高氧水和戊己丸對幽門螺桿菌的抑菌作用研究*

施 敏，劉富林，張叔琦，許文娟，夏旭婷，張 婷，李镕偉

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

幽門螺旋菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種微需氧細(xì)菌，主要形態(tài)為螺旋彎曲，多定植在人體胃黏膜上皮表面和黏液底層[1]。因高感染率、高危害性，Hp廣受臨床工作者及科研工作者的關(guān)注。Hp在全球均具有高感染率[2]，我國Hp的感染率為41.35%～72.30%[3]。Hp有較強(qiáng)致病性，與慢性胃炎、消化性潰瘍等一系列消化系統(tǒng)疾患的發(fā)生密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)Hp與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、糖尿病等疾病也有一定相關(guān)性[5-7]。目前西醫(yī)治療Hp感染存在耐藥性強(qiáng)、副作用明顯、患者依從性差等問題[8]，而中醫(yī)藥辨證治療Hp感染具有安全有效、可提高根除率等優(yōu)勢[9-10]。

高氧水是將無菌飲用水進(jìn)行光化學(xué)容氧所得。高氧水的氧分壓從21kPa升高至100～120kPa，氧含量從4.6%提高至14.6%，且常溫常壓下氧氣不易逸出[11]。基于高氧環(huán)境對微需氧菌和厭氧菌的抑制作用，有學(xué)者提出高氧水或許可替代抗生素，開辟厭氧/微需氧菌感染治療新途徑的猜想[12]。車?yán)俚萚13]將高氧水運(yùn)用于厭氧菌的抑制研究，結(jié)果顯示高氧水對異鏈球菌、中間普氏菌、黏性放線菌3種厭氧菌均具有抑菌作用。由此推測，高氧水對Hp亦應(yīng)具有抑菌作用。

戊己丸由黃連、吳茱萸和白芍組成，臨床研究發(fā)現(xiàn)超微戊己丸對Hp清除率為66.7%[14]。唐小梅等[15]運(yùn)用戊己丸水煎液對Hp進(jìn)行體外抑菌研究，結(jié)果顯示戊己丸對Hp具有抑制作用。戊己丸能顯著調(diào)節(jié)Hp感染胃炎小鼠胃內(nèi)微生物及酶活性.[16]?！豆沤皲涷烉B(yǎng)生必用方》的戊己丸是黃連、吳茱萸、白芍按照1∶1∶1的質(zhì)量配比[17]。2020年版《中華人民共和國藥典》所載戊己丸中黃連、吳茱萸、白芍的藥物質(zhì)量配比為6∶1∶6[18]。

本研究基于高氧水可破壞Hp的生存環(huán)境和戊己丸能抑制Hp生長的理論，運(yùn)用體外抑菌實驗論證高氧水抑制Hp的可行性，并比較古方戊己丸和藥典戊己丸在抑制Hp方面的優(yōu)劣，再選用效果更好的戊己丸以檢驗高氧水和戊己丸對Hp的抑制作用，旨在探索更安全、有效、廉價的治療Hp感染的手段。

1 材料

1.1 菌株、藥物 （1）細(xì)菌：H.pylori（批號：ATCC43504）購自廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC）。（2）藥物：黃連超微顆粒40 g（批號：20010）、吳茱萸超微顆粒15 g（批號：200779）、白芍超微顆粒40 g（批號：191014）均購自湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)張裕民主任藥師鑒定合格。阿莫西林鈉克拉維酸鉀粉針劑（0.6 g/劑，批號：H10910017）購自華北制藥有限公司。

1.2 試劑 胎牛血清（批號：10270106）、1640細(xì)胞培養(yǎng)基（批號：C1187500BT）均購自gibco公司；布氏瓊脂培養(yǎng)基（批號：HB0315）購自青島海博生物技術(shù)有限公司；無菌脫纖維綿羊血（批號：BJLY10031）購自南京便診生物科技有限公司；高氧水由浙江氧典飲品有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SC10633102401450。

1.3 主要儀器 MIS型高溫高壓滅菌鍋（施都凱儀器設(shè)備有限公司）；GNP-9270型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；TG16-WS型離心機(jī)（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；DK-98-IIA型水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）。

2 方法

2.1 各試劑對Hp的抑菌活性測定及比較

2.1.1 藥物制備 （1）古方戊己丸：取黃連、吳茱萸、白芍超微顆粒劑各10 g分別置于試管中加蒸餾水30 mL攪拌使之充分溶解，4 ℃，4 000 r/min離心10 min（離心半徑為8 cm）吸取上清液，混合置于1個大試管再按上述條件離心10 min，吸取離心后的上清液得到戊己丸藥液。（2）藥典戊己丸：取黃連30 g、吳茱萸5 g、白芍30 g超微顆粒劑，制備方法同古方戊己丸。（3）高氧戊己湯：于無菌環(huán)境下吸取制備好的古方戊己丸藥液5 mL，再吸取5 mL高氧水置于無菌試管中，得到10 mL高氧戊己湯。（4）抗生素藥液制備：吸取蒸餾水5 mL注入阿莫西林鈉克拉維酸鉀粉針劑瓶中，搖晃瓶身使之溶解，加入10 mL生理鹽水稀釋至每1 mL藥液含有阿莫西林10 μg的試劑。

2.1.2 布氏瓊脂培養(yǎng)皿制備 稱取布氏瓊脂培養(yǎng)基粉8.62 g置于椎型瓶中加入200 mL蒸餾水，加熱攪拌溶解后于120 ℃高壓滅菌15 min。取一個90 mL玻璃平皿，倒入約20 mL蒸餾，標(biāo)記液面水平。比照已經(jīng)標(biāo)記好的平皿，將加入無菌脫纖維綿羊血的布氏液體瓊脂倒入90 mL平皿，高度與標(biāo)記線平齊。待制備好的布氏瓊脂培養(yǎng)皿瓊脂凝固后，密封放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中鑒定培養(yǎng)24 h，無雜菌生長則為可用。

2.1.3 菌株成活及分裂培養(yǎng) 抽取菌株液0.5 mL注入于含有1640細(xì)胞培養(yǎng)基和滅活后胎牛血清的無菌真空采血管中，使試管內(nèi)形成微需氧環(huán)境，封口并貼標(biāo)簽。置于微需氧密封箱中，放入微需氧產(chǎn)氣袋后將微需氧密封箱加蓋密封，放入37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱48 h。采血管內(nèi)液體顏色變淡，采血管底部灰白色沉淀產(chǎn)生，且采血管內(nèi)液體變渾濁提示菌株成活。

2.1.4 Hp菌液的制備 將復(fù)活菌株的采血管放入離心機(jī)中，4 ℃，4 000 r/min離心10 min（離心半徑為8 cm），使Hp菌落置底，于無菌環(huán)境下吸取采血管底部含有Hp菌落的液體加入1640細(xì)胞培養(yǎng)基，再用0.5麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，使菌液濃度達(dá)到1.5×108個/mL。

2.1.5 抑菌圈實驗 （1）取滅菌后直徑為6 mm的圓形紙片，分別于戊己丸藥液、生理鹽水、抗生素藥液中浸濕后，于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中4 h制備成含相應(yīng)試劑的干燥藥敏紙片，高氧水紙片選擇含高氧水濕紙片。（2）將制備好的布氏瓊脂培養(yǎng)皿均勻分為A、B、C、D、E區(qū)，分別代表古方戊己丸、藥典戊己丸、高氧水、生理鹽水和抗生素藥液。（3）將Hp菌液0.1 mL均勻涂布在布氏瓊脂培養(yǎng)皿上，取制備好的藥敏紙片平貼于布氏瓊脂培養(yǎng)皿對應(yīng)的位置。（4）將貼好藥敏紙片的布氏瓊脂培養(yǎng)皿置于微需氧密封箱中，放入微需氧產(chǎn)氣袋后將微需氧密封箱加蓋密封，放入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后取出布氏瓊脂培養(yǎng)皿，觀察抑菌圈并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

2.2 各試劑對Hp的MIC及MBC測定 通過“2.1.5”中抑菌圈實驗結(jié)果選取抑菌效果更好的戊己丸，進(jìn)行對Hp的MIC及MBC測定。（1）取6×8的48孔一次性無菌細(xì)胞培養(yǎng)板，各行由上到下依次標(biāo)注為A、B、C、D，其中A、B、C分別代表戊己丸組、高氧戊己湯組、高氧水組；D行無指代，作為對照用。將每一列從左到右依此標(biāo)注為“1”“2”“3”“4”“5”“6”“7”“8”。（見圖1）

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)板

（2）向無菌48孔細(xì)胞培養(yǎng)板前3行和D1、D2各孔注入100 μL 1640細(xì)胞培養(yǎng)基。

（3）抽吸制備好的每1 mL含藥1 000 mg的戊己丸藥液，注入A1～A8孔中，使A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8各孔含戊己丸藥液質(zhì)量濃度應(yīng)依次為500.000 00、250.000 00、125.000 00、62.500 00、31.250 00、15.625 00、7.812 50、3.906 25 mg/mL。同樣方法在B行各孔中注入稀釋高氧戊己湯，在C行各孔中注入稀釋的高氧水。

（4）D3孔中注入100 μL每1 mL含藥1 000 mg的戊己丸藥液，D4孔中注入100 μL每1 mL含藥1 000 mg的高氧戊己湯藥液，D5孔中注入100 μL每1 mL含藥1 000 mg的高氧水。

（5）分別向細(xì)胞培養(yǎng)板前3行和D1、D2各孔注入10 μL胎牛血清和10 μL制備好的菌液。

（6）將48孔細(xì)胞培養(yǎng)板用封口膜封口，置于微需氧密封箱中，將微需氧密封箱放入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

（7）微需氧環(huán)境恒溫恒濕培養(yǎng)48 h后將48孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出，于燈下肉眼觀察，無菌落生成、無試劑變色或變渾濁者為該藥的MIC。

（8）運(yùn)用點(diǎn)試法測定各藥對Hp的MBC，于無菌環(huán)境下取制備好的90 mL含無菌脫纖維綿羊血的布氏瓊脂培養(yǎng)皿3個，將每個平均分為12個扇形區(qū)域，并用馬克筆依次標(biāo)記為A1、A2、A3······D5。（見圖2）

圖2 瓊脂培養(yǎng)皿

（9）將48孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔接種到劃分好的90 mL含無菌脫纖維綿羊血布氏瓊脂培養(yǎng)皿對應(yīng)的區(qū)域上，接種完畢后，置于微需氧密封箱中，放入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，取出觀察各區(qū)域是否有菌落生長，其中完全無菌落生長的最小濃度即為該藥的MBC。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件處理。計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示,滿足正態(tài)性和方差齊性的計量資料采用多樣本單因素方差分析，各組間兩兩比較使用LSD法；不符合正態(tài)性者采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 抑菌圈實驗（紙片瓊脂擴(kuò)散法）結(jié)果 高氧水、古方戊己丸、藥典戊己丸、抗生素的抑菌圈直徑均大于生理鹽水（P＜0.05或P＜0.01），且古方戊己丸的抑菌圈直徑大于藥典戊己丸（P＜0.01）。（見表1、圖3）

表1 各藥物抑菌圈直徑比較 （±s，mm）

表1 各藥物抑菌圈直徑比較 （±s，mm）

注：與生理鹽水比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與典戊己丸比較，cP＜0.01。

藥物n抑菌圈生理鹽水36.7±0.0藥典戊己丸316.5±0.8b古方戊己丸325.4±0.7ac高氧水312.2±0.8b抗生素314.5±0.4a F 332.572 P 0.000

圖3 紙片瓊脂擴(kuò)散法測定各試劑的抑菌圈

3.2 各藥物對Hp的MIC及MBC測定 燈下肉眼觀測各培養(yǎng)孔細(xì)菌的生長情況，A組和B組未見菌落生長的最后一個菌孔均為5號孔；C組未見菌落生長的最后一個菌孔為4號孔；D組為對照組，除2號孔外，其余菌孔均未見菌落生長。（見表2）

表2 肉眼觀測各孔Hp的生長情況

運(yùn)用點(diǎn)試法測定各培養(yǎng)孔細(xì)菌的存活性，A組和B組試劑未見菌落生長的最后一個菌孔均為4號孔；C組未見菌落生長的最后一個菌孔為2號孔；D組為對照組，除2號孔外，其余菌孔均未見菌落生長。（見表3）

表3 點(diǎn)試法測定各孔Hp的生長情況

對照組2發(fā)現(xiàn)菌落生長，對照組1、3、4、5未發(fā)現(xiàn)菌落成長。（見表4）

表4 各對照組Hp菌落的生長情況及意義

古方戊己丸對Hp的MIC為31.25 mg/mL，MBC為62.50 mg/mL；高氧水對Hp的MIC為62.50 mg/mL，MBC為250.00 mg/mL；高氧戊己湯MIC對Hp的為31.25 mg/mL，MBC為62.50 mg/mL。（見表5）

表5 各藥物組對Hp的MIC、MBC （mg/mL）

4 討論

Hp感染具有高感染率、高致病性特點(diǎn)，根除Hp已成為胃炎、消化性潰瘍、胃癌、消化不良等患病人群的首要治療方案。但抗Hp的臨床實踐存在Hp高耐藥性和徹底根除的矛盾性的問題。隨著Hp抑菌藥物的使用，關(guān)于Hp耐藥性的報道逐年增多。以克拉霉素為例，其在日本和意大利的耐藥比率高達(dá)30%，中國為50%，土耳其為40%，且其他抗生素也顯示出相似的趨勢[19-23]。臨床工作中，根除Hp存在矛盾和爭議。如肝腎功能不全或者對抗生素廣泛過敏的Hp感染者如何徹底根除Hp？此外，依從性較差的患者難以規(guī)范使用四聯(lián)療法，或者反復(fù)根除Hp后再感染，已經(jīng)形成明顯耐藥的Hp感染者，是否繼續(xù)使用四聯(lián)療法根除Hp？因此，開發(fā)出一種更安全有效的方法防治Hp感染已迫在眉睫。針對這一現(xiàn)實需求，本研究團(tuán)隊結(jié)合中醫(yī)藥特色，進(jìn)行了積極探索。

Hp感染在中醫(yī)學(xué)中沒有相對應(yīng)的病名，歷代醫(yī)家根據(jù)其臨床癥狀將其歸為“胃脘痛”“反酸”“嘈雜”“痞滿”等范疇。中醫(yī)證候主要以脾胃濕熱、肝胃不和及脾胃虛弱為主[24]。治療主要以清熱利濕、疏肝理氣、活血化瘀、清熱解毒、和胃止痛、健脾和胃、辛開苦降等立法[25]?！豆沤皲涷烉B(yǎng)生必用方》[26]記載戊己丸由黃連、吳茱萸、白芍按照1∶1∶1的質(zhì)量配比。方中黃連為君藥，清肝胃之熱；白芍為臣藥，和里止痛；吳茱萸為佐藥，其辛助開郁，其熱制黃連之苦寒。全方辛開苦降，肝胃同治，用以治療肝火犯胃、肝胃不和所致的胃脘灼熱疼痛、口苦嘈雜、嘔吐吞酸、腹痛泄瀉。

本研究的抑菌圈實驗發(fā)現(xiàn)《古今錄驗養(yǎng)生必用方》記載的戊己丸抑菌效果優(yōu)于藥典戊己丸，原因可能是古方戊己丸中黃連和吳茱萸以1∶1質(zhì)量配伍，平調(diào)寒熱，適用證型廣，而藥典戊己丸中黃連和吳茱萸以6∶1質(zhì)量配伍，方性寒重于溫，適用證型較為局限。

本研究通過抑菌圈實驗和各藥物對Hp的MIC及MBC測定發(fā)現(xiàn)高氧水對Hp有一定的抑菌活性，其作用機(jī)理可能與高氧水可以破壞Hp的微需氧生存環(huán)境有關(guān)。高氧水是食品級商品，對人體的毒副作用相對較小，暫未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于高氧水的過敏和不良反應(yīng)報道。因此，本研究論證的高氧水可抑制Hp假說具有臨床意義，使不服用藥物即可殺滅Hp成為可能，同時為肝腎功能不全的Hp患者、對抗生素過敏的Hp患者、不能耐受四聯(lián)療法的Hp患者、未見臨床癥狀的Hp感染者提供了安全可行的抗Hp手段。戊己丸水煎液對Hp也有抑殺作用，這與諸多學(xué)者的[14-16]研究結(jié)果一致，

實驗結(jié)果顯示高氧戊己湯對Hp的抑菌作用未明顯優(yōu)于戊己丸單獨(dú)使用，分析原因如下。其一，中藥在人體中對Hp的抑制作用有兩種方式：與Hp直接接觸抑殺細(xì)菌以及通過介導(dǎo)人體的免疫細(xì)胞抑殺細(xì)菌。本研究為體外抑菌，未在活體中進(jìn)行，故無法介導(dǎo)人體的免疫細(xì)胞，故未形成協(xié)同抑菌的結(jié)果。其二，高氧水與戊己丸1∶1質(zhì)量配比時，中藥藥液稀釋了高氧水，使高氧戊己湯每毫升含氧量不足以破壞Hp的生存環(huán)境，故高氧戊己湯對Hp的抑殺作用主要依靠藥液中的中藥成分。

后續(xù)研究將考慮中藥湯劑與高氧水配比，設(shè)置不同濃度中藥與高氧水配比的比較研究，尋找最強(qiáng)的抑菌配比，以此為后續(xù)的動物實驗及臨床研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

綜上所述，戊己丸和高氧水對Hp均有抑制作用，為中醫(yī)藥臨床防治Hp感染提供了防治思路和實驗依據(jù)。