培產(chǎn)量、品質(zhì)不穩(wěn)定等問題[5-6]。因此，充分發(fā)掘當(dāng)?shù)氐哪径吧Y源，可作為黑木耳種質(zhì)創(chuàng)制和品種選育的重要來源。目前，山西野生黑木耳開發(fā)利用相關(guān)研究主要集中在種質(zhì)資源的收集、鑒定和生物學(xué)試驗階段中[7]，還未見關(guān)于云丘山野生木耳馴化的相關(guān)報道。本研究于2021年7月下旬，從山西省臨汾市云丘山的柳樹倒木上采集到供試野生菌株，經(jīng)鑒定為黑木耳，該野生菌株子實體厚而富有彈性、膠質(zhì)、半透明，初期呈碗狀，后耳片伸展為耳狀或淺圓盤狀，紅褐色，背面絨毛較短且密集，干后棕褐色至黑色，質(zhì)地脆質(zhì)。該野生木耳菌株子實體性狀優(yōu)良，通過對該野生菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，旨在為該菌株馴化栽培、開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

木耳菌株采自于山西省臨汾市云丘山，采用組織分離法[2]獲得該菌株，轉(zhuǎn)接到PDA試管培養(yǎng)基上，進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得純菌株，再挑選菌絲潔白、長勢強(qiáng)、菌落邊緣整齊的菌株作為供試菌株，現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院食用菌實驗室，編號YM²27。

1.2 供試培養(yǎng)基配方

①組織分離培養(yǎng)基[馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉培養(yǎng)基（PDA）]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH值為7。

②菌種活化培養(yǎng)基[馬鈴薯綜合培養(yǎng)基（CPDA）]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O1.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

③供試碳源培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蛋白胨3 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL和供試碳源。供試碳源分別為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉和甘露醇，均為20 g，以空白碳源為對照。

④供試氮源培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O1.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL和供試氮源。供試氮源分別為蛋白胨、豆粉、酵母粉、麩皮、硝酸銨和尿素，均為2 g，以空白氮源為對照。

⑤供試無機(jī)鹽培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL和供試無機(jī)鹽。供試無機(jī)鹽分別為KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、NaCl和CuSO4，均為3 g，以空白無機(jī)鹽為對照。

⑥供試pH培養(yǎng)基：在超凈工作臺上用1.0 mol·L-1的HCL溶液和1.0 mol·L-1 NaOH的溶液調(diào)配PDA平板培養(yǎng)基的pH，分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。

1.3 試驗方法

1.3.1 活化供試菌株 從菌種保藏柜中取出供試菌株，常溫下放置14 h，在超凈工作臺上進(jìn)行無菌操作[8]，轉(zhuǎn)接到CPDA平皿培養(yǎng)基上，放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)1周[9]，作為供試菌株進(jìn)行以下試驗。

1.3.2 碳源、氮源、無機(jī)鹽、pH篩選試驗 在超凈工作臺上進(jìn)行無菌操作，在活化后的供試培養(yǎng)基上，挑選長勢一致的菌絲，用已滅菌的打孔器（直徑5 mm）取出，分別轉(zhuǎn)接到供試碳源、氮源、無機(jī)鹽和pH平板培養(yǎng)基中央，放置到25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)，2 d后菌絲萌發(fā)開始生長，按照十字劃線法用游標(biāo)卡尺測量并記錄菌落直徑，觀察記錄菌絲的形態(tài)、色澤、生長勢和菌落形態(tài)，每個處理重復(fù)3次，取數(shù)據(jù)的平均值。菌絲日均生長速度計算公式如下：

式中，R表示菌落直徑（mm）；D表示菌絲培養(yǎng)天數(shù)；V表示菌絲生長速度[10-11]。

1.3.3 生長溫度試驗 將供試菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基內(nèi)，分別置于9、13、17、21、25、29 ℃條件下避光培養(yǎng)，觀測記錄菌絲的生長速度、色澤、長勢和菌落形態(tài)，每個處理重復(fù)3次，取數(shù)據(jù)的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)處理采用Microsofe Excel 2007，相關(guān)分析使用 SPSS19.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對該菌株菌絲體生長的影響

由表1可知，以空白碳源為對照不同碳源對該野生木耳菌絲體形態(tài)、生長勢、平均日生長速度等均不同。從菌絲生長速度看，以蔗糖為碳源時菌絲生長速度最快，其次是麥芽糖培養(yǎng)基，經(jīng)方差分析可知，兩者差異不顯著，葡萄糖、果糖和乳糖培養(yǎng)基菌絲生長速度較快，它們之間差異不明顯，甘露醇培養(yǎng)基菌絲生長速度較慢，空白培養(yǎng)基絲生長速度最慢；在葡萄糖、麥芽糖培養(yǎng)基上菌絲體濃密，其次是蔗糖、乳糖培養(yǎng)基；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖培養(yǎng)基上菌絲體潔白，其次是果糖、乳糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基；在葡萄糖、麥芽糖和乳糖培養(yǎng)基菌絲體生長勢強(qiáng)，蔗糖培養(yǎng)基菌絲體生長勢一般，對照培養(yǎng)基菌絲體生長勢最弱，葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和對照培養(yǎng)基菌落邊緣整齊。綜合分析，該野生木耳菌株最佳碳源是麥芽糖，其次是葡萄糖。

2.2 不同氮源對該菌株菌絲體生長的影響

由表2可知，CK培養(yǎng)基上菌絲體稀疏、灰白色，生長勢弱、菌落邊緣不整齊，平均生長速度慢；其次是豆粉培養(yǎng)基，菌絲體濃密、潔白、長勢強(qiáng)、菌絲生長速度較快；麩皮培養(yǎng)基上，菌絲體密、乳白色、生長勢一般、菌落邊緣整齊、菌絲平均生長速度慢；硝酸銨培養(yǎng)基菌絲體稀疏、灰白、長勢弱、菌落邊緣不整齊、菌絲生長慢；尿素培養(yǎng)基只有少量菌絲萌發(fā)，后期不生長；蛋白胨、酵母粉培養(yǎng)基菌絲體致密、潔白、生長勢強(qiáng)、菌落邊緣整齊、平均生長速度快，兩者之間菌絲平均日生長速度經(jīng)方差分析差異不顯著。綜合評定，蛋白胨或酵母粉為該菌株的最佳氮源。2.3 不同無機(jī)鹽對該菌株菌絲體生長的影響

由表3可知，在以空白無機(jī)鹽對照，野生木耳菌株在不同無機(jī)鹽培養(yǎng)基上，菌絲體形態(tài)、色澤、生長勢、菌落邊緣形態(tài)，以及平均日生長速度都有所不同，磷酸二氫鉀培養(yǎng)基上菌絲體濃密、潔白、生長勢強(qiáng)、平均日生長速度最快（4.18 mm·d-1），其次是硫酸亞鐵上菌絲體長勢強(qiáng)、濃密、潔白、菌絲長速較快；在硫酸鎂和氯化鈉培養(yǎng)基上，菌絲體密、生長勢一般、菌絲長速較快；在硫酸銅培養(yǎng)基上只有少量萌發(fā)菌絲，后期不生長。綜合評定，該野生木耳菌株的最適宜無機(jī)鹽是磷酸二氫鉀，其次是硫酸亞鐵，硫酸銅不適宜作為該菌株的無機(jī)鹽進(jìn)行添加。

2.4不同pH對該菌株菌絲體生長的影響

由表4可知，野生木耳菌株在pH 5.0～8.5之間均能生長，在pH 6.5～7.5之間菌絲體潔白、生長勢強(qiáng)、菌絲平均日生長速度快，經(jīng)方差分析可知，其差異不顯著；其次pH為 6.0時，菌絲體密、潔白、生長勢一般，平均生長速度較快；當(dāng)培養(yǎng)基pH為8.5和5.0時，該野生木耳菌株菌絲體稀疏、色澤灰白、長勢弱，培養(yǎng)基pH為8.5菌絲生長速度最慢為2.45 mm·d-1。因此，該菌株最適宜pH范圍是6.5～7.5之間。

2.5 不同溫度對該菌株菌絲生長速度的影響

不同溫度處理該野生木耳菌絲平均生長速度不同，如圖1所示。該菌株菌絲在9～29 ℃之間均可生長，在9～17 ℃之間菌絲生長較為緩慢，在17～25 ℃之間菌絲快速生長，25 ℃時菌絲生長速度最快達(dá)4.73 mm·d-1，25～29 ℃時菌絲生長開始速度逐漸減慢，且菌絲長勢變?nèi)?。因此，該菌株菌絲最適宜生長溫度為25 ℃。

3 討論與結(jié)論

山西省呂梁山脈擁有豐富的野生木耳種質(zhì)資源，在夏、秋季節(jié)生長在櫟、槐、柳等多種闊葉樹腐木上，單生或群生，但是有關(guān)馴化利用的較少，實際生長中，引進(jìn)的菌種又存在諸多的弊端，有必要選擇性狀優(yōu)良的野生木耳菌株進(jìn)行馴化栽培研究，豐富木耳的育種材料。本研究以采自山西省臨汾市云丘山上的野生木耳菌株為材料，通過單因素試驗，確定了野生木耳菌株菌絲生長的最適碳源是麥芽糖，最適氮源是蛋白胨和酵母粉，最適無機(jī)鹽是磷酸二氫鉀。與其他研究結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，不同地域野生木耳菌株生物學(xué)特性存在一定差異。聶建軍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，褐黃木耳最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是酵母浸膏；張曉宇等[13]研究發(fā)現(xiàn)，脆木耳最佳碳源是麥芽糖，最佳氮源是牛肉粉；楊杰等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳菌株最佳碳源是甘露醇，最佳氮源是酵母粉。本研究中，硝酸銨不利于該菌株菌絲的生長。王敬等[15]研究表明，4個木耳屬野生菌株氮源利用最差的是硝酸銨，與本研究相符。試驗中尿素不適合作為該菌株的氮源，菌絲只萌發(fā)不生長，筆者研究姑射山毛木耳的試驗結(jié)果也表明，尿素對菌絲也有明顯的抑制生長作用，與本研究結(jié)論一致。不同木耳菌株的菌絲對不同營養(yǎng)吸收利用存在一定差異，這可能與菌株生長的氣候環(huán)境有關(guān)。因此，只有明確該野生木耳菌株的生物學(xué)特性，才有利于進(jìn)一步馴化研究。

在pH和溫度篩選試驗中，該菌株最適宜pH在6.5～7.5之間，pH為5.5～6.5之間培養(yǎng)的菌絲也可以較快的生長，pH為8.5時菌絲生長速度明顯減慢，說明該菌株耐酸不耐堿；該菌株最適宜生長溫度為25 ℃，菌絲在17～29 ℃之間均可快速生長，說明該菌株對溫度的適應(yīng)范圍較廣，是該菌株的一個優(yōu)良性狀，接下來應(yīng)進(jìn)一步研究該菌株子實體生長發(fā)育對溫度的要求。

本研究明確了該野生木耳菌株對碳源、氮源、無機(jī)鹽、pH和溫度的不同要求。該野生木耳菌株的最佳碳源是麥芽糖，最佳氮源是蛋白胨和酵母粉，最佳無機(jī)鹽是磷酸二氫鉀，最適宜pH為6.5～7.5，最適宜生長溫度為25 ℃。

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